Summary
Denne metode beskriver en kronisk forberedelse, der giver optisk adgang til hippocampus af levende mus. Denne forberedelse kan bruges til at udføre langsgående optisk billeddannelse af neuronal strukturel plasticitet og aktivitet-fremkaldt cellulær plasticitet over en periode på flere uger.
Abstract
To-foton mikroskopi er et grundlæggende redskab for neurovidenskab, da det tillader undersøgelse af hjernen af levende dyr på rumlige skalaer spænder fra subcellulære til netværk niveauer og på tidsmæssige skalaer fra millisekunder til uger. Desuden kan to-photon Imaging kombineres med en række adfærdsmæssige opgaver for at udforske årsagssammenhæng mellem hjernefunktion og adfærd. Men, i pattedyr, begrænset penetration og spredning af lys har begrænset to-photon intravital Imaging mest til overfladiske hjerneområder, således udelukker langsgående undersøgelse af dybe hjerneområder som hippocampus. Hippocampus er involveret i rumlig navigation og episodisk hukommelse og er en mangeårig model, der bruges til at studere cellulære såvel som kognitive processer, som er vigtige for indlæring og tilbagekaldelse, både i sundhed og sygdom. Her er et præparat, der giver mulighed for kronisk optisk adgang til dorsale hippocampus i levende mus, detaljeret. Denne forberedelse kan kombineres med to-foton optisk billeddannelse ved cellulære og subcellulære opløsning i hoved fast, bedøvet levende mus over flere uger. Disse teknikker muliggør gentagen billeddannelse af neuronal struktur eller aktivitet-fremkaldt plasticitet i titusinder til hundredvis af neuroner i dorsale hippocampus Carnot. Desuden kan denne kroniske præparat anvendes i kombination med andre teknikker såsom mikro-endoskopi, hoved-monteret bred felt mikroskopi eller tre-photon mikroskopi, således i høj grad udvide værktøjskassen til at studere cellulære og netværksprocesser involveret i indlæring og hukommelse.
Introduction
I pattedyr er hippocampus en vigtig hjerneregion for kodning og tilbagekaldelse af episodiske minder samt for rumlig navigation1,2,3,4. Af denne grund, hippocampus har været-og stadig er-en meget vigtig model til at studere de grundlæggende mekanismer, der gør det muligt for hjernen at indkode og huske erindringer5,6,7 eller til at navigere i et miljø8 ,9 indsamle belønninger og undgå farer. Desuden er den hippocampale dannelse en af de hjerneregioner, hvor nye neuroner genereres i hele livet af gnavere10,11 og muligvis af mennesker12,13. Endelig er degeneration eller svækkelse af hippocampus dannelse forbundet med neurologiske og psykiske lidelser, herunder Alzheimers sygdom14.
I mus ligger hippocampus ca. 1 mm under hjerne overfladen15. Dens position har forhindret optisk adgang i den intakte hjerne, og derfor har langsgående studier af hippocampus dynamik hovedsagelig været baseret på magnetisk resonans (MR) Imaging, Elektrofysiologi og ex vivo billeddannelse analyser. MR Imaging metoder tillader sporing af biologiske processer (f. eks, genekspression ændringer16) i det samme dyr over flere dage, men mangler den rumlige opløsning til at diskriminere enkelt neuroner. Klassiske in vivo elektrofysiologiske teknikker tilbyder meget høj tidsmæssig opløsning og udsøgt følsomhed over for ændringer i membranpotentialet. Men de har en begrænset geografisk opløsning, og de mangler evnen til pålideligt at spore de samme celler over længere tidsperioder. Optisk billeddannelse gør det muligt at undersøgt mere forskelligartede processer i kraft af dens høje tidsmæssige og rumlige opløsninger. Men ex vivo Imaging giver kun snapshots af igangværende processer, og det er derfor ikke egnet til langsgående undersøgelser, hvor dyrene lærer og husker oplysninger.
In vivo optisk billeddannelse kombinerer nogle fordele ved MR Imaging og Elektrofysiologi med dem af optisk billeddannelse. Derfor er det meget velegnet til langsgående og korrelative analyser af muse hjernens dynamik og opførsel. Dette er relevant i undersøgelser af biologiske processer med meget hurtig (millisekunder til sekunder) eller meget langsom (dage til uger) tidsskalaer. Eksempler på sådanne processer, der er relevante for neurovidenskab er membranspænding dynamik, ca2 + transienter, cellulære plasticitet og strukturelle ændringer, som alle menes at være meget vigtigt for hukommelse dannelse og tilbagekaldelse. Forskellige metoder har udvidet in vivo Imaging til dorsale hippocampus18,19,20,21,22. Akutte præparater har gjort det muligt at spore pyramide neuron (PN) aktivitet samt deres dendritter og dendritiske spines i flere timer20,22. Denne tidsmæssige tidsramme tillader imidlertid ikke langsigtede strukturelle ændringer, som kan ligge til grund for en trinvis læring, der skal undersøgt. Kroniske præparater-i kombination med mikro-endoskoper23,24 eller med lang arbejdsdistance (WD) standard mikroskop mål21 -har muliggjort gentagen billeddannelse af dorsale hippocampus over flere Uger.
Her beskriver vi en kronisk forberedelse, der giver recidiverende optisk adgang til det under felt i CARNET'S dorsale hippocampus af levende mus ved hjælp af en permanent indsat billed kanyle. Dette præparat giver mulighed for gentagen adgang til CAREJEN uden funktionel forstyrrelse og er egnet til intravital to-foton (2P) eller bred-felt epifluorescens Imaging. To eksempler på 2P dyb hjerne kronisk billeddannelse i rygmarven af levende mus er detaljeret: langsgående billeddannelse af dendritiske struktur og dendritiske rygsøjlen dynamik og langsgående billeddannelse af aktivitet-fremkaldt plasticitet. De vigtigste fordele og begrænsninger af teknikken diskuteres.
