Summary
Diese Methode beschreibt eine chronische Zubereitung, die den optischen Zugang zum Hippocampus lebender Mäuse ermöglicht. Dieses Präparat kann verwendet werden, um längsinale optische Bildgebung der neuronalen strukturellen Plastizität und aktivitätsbeschworenen zellulären Plastizität über einen Zeitraum von mehreren Wochen durchzuführen.
Abstract
Die Zwei-Photonen-Mikroskopie ist ein grundlegendes Werkzeug für die Neurowissenschaften, da sie die Untersuchung des Gehirns lebender Tiere in räumlichen Maßstäben von subzellulären bis zu Netzwerkebenen und in zeitlichen Skalen von Millisekunden bis Wochen ermöglicht. Darüber hinaus kann die Zwei-Photonen-Bildgebung mit einer Vielzahl von Verhaltensaufgaben kombiniert werden, um die kausalen Zusammenhänge zwischen Gehirnfunktion und Verhalten zu untersuchen. Bei Säugetieren haben jedoch die begrenzte Penetration und Streuung von Licht die intravitale Zwei-Photon-Bildgebung hauptsächlich auf oberflächliche Hirnregionen beschränkt und damit eine Längsuntersuchung von Tiefhirnbereichen wie dem Hippocampus ausgeschlossen. Der Hippocampus ist an der räumlichen Navigation und dem episodischen Gedächtnis beteiligt und ist ein langjähriges Modell, das verwendet wird, um zelluläre sowie kognitive Prozesse zu studieren, die für das Lernen und Erinnern wichtig sind, sowohl bei Gesundheit als auch bei Krankheiten. Hier wird ein Präparat detailliert beschrieben, das einen chronischen optischen Zugang zum dorsalen Hippocampus bei lebenden Mäusen ermöglicht. Dieses Präparat kann mit einer zweiphotonenoptischen Bildgebung bei zellulärer und subzellulärer Auflösung in Kopf fixierten, anästhesierten lebenden Mäusen über mehrere Wochen kombiniert werden. Diese Techniken ermöglichen eine wiederholte Bildgebung der neuronalen Struktur oder aktivitätsevokten Plastizität in Dutzenden bis Hunderten von Neuronen im dorsalen Hippocampus CA1. Darüber hinaus kann diese chronische Präparation in Kombination mit anderen Techniken wie Mikroendoskopie, kopfmontierter Weitfeldmikroskopie oder Drei-Photonen-Mikroskopie eingesetzt werden, wodurch die Toolbox zur Untersuchung von Zell- und Netzwerkprozessen erheblich erweitert wird. in Lernen und Gedächtnis.
Introduction
Bei Säugetieren ist der Hippocampus eine wichtige Hirnregion für die Kodierung und den Rückruf episodischer Erinnerungen sowie für die räumliche Navigation1,2,3,4. Aus diesem Grund war und ist der Hippocampus ein sehr wichtiges Modell, um die grundlegenden Mechanismenzu studieren, die es dem Gehirn ermöglichen, Erinnerungen 5,6,7 zu kodieren und zurückzurufen oder in einer Umgebung zu navigieren8 ,9 Belohnungen sammeln und Gefahren vermeiden. Darüber hinaus ist die Hippocampus-Bildung eine der Hirnregionen, in denen neue Neuronen während des gesamten Lebens der Nagetiere10,11 und möglicherweise des Menschen12,13erzeugt werden. Schließlich sind Degeneration oder Beeinträchtigung der Hippocampusbildung mit neurologischen und psychiatrischen Störungen verbunden, einschließlich der Alzheimer-Krankheit14.
Bei Mäusen befindet sich der Hippocampus etwa 1 mm unter der Hirnoberfläche15. Seine Position hat den optischen Zugang im intakten Gehirn verhindert, und folglich stützten sich Längsstudien der Hippocampusdynamik hauptsächlich auf Magnetresonanzgebungs-, Elektrophysiologie- und Ex-vivo-Bildgebungsanalysen. MR-Bildgebungsmethoden ermöglichen die Verfolgung biologischer Prozesse (z. B. Genexpressionsänderungen16) bei demselben Tier über mehrere Tage, aber es fehlt die räumliche Auflösung, um einzelne Neuronen zu unterscheiden. Klassische elektrophysiologische In-vivo-Techniken bieten eine sehr hohe zeitliche Auflösung und eine exquisite Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen des Membranpotenzials. Sie haben jedoch eine begrenzte räumliche Auflösung und es fehlt ihnen an der Fähigkeit, dieselben Zellen über längere Zeiträume zuverlässig zu verfolgen. Die optische Bildgebung ermöglicht die Erforschung unterschiedlicher Prozesse aufgrund ihrer hohen zeitlichen und räumlichen Auflösungen. Ex-vivo-Bildgebung liefert jedoch nur Momentaufnahmen laufender Prozesse und ist daher nicht für Längsstudien geeignet, bei denen die Tiere Informationen lernen und abrufen.
Die optische Bildgebung in vivo kombiniert einige Vorteile der MR-Bildgebung und Elektrophysiologie mit denen der optischen Bildgebung. Daher ist es sehr gut geeignet für Längs- und Korrelativanalysen der Maus-Gehirndynamik und -verhalten. Dies ist relevant in Studien von biologischen Prozessen mit sehr schnellen (Millisekunden bis Sekunden) oder sehr langsamen (Tagen bis Wochen) Zeitskalen. Beispiele für solche prozesse, die für die Neurowissenschaft relevant sind, sind Membranspannungsdynamik, Ca 2+-Transienten, zelluläre Plastizität und strukturelle Veränderungen, die alle als sehr wichtig für die Gedächtnisbildung und den Rückruf angesehen werden. Verschiedene Methoden haben in vivo Bildgebung auf den dorsalen Hippocampus18,19,20,21,22erweitert. Akute Präparate haben die Verfolgung der pyramidenförmigen Neuron (PN) Aktivität sowie deren Dendriten und dendritischen Stacheln für mehrere Stundenerlaubt 20,22. Dieser zeitliche Zeitrahmen erlaubt es jedoch nicht, langfristige strukturelle Veränderungen zu untersuchen, die dem inkrementellen Lernen zugrunde liegen könnten. Chronische Präparate - in Kombination mit Mikroendoskopen23,24 oder mit langen Arbeitswegen (WD) Standardmikroskopobjektive21 - haben eine wiederholte Bildgebung des dorsalen Hippocampus über mehrere Wochen.
Hier beschreiben wir ein chronisches Präparat, das einen wiederkehrenden optischen Zugang zum CA1-Unterfeld des dorsalen Hippocampus lebender Mäuse mit einer dauerhaft eingefügten bildgebenden Kanüle ermöglicht. Dieses Präparat ermöglicht den wiederholten Zugriff auf die CA1 ohne Funktionsstörungen und eignet sich für intravitale Zweiphotonen (2P) oder Weitfeld-Epifluoreszenz-Bildgebung. Zwei Beispiele für die chronische 2P-Bildgebung im tiefen Gehirn in der dorsalen CA1 von lebenden Mäusen sind detailliert: Längsbildgebung der dendritischen Struktur und dendritische Wirbelsäulendynamik