Protocol
Alle de beskrevne metoder er blevet godkendt af regeringen i øvre Bayern (licens 2016_ROB-55.2 vet-2532. Vet_02-16-48) og af Stanford og Max Planck Florida Institute for Neuroscience administrative paneler på laboratoriet dyrepleje.
1. klargøring af billed kanyle
- Hold en præcisions øvelse på en borestander, der følger med en bevægelig lineal tabel.
- Klemme en 3,0 mm diameter rustfrit stålrør på den bevægelige lineal bord.
- Skær røret til en 1,6 mm lang metalring. Hvis kanterne af ringen ikke er sløv efter opskæring, fil ud uregelmæssigheder.
- Skyl metalringen og en cirkulær 4 mm-diameter glas dækseddel i 100% acetone og lad det tørre for ≈ 5 min.
- Placer metalringen og glas coveret på et jævnt, jævnt og rent arbejdssted under stereoskopi.
- Anbring en dråbe UV-hærdende optisk klæbemiddel på en glat overflade, såsom en Petri skål. Brug en nål eller en spatel til at sprede klæbemidlet til dannelse af et tyndt (< 0,5 mm) lag.
- Brug pincet til at dyppe den ene side af metalringen ind i klæbemidlet. Vær særlig opmærksom på ikke at forsegle indersiden af ringen. Hvis dette sker, skal du bruge en nål til at bryde det optiske klæbemiddel i ringen.
- Ved hjælp af Stereoskopet, Placer metalringen i midten af glas coveret med den side af ringen, som er dækket af klæbemiddel, som rører dæksedlen. En tynd ring af klæbemiddel skal dannes ved grænsefladen mellem metalringen og dæksedlen. Undgå klæbemiddel, som spreder sig til midten af dæksedlen.
- Tænd for den UV-hærdende LED-driver enhed og Shine Light (365 nm) i 1 min.
Forsigtig: UV-lys provokerer forbrændinger af huden og er et mutagent middel. Bær UV-beskyttende briller og dække hænder og arme med handsker og en lab-coat for at undgå hudeksponering. - For at helbrede klæbemidlet jævnt, skal du sørge for, at alle sider af ringen er lige belyst ved at ændre retningen af lyskilden.
- Lad klæbemidlet hærde i mindst 2 h, helst, natten over.
- Hold kanylen fast i den åbne ende af metalringen ved hjælp af en hemostat. Ved hjælp af en tand boremaskine udstyret med en roterende fil og arbejder under Stereoskopet, fil off den overskydende glas dækglas indtil Skyl med siderne af ringen (figur 1a).
2. implantation af billed kanyle over dorsale hippocampus
- Klargøring af udstyr og opsætning
- Sørg for, at alle kirurgiske instrumenter er rene og sterile. Hvis du bruger en glasperle sterilisator til sterilisering, skal du rengøre instrumenterne og anbringe dem i sterilisatoren (sat til 250 °C) i 10 minutter før brug. Alternativt kan du autoklave instrumenterne før brug.
- Forbered alle materialer, der kræves til operationen, samt kirurgiske instrumenter, så de kan nås let.
- Sørg for, at der er nok frisk tilberedt medicin som smertestillende eller anti-inflammatoriske lægemidler.
- Sørg for, at der er tilstrækkelig isofluran i hele Operations perioden (ca. 1 time pr . operation).
- Tænd for varmetæppet og sæt det til 37 °C for at holde dyrenes temperatur stabil under anæstesi.
- Sørg for, at skylle systemet for isofluran fungerer.
- Åbn ventilen af ilt flow.
- Anæstesi induktion, og dyre fiksering
- Placer musen i anæstesi induktions kammeret ved 3% isofluran i 1 L/min O2 og vente, indtil det mister bevidstheden. Vurder anæstesi ved hjælp af tåen knivspids refleks test.
- Veje dyret.
- Påfør anti-inflammatorisk (meloxicam, 1mg/kg) og smertestillende medicin (Vetalgin, 200mg/kg) lægemidler subkutant.
- Placer musen på varmetæppet. Sørg for, at dyret ikke er i direkte kontakt med varmetæppet for at undgå termiske forbrændinger.
- Fastgør hovedet til det stereotaktiske apparat og Placer næse keglen til at dække snude. For at opretholde anæstesi, nedsætte isofluran til 1,5-2%. Under hele operationen, Monitor mus tilstand ved visuelt at overvåge vejrtrækning og ved at teste tå knivspids refleks. Om nødvendigt regulere isoflane procent.
- Anvend oftalmisk salve til øjnene for at forhindre dehydrering og potentiel blindhed.
Bemærk: for anæstesi og dyre medicin, alternative metoder og lægemidler er mulige. Venligst, se din dyre licens og den relative litteratur.
- Optisk kanyle implantation
- Tænd for fiberoptisk lyskilde.
- Fjern håret og Desinficer huden over muse hovedet.
- Brug saks og pincet, Fjern musens hovedbund. Begynd med at lave et lille snit i hovedbunden i en position tæt på lambda. Fortsæt ved at åbne hovedbunden på de to sider. Først bevæge sig sideværts i retning af ører, derefter rostrally, i retning af øjet kredser, at danne en trekant på sagittale aksen, ca 4 mm rostral Columns til bregma. Vær opmærksom på ikke at skære for tæt på ører og øjne, men udsætte bregma og lambda, samt parietal knogler og den bageste halvdel af frontal knogler.
- Påfør en dråbe (≈ 10 mg) lidocain (28,9% v/v i alkohol) til kraniet.
- Ryd periosteum og tør kraniet ved hjælp af en vatpind.
- Placer ørepuderne, for at fastgøre muse hovedet.
- Lav en lille kraniotomi, ved hjælp af en mikro-boremaskine med en 0,5 mm bredde Burr. Placer hullet i den forreste knogle modsat den afbildet hippocampus, ca. 1,5 mm fra sagittale sutur og 2 mm fjernt fra den koronale sutur.
- Skru en 0,86 mm-bredde rustfrit stål knogle skrue ind i kraniet hul.
- Rengør om nødvendigt snavs og tør kraniet.
- Fremstilling af en blanding af hurtig klæbende cement
- Ved hjælp af en lille ske (≈ 4,5 mm diameter), dispensere 1-1.5 niveau Scoops af L-pulver i en blanding godt.
- Dispensere 3-4 dråber hurtig base i brønden.
- Dispensere 1 dråbe Universal katalysator i brønden.
- Omrør blandingen for 5-10 s ved hjælp af en præcisions applikator.
Bemærk: alternative cement er tilgængelige. Se producentens anvisninger.
- Brug præcisions applikatorer til at påføre hurtig klæbende cement over kraniet, skruen og den omgivende hud. Lad det tørre i 30 s til 1 min.
- Brug en 3,0 mm diameter trephin bore til at lave en kraniotomi i parietal knogle. Placer hullet ca. 1,5 mm fra den sagittale sutur og 2 mm væk fra lambdoid suturen.
- Fjern forsigtigt knogle klappen.
- Kontroller størrelsen af kraniotomi ved hjælp af kanyle for at sikre, at det passer. Brug en mikro-bore 0,5 mm eller 0,9 mm bredde til at forstørre kraniotomi, hvis det er nødvendigt.
- Fjern meninges ved hjælp af Dumont pincet.
- Ablate kortikale stof, at nå den eksterne kapsel. Brug en 0,9 mm diameter (19 gauge) stump nål forbundet til en vakuumpumpe. Skyl med saltvand for at undgå dehydrering af det eksponerede væv og for at vaske det resterende blod væk, når blødningen er løst. Suge kortikale væv langsomt, ≈ 50-100 μm ad gangen, indtil cortex løsnes fra kapslen, udsætter fibrene af cingulum eller Corpus callosum. Skift ofte nålen for at forhindre tilstopning.
- Fibrene strækker sig hovedsageligt i tre retninger (figur 1b). Skræl forsigtigt rygfibrene, indtil de dybeste fibre (alveus af hippocampus) er eksponeret.
- Skyl vævet med saltvand. Brug tynde pincet til at dyppe den nederste kanyle i saltvand og Placer den over kraniet hullet. Kanyle og væv skal forsegles ved saltvand for at undgå diffusering af luftbobler mellem kanylen og vævet.
- Skub kanylen ind i kraniet (figur 1c), indtil glas dæksedlen er i kontakt med fibrene.
- Tør kraniet godt ved hjælp af absorptions trekanter, vatpinde og/eller vakuumpumpen.
- Frem stilling af en blanding af hurtig klæbende cement (Se trin 2.3.10).
- Brug præcisions applikatorer til at påføre hurtig klæbende cement over kraniet. Påfør klæbemiddel også på kanten af kanyle. Pas på ikke at lade klæbemidlet løbe ind i kanylen. Lad det tørre i 30 s til 1 min.
- Brug en stereotaxisk arm til at placere en hoved holder plade over kanyle, i kontakt med kraniet.
- Fremstilling af en blanding af dental akryl
- Brug en ske (≈ 9 mm diameter), dispensere 1 niveau scoop (1 del) af pulveret i en blanding godt.
- Dispensere 2-3 dele af væsken i samme brønd. Dæk hele pulveret med væsken.
- Rør for ≈ 1 min ved hjælp af en spatel.
Bemærk: alternative akryl er tilgængelige. Se producentens anvisninger.
- Brug en spatel eller en præcisions applikator til at påføre akryl på tværs af kranium. Dække hele udsatte kraniet, skruen og den åbne hud med Dental akryl. Dette gør præparatet stabilt. Lad ikke akryl køre ned halsen, ører og øjne.
- Lad akryl tørre og hærde i ca. 15 min.
- Påfør en aftagelig Klæbefolie på hoved holderen pladen for at forhindre snavs i at trænge ind i kanyle. Det anbefales, at filmens størrelse svarer til pladens.
- Sluk isofluran flow, Fjern dyret fra Stereotaktisk apparat og Placer det på en varmeplade for at opretholde fysiologisk kropstemperatur, mens det vågner fra anæstesi.
- Hold øje med dyret, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystbenet recumbency.
- Det dyr, som er blevet opereret af andre dyr, må kun returneres, når det er fuldt tilbagebetalt.
3. postoperative pleje
- Kontroller status for musen i 2 dage efter operationen, ved at overvåge vægten og generelle adfærd.
- Påfør anti-inflammatorisk (meloxicam, 1mg/kg) og smertestillende medicin (Vetalgin, 200mg/kg) lægemidler subkutant i 2 dage efter operationen
Bemærk: alternative overvågningsprocedurer, lægemidler og doseringer er mulige for postoperative pleje. Venligst, se din dyre licens og den relative litteratur.
4. forberedelse af billedbehandlings sessionen
- Tænd for Imaging setup på forhånd og lad laseren til at varme op og stabilisere, hvis det er nødvendigt.
- Anæstetisere musen (Se trin 2.2.1).
- Brug pincet til forsigtigt at fjerne den selvklæbende folie fra hoved holder pladen. Hold musen i en hånd og hoved holderen plade med fingrene. Fjern filmen forsigtigt, for at undgå at beskadige præparatet.
- Placer musen under mikroskop, over varmetæppet og fastgør hovedpladen til holderen (figur 1d).
- Anbring næse keglen for at dække snude og nedsætte isofluran til 1,5-2%.
- Anvend oftalmisk salve til musens øjne.
- Rengør billed kanylen ved skylning med deioniseret vand. Brug en sprøjte og en tynd nål til at droppe vand i kanylen og en vakuumpumpe for at fjerne den.
5. Imaging session
- Brug lav forstørrelse, lang arbejdsdistance mål for visuelt at kontrollere kanylen for restvand, snavs, integritet og tilstedeværelsen af fluorescens.
- Juster kanylen til den optiske akse ved at justere vinklerne på hoved holder armene.
- Skift til 25X 1,0 NA, 4 mm WD eller 40X 0,8 NA, 3 mm WD, vand nedsænkning mål. Tilsæt tilstrækkeligt deioniseret vand til at fylde kanylen og opretholde overskydende vand oven på kanylen. Undgå dannelse af luftbobler.
- Brug 2P excitation og billede fluorescerende signaler.
Bemærk: billedbehandlings protokollen er meget afhængig af den tid og de rumlige skalaer, der skal afbildes. Der henvises til afsnittene repræsentative resultater og diskussion for detaljer om de Imaging indstillinger, vi har brugt til at producere de billeder, der er vist i denne artikel.
Representative Results
Da kanylen er placeret kun dorsale til a-i, er rygningen aspekt af Carnot mere proksimalt til mikroskop, hvis sammenlignet med ventrale én. Alveus er den mest proksimale struktur efterfulgt af stratum Oriens (so), stratum pyramidale (SP), stratum radiatum (SR) og stratum lacunosum moleulare (SLM), det mest distale lag (figur 1b , C). Longitudinel 2P Imaging af neuronal struktur med subcellulære opløsning og af aktivitet-fremkaldt plasticitet med cellulære opløsning er præsenteret som repræsentative resultater. For at begejstre fluorophorerne grønne fluorescerende protein (gfp), d2Venus og TurboFP635, en at pulserende ti: safir laser tunet til 920 nm anvendes, og den gennemsnitlige laser effekt justeres til 5-25 MW ved prøven. De forskellige emissions bølgelængder adskilles ved hjælp af emissions filtre og forskellige Photomultiplier-rør.
Langsgående billeddannelse af dendritiske struktur og dendritiske spines dynamik.
Til tyndt label hippocampus PNs og visualisere deres struktur, en Thy1-GFP transgene Mouse line (M linje) anvendes. Thy1-GFP-mus udtrykker cytoplasmisk forbedret GFP under kontrol af Thy1 promotoren i en sparsom, tilfældig population af PNS25. Generelt er den største akse i CARPNS, omtrent vinkelret på XY-billedbehandlings planet (figur1b, fig. 2a og supplerende film 1). Basal dendritter strækker sig i så, fra Soma til kanyle, hvorimod apiske og apiske Tuft dendritter strækker sig fikseres til kanylen i modsat retning (supplerende film 1). Da præparatet efterlader de dybeste fibre af alveus intakt, skal et par fluorescerende fibre, der krydser synsfeltet, lige under kanylen, være synlige (figur 2a og film 1). Præparatet giver mulighed for billeddannelse af PN dendritter med rygsøjle opløsning (figur 2 A-C). Til billede dendritter og dendritiske spines, en 25X 1,0 NA, 4 mm WD, vand nedsænkning kommerciel objektiv linse anvendes.
For langsgående tracking, er flere hjerneområder inden for synsfeltet af kanylen defineret under den første Imaging session. Hver region svarer til et areal på ca. 240 x 240 μm og indeholder mellem 1 og 7 dendritiske segmenter (figur 2b). Disse områder tilknyttes manuelt en tredimensionel stak med lav forstørrelse, der viser mønsteret for GFP-udtryk i lydstyrken under billed kanyle (figur 2a). Derefter anskaffes 1 μm z-trins-billedstakke af CARMI PN basal dendritter med forskellige tidsintervaller (fra 24 timer til 3 dage) i op til 14 dage (figur 2c). Længerevarende billedbehandlings varigheder og intervaller er mulige26. Hver billedbehandlings session varer ca. 60 til 90 min. Selv om de fleste billeder er af dendritiske spines i så, er det også muligt at afbilde dendritiske spines i skrå dendritter SR (tal 2D-F). Ud over rygsøjlen tæthed, denne metode gør det muligt at studere rygsøjlen dynamik ved at kvantificere deres overlevelse, gevinst og tab satser26,27,28,29,30, 31 , 32. for at score og spore dendritiske spines over tid (figur 2c) anvendes en brugerdefineret MATLAB-grænseflade. Dette gør det muligt at tilpasse de billedstakke, som er erhvervet på forskellige tidspunkter, og understøtter manuel mærkning af dendritter og spines, mens de sporer dendritiske længder og rygsøjlen positioner over tid26. Vigtigere, denne metode kan bruges til at skelne (pr. hvert tidspunkt, undtagen den første) mellem præ-eksisterende og nyfødte dendritiske spines. Dette er vigtigt, da de forskellige klasser af dendritiske spines menes at have forskellige roller i hukommelsen erhvervelse og fastholdelse33.
Langsgående billeddannelse af aktivitet-fremkaldt plasticitet.
Til billed aktivitet-fremkaldt plasticitet i CARPNS, indsprøjtes dorsale cartinas hippocampus område med en viral vektor, der udtrykker grøn fluorescerende destabiliseret d2Venus via en forbedret form af den synaptiske aktivitet-lydhør element (E-SARE) inden for Arc Enhancer/promotor og Red fluorescerende TurboFP635 via Epgk Promoter34. Dette giver mulighed for billeddannelse niveauer af aktivitet-fremkaldt plasticitet af hundredvis af CARPNS i hvert dyr35. I betragtning af den meget tætte mærkning af PNs, er det generelt ikke muligt at løse dendritter af CARPNS (supplerende film 2).
For at afbilde somata af CARPNS, en 40X 0,8 NA, 3 mm WD, anvendes vand nedsænkning objektiv linse. Til langsgående sporing defineres 1 til 9 hjerneområder pr . mus under den første billedbehandlings session. Hver region svarer til et areal på ca. 300 x 300 μm og indeholder mellem 50 og 150 celler (figur 3a). Disse regioner er manuelt knyttet til lokale vævs landemærker synlige ved en lavere forstørrelse. Derefter erhverves 3 μm z-trins billedstakke, som omfatter SP af CARPNS (figur 3a og supplerende film 2) med forskellige tidsintervaller (fra 24 timer til 6 dage) i op til ca. 30 dage. Hver billedbehandlings session varer ca. 60 til 90 min. E-SARE aktiverings toppe 6 til 8 timer efter en udsættelse for et nyt eller beriget miljø (EE, figur 3b) og henfalder i løbet af et par dage. Således, vi generelt billede 6 til 8 h efter erfaring og giver mulighed for 5 dage mellem Imaging sessioner35.
For at kvantificere d2Venus og TurboFP635 fluorescens værdier tegnes en cirkulær region-of-Interest 4,64 μm i diameter, som er mindre end en neurale celle krop, centreret til cellen Soma. Vi går derefter videre til næste tidspunkt, scorer Soma af den samme celle på samme måde og gentager denne procedure for alle tidspunkter og alle synlige celler i det langsgående datasæt. Middelværdien af hver neuron (aktivitets afhængig) d2Venus emission normaliseres ved dens gennemsnitlige (aktivitets uafhængige) TurboFP635 emission. Denne metode gør det muligt at efterforske langsigtede dynamik af ensemble plasticitet af CARPNS35 (figur 3c).
Figur 1: forberedelse til in vivo dyb hjerne optisk billeddannelse. (A). Top (venstre) og side (højre) visninger af eksempel Imaging cannuals. Billed kanyle har en transparent glasbund, der giver optisk adgang til hippocampus. (B). skematisk beskrivelse af præparatet, der fremhæver den relative placering af billedbehandlings kanylen, en Carnot PN og de tre lag fibre fra dorsale til ventral. (C, D). Skematisk beskrivelse af billedbehandlings opsætningen (C) og af dyre fikserings-(D) under en billedbehandlings session. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Langsgående billeddannelse af dendritiske struktur og dendritiske spines dynamik. (A). 2p billedstak (maksimal intensitet projektion (MIP) af 59 billed planer, 2 μm z-afstand) af neuroner og dendritter mærket af gfp i en Live THY1-gfp mus. (B). højere FORSTØRRELSE (MIP af 53 billed planer, 1 μm z-afstand) detaljer basal dendritter placeret i so. (C). tidsforskudt billedsekvens af et dendritisk segment, der er afbildet i løbet af 14 dage. Pilespidser indikerer dendritiske pigge, som spores over 14 dage. (D, E). 2P billede stak af neuroner og dendritter mærket af GFP i en Live Thy1-GFP mus; (D) Zy projektion (31 billed planer, 3 μm z-afstand) og (E) XY fremskrivninger (17 billed planer, 3 μm z-afstand). (F). højere forstørrelse (enkelt billede plane) detaljer apikale dendritter og dendritiske pigge placeret i SR. arrowheads indikerer dendritiske pigge. Excitation: 920 nm; emission peak: 510 nm. Skala stænger: A, 50 μm; B, 10 μm; C, 2 μm; D og E, 15 μm; F, 4 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Langsgående billeddannelse af aktivitet-fremkaldt plasticitet. (A). 2p billeder (enkelt billede fly) fra en levende mus, der viser de samme celler på baseline dag 0 og efter ee på dag 1. (B). 2p billedstakke (MIPS på 4-6 billed planer, 3 μm z-afstand), der viser E-SARE-aktiverings mønstre, som er specifikke for miljø A (dag 1, 19 og 25) og miljø B (dag 7 og 13). Grøn: d2Venus fluorescens. Rød: TurboFP635 fluorescens. Excitation: 920 nm; d2Venus emission peak: 530 nm; TurboFP635 emission peak: 635nm. Skala stænger: A, 20 μm; B, 10 μm. Dette tal er blevet modificeret fra Attardo et al., 201835. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Imaging af neuronal struktur i hippocampus DG ved hjælp af tre-photon (3p) mikroskopi. (A-H). 3P-billeder (enkeltbilledfly) af neuroner og dendritter, der er mærket af GFP i en Live Thy1-GFP-muse detalje (A-E) PNs i granulat-og (F-H)-granula-cellerne i Generaldirektoratet. Excitation: 1400 nm; emission peak: 510 nm. Skala bjælke: 40 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende film 1: billedbehandlings synsfelt i en Live Thy1-GFP-mus. 2P billedstak (83 billed planer, 7 μm z-afstand) af neuroner og dendritter mærket af GFP (hvid) i en Live Thy1-GFP mus, der strækker sig fra bunden af kanyle til SLM. For at tage højde for henfald af fluorescens signal med stigende dybde, brugte vi en ikke-lineær gradient af Photomultiplier tubes gevinst. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende film 2: billeddannelse af aktivitet-fremkaldt plasticitet. 2P billedstak (28 billed planer, 3 μm z-afstand) af neuroner udtrykker E-SARE reporter af IEG udtryk i en levende mus omfattende SP. grøn: d2Venus fluorescens. Rød: TurboFP635 fluorescens. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Her beskrives en procedure for gentagen 2P-afbildning af dorsale-Carmen i levende mus. Efter operationen, musen normalt genindvinder inden for 2 dage. Proceduren inducerer minimal astrogliosis26,43. Blødning og ødem, som kan følge operationen er normalt re-adsorbede inden for 10 til 14 dage. Generelt, fra 14 dage efter implantation og fremefter præparatet er tilstrækkeligt klart til at udføre intravital Imaging. Succesen af operationen afhænger ikke af at arbejde i et sterilt miljø. Men, det er afgørende at opretholde en høj grad af hygiejne, for at undgå komplikationer på grund af kirurgi-associerede infektioner. Dette opnås ved omhyggeligt at rense de kirurgiske instrumenter før og efter operationen og ved at varme-sterilisere dem umiddelbart før hver brug (trin 2.1.1). Den optiske kanyle holdes i en ren, steriliseret beholder og skylles med sterilt saltvand lige før implantationen. Udførelse af almindelige kirurgiske praksis af hænder desinfektion og rengøring af kirurgisk Station er også meget vigtigt. Præparatet forbliver stabilt og tillader cellulære og subcellulære opløsning Imaging i flere uger26,35.
Kritiske trin, modifikationer og fejlfinding.
Det er vigtigt at skrælle den udvendige kapsel, indtil de dybeste fibre er eksponeret. Undladelse af at udsætte alveus kan resultere i manglende evne til at fokusere på Soma af PNS, eller i reduceret opløsning Imaging dendritiske spines, når du bruger kommercielle mål med 3-eller 4-mm WD. Til dette formål, det er nyttigt at afsmelte neocortex meget langsomt ved hjælp af en 0,9 mm diameter nål og derefter skifte til en 0,3-0,5 mm diameter (24-29 gauge) nål for en finere kontrol af sugning, når du fjerner de mest rygfibre. Alternativt kan fine pincet anvendes til at fjerne den resterende cortex efter fiber eksponering36.
Blødning under kirurgi kan være problematisk, som blod hindrer visningen. Venter på, at blodprop til dannelse og derefter skylning med saltvand til at vaske væk resterende blod anbefales. Gentag om nødvendigt.
En tætsiddende pasform mellem kanyle og kraniotomi hjælper med at øge stabiliteten af præparatet ved at holde kanylen på plads før påføring af cementen, især hvis den ydre rand af kanylen flugter med kraniet. Da størrelserne på trephin-boret og kanylen matches, kan der opstå en løs pasform på grund af uregelmæssigheder på siden af kanylen-som kræver lidt større craniotomier for at passe (Se trin 2.3.14)-eller fra en uregelmæssig kraniotomi. Eventuelle uregelmæssigheder i kanylen skal indgives (trin 1,3 og 1,12), og trefin skal holdes vinkelret på kraniet, indtil kranie ktomi er afsluttet (trin 2.3.12). Fjernelse af trephin fra kraniet før kraniotomi er afsluttet kan resultere i uregelmæssige craniotomier.
Begrænsninger- Invasivitet og stabilitet af præparatet.
Det er vanskeligt at evaluere virkningen af den kortikale ablation, da det er besværligt præcist at definere de områder, der berøres direkte og indirekte. I almindelighed, operationen fjerner en del af parietal cortex og en del af den visuelle og baglemmer sensoriske cortex21. Den ablateret cortex ikke direkte projekt til hippocampus og hippocampus væv er hverken rørt eller såret. Det er vigtigt, at det er påvist, at implantation af en billedbehandlings kanyle ikke groft ændrer hippocampus-funktionen og specifikt hippocampus-afhængig indlæring21,36,37,38, 39. Det vil dog være vigtigt at kvantificere, i hvilket omfang både kanyle og den udvendige del af implantatet (hoved holder pladen og dental akryl hætte) er kroniske stressorer ved at vurdere kortikosterone-blodets indhold og binyrens vægt i forhold til ikke-implanterede mus.
Præparatet er generelt stabilt fra uger til måneder26. På lang sigt har hud-og knoglevækst tendens til at fortrænge akryl hætten og øge ustabiliteten af billedbehandlings præparatet.
Optiske begrænsninger.
Konventionel 2p mikroskopi giver mulighed for billeddannelse op til ca. 1 mm dybt ind i neocortical væv40,41. I overensstemmelse med dette er det muligt at afbilde dendritter og dendritiske Spiner placeret i SR (figur 2D-F) eller SLM36. Men, Imaging gennem en kanyle udgør begrænsninger for den effektive NA. For at opnå den maksimale opløsning, skal diameteren og dybden af billedbehandlings kanylen matches med Imaging NA, da mindre diametre og længere dybder vil klippe lyset af høje NA-mål. For eksempel, når billeddannelse med en 1,0 NA vand nedsænkning mål gennem en 1,6 mm lang kanyle, en 3,65 mm indvendig diameter er nødvendig for at holde den fulde NA. Men ved hjælp af en kanyle af denne diameter vil øge komprimeringen på Hippocampus og kan påvirke sundheden for vævet, af denne grund, vi bruger en kanyle med en mindre diameter. Ved billeddannelse med et 0,8 NA vand nedsænknings formål gennem en 1,6 mm lang kanyle, ville en indvendig diameter på 2,5 mm være tilstrækkelig til at holde den fulde NA. Men, 0,8 NA vand nedsænkning mål har en kortere WD (3 mm i vores tilfælde), som kan forhindre i at fokusere på SP.
Disse beregninger gælder for midten af synsfeltet i bunden af kanyle. Men at flytte billedfeltet synspunkt værts-tættere på kanterne af kanylen-eller fokusere dybere ind i vævet-længere fra glasoverfladen af kanylen-yderligere nedsætter den effektive na på brændplanet og dermed reducerer opløsningen. Dette vil føre til ikke-homogen opløsning på tværs af de forskellige mængder af afbildet væv og kan være en bekymring for kvantitativ billeddannelse ved subcellulære opløsning, især når du bruger Super-resolution teknikker såsom 2p-sted mikroskopi42. Disse spørgsmål er mindre vigtigt, når Imaging på cellulære opløsning.
Vævs bevægelse.
Motion i vævet-stammer fra vejrtrækning og hjerteslag i bedøvet dyr-tendens til at blive mere alvorlig med øget afstand fra billedbehandling kanyle. Dette skyldes muligvis, at billedbehandlings kanylen anvender mekanisk Tryk på hjernen og dermed modvirker en del af bevægelsen i nærheden af kanylen (på samme måde som neokortiske præparater). Selv om billeddannelse af dendritiske spines er muligt i SR og SLM, i vores hænder, er det mest robuste dorsale til så op til ≈ 200 μm fra overfladen af kanylen. For at kompensere for bevægelse bruger vi resonans scannere og offline gennemsnit. Flere billeder (4 til 6 gentagelser) erhverves pr . billed plan for en z-stak ved den maksimale tilgængelige hastighed (30 frames/s). Alle gentagelser for hvert z-fly er derefter devolveret (ved hjælp af kommerciel software, AutoQuant), registreret (ved hjælp af ImageJ) og gennemsnit i et enkelt billede26. For billeddannelse af somata, bevægelse er ofte ubetydelig på anæstesi35 og to gennemsnit er ofte tilstrækkelige til at kompensere for motion artefakter.
Fremtidige anvendelser eller anvisninger af metoden .
Præparatet kan kombineres med mikro-endoskoper26,43. Mikro-endoskoper er stive optiske sonder, som bruger gradient brydnings Index (grin) mikrolinser til at vejlede lys til og fra dybe væv18. Brugen af mikro-endoskoper tillader kanyle af mindre diametre eller endda ingen kanyle overhovedet. Men, kommercielle mikro-endoskoper er mindre godt korrigeret for optiske aberrationer og har lavere NA end kommercielle mål. Nuværende sonder nå laterale og aksiale opløsninger af ≈ 0.6-1 μm, ≈ 10-12 μm, henholdsvis17,18,44. Brugen af mikro-endoskoper giver også mulighed for kombinationen af dette præparat med Hovedmonterede integrerede widefield mikroskoper45,46,47.
Metoden egner sig også til brug i ikke-bedøvede mus, og det er blevet brugt til at undersøge cellulær aktivitet ved hjælp af ca2 + sensorer i vågen hoved-fast mus21,37,48,49. I disse tilfælde, på grund af den hurtige tidsskalaer for fluorescens ændringer, er det tilrådeligt at implementere linje registrering50. Det er også muligt at tilpasse forberedelsen til billeddannelse af andre hippocampus-subregioner såsom dentate gyrus (DG)39,51,52. Kombinere dette præparat med 3p excitation53,54 med 1 MHz frekvens pulserende laser tunet til 1400 nm, vi var i stand til at billedet dybere ind i hippocampale dannelse nå det molekylære lag, granulat celle lag og af Generaldirektoratet (figur 4) uden at fjerne den overliggende
Afslutningsvis præsenterer vi en metode, der giver optisk adgang til dorsale hippocampus og tillader langsgående og korrelative undersøgelser af dynamikken i hippocampus struktur og aktivitet. Denne teknik udvider mulighederne for analyse af hippocampus funktion under fysiologiske og patologiske forhold.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
U. A. F. støttes af Schram Foundation; C.-W. T. P. og W. G. støttes af Max Planck Society; L.Y. og R.Y. understøttes af Max Planck Society og National Institute of Health (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. understøttes af et FP7-tilskud fra det europæiske forskningsråd, ERANET-og I-CORE-programmerne, det israelske sundhedsministeriums chefforsker kontor, Forbundsministeriet for uddannelse og forskning, Roberto og Renata Ruhman, Bruno og Simone Lich, Nella og Leon Benoziyo Center for neurologiske sygdomme, Henry Chanoch Krenter Institute for Biomedical Imaging og Genomics, Israels Science Foundation Perlman familien, Adelis, Marc Besen, Pratt og Irving I. Moskowitz fundamenter; A. A. støttes af Max Planck Society, Schram Foundation og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). 3P-billederne blev erhvervet under det avancerede kursus om Neuro billedbehandlings teknikker på Max Planck Florida Institute for Neuroscience. Den avancerede kursus om Neuro Imaging teknikker er understøttet af Max Planck Society, Florida State Max Planck Scientific Fellowship program og af Max Planck Florida Institute Corporation partnerskab program. Vi vil gerne takke Thorlabs, sammenhængende og SpectraPhysics for at yde støtte og udstyr til 2P/3P Imaging System i løbet af kurset. Vi er også taknemmelige for Henry HAEBERLE og Melissa Eberle for at hjælpe med systemet i løbet af kurset.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
| MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
| MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
| Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
| Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
| Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
| Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
| Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
| UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
| UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
| Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
| Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
| Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
| Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
| Graefe Forceps - Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
| MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
| Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill - 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
| Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
| Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
| 3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
| Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
| Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
| Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
| Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
| Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
| Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
| Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
| CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
| Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
| KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
| Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
| Absorption Triangles - Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
| Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
| Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
| Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
| Blunt needles 0.9x23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
| Blunt needles 0.5x42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
| Blunt needles 0.3x23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
| Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
| Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
| Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
| Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
| Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
| Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
| Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
| Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
| 7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
| Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
| RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
| S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
| Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
| X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
| Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
| Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
| Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
| Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
| LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
| XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
| Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
| Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
| Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |
References
- O’Keefe, J., Nadel, L. The hippocampus as a cognitive map. , Clarendon Press; Oxford University Press. (1978).
- Zola-Morgan, S., Squire, L. R. Memory Impairment in Monkeys Following Lesions Limited to the Hippocampus. Behavioral Neuroscience. 100 (2), 155-160 (1986).
- Squire, L., Zola-Morgan, S. The medial temporal lobe memory system. Science. 253 (5026), 1380-1386 (1991).
- Leutgeb, S., Leutgeb, J. K., Barnes, C. A., Moser, E. I., McNaughton, B. L., Moser, M. B. Independent codes for spatial and episodic memory in hippocampal neuronal ensembles. Science. 309 (5734), 619-623 (2005).
- Silva, A. J., Zhou, Y., Rogerson, T., Shobe, J., Balaji, J. Molecular and cellular approaches to memory allocation in neural circuits. Science. 326 (5951), 391-395 (2009).
- Tonegawa, S., Pignatelli, M., Roy, D. S., Ryan, T. J. Memory engram storage and retrieval. Current Opinion in Neurobiology. 35, 101-109 (2015).
- Poo, M., et al. What is memory? The present state of the engram. BMC Biology. 14, (2016).
- O’Keefe, J., Dostrovsky, J. The hippocampus as a spatial map. Preliminary evidence from unit activity in the freely-moving rat. Brain Research. 34 (1), 171-175 (1971).
- Moser, M. B., Moser, E. I. Functional differentiation in the hippocampus. Hippocampus. 8 (6), 608-619 (1998).
- Altman, J. Autoradiographic investigation of cell proliferation in the brains of rats and cats. Anatomical Record. 145, 573-591 (1963).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Sorrells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Boldrini, M., et al. Human hippocampal neurogenesis persists throughout aging. Cell Stem Cell. 22 (4), 589-599 (2018).
- Polanco, J. C., et al. Amyloid-β and tau complexity — towards improved biomarkers and targeted therapies. Nature Reviews Neurology. 14 (1), 22-39 (2017).
- Rosene, D. L., Van Hoesen, G. W., et al. The hippocampal formation of the primate brain. in Cerebral Cortex. Jones, E. G., et al. Chapter 9, Plenum Press. New York. 345-456 (1987).
- Klohs, J., Rudin, M. Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist. 17 (5), 539-559 (2011).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Reviewof Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
- Jung, J. C., Schnitzer, M. J. Multiphoton endoscopy. Optics Letters. 28 (11), 902 (2003).
- Levene, M. J., Dombeck, D. A., Kasischke, K. A., Molloy, R. P., Webb, W. W. In vivo multiphoton microscopy of deep brain tissue. Journal of Neurophysiology. 91 (4), 1908-1912 (2004).
- Mizrahi, A., Crowley, J. C., Shtoyerman, E., Katz, L. C. High-Resolution in vivo imaging of hippocampal dendrites and spines. The Journal of Neuroscience. 24 (13), 3147-3151 (2004).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Busche, M. A., et al. Critical role of soluble amyloid- for early hippocampal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer’s disease. Proceedings of the National Academy of Science. 109 (22), 8740-8745 (2012).
- Jung, J. C., Mehta, A. D., Aksay, E., Stepnoski, R., Schnitzer, M. J. In vivo mammalian brain imaging using one- and two-photon fluorescence microendoscopy. Journal of Neurophysiology. 92 (5), 3121-3133 (2004).
- Deisseroth, K., et al. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10380-10386 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus. Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Zuo, Y., Yang, G., Kwon, E., Gan, W. B. Long-term sensory deprivation prevents dendritic spine loss in primary somatosensory cortex. Nature. 436 (7048), 261-265 (2005).
- Holtmaat, A. J. G. D., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Gu, L., et al. Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity. The Journal of Neuroscience. 34, 13948-13953 (2014).
- Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in Neurosciences. 34 (42), 177-187 (2011).
- Kawashima, T., et al. Functional labeling of neurons and their projections using the synthetic activity-dependent promoter E-SARE. Nature Methods. 10 (9), 889-895 (2013).
- Attardo, A., et al. Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1. Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).
- Schmid, L. C., et al. Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer’s disease model. Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).
- Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).
- Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343 (6173), 857-863 (2014).
- Hainmueller, T., Bartos, M. Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus. Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).
- Beaurepaire, E., Oheim, M., Mertz, J. Ultra-deep two-photon fluorescence excitation in turbid media. Optics Communications. 188, 25-29 (2001).
- Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 mm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).
- Pfeiffer, T., et al. Chronic 2P-STED imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo. eLife. 7, e34700 (2018).
- Barretto, R. P. J., et al. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature Medicine. 17 (2), 223-228 (2011).
- Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties. Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), aaa5694 (2016).
- Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. SIMA: Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, (2014).
- Gonçalves, J. T., et al. In vivo imaging of dendritic pruning in dentate granule cells. Nature Neuroscience. 19 (6), 788-791 (2016).
- Danielson, N. B., et al. Distinct contribution of adult-born hippocampal granule cells to context encoding. Neuron. 90 (1), 101-112 (2016).
- Hell, S. W., et al. Three-photon excitation in fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 1 (1), 71 (1996).
- Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).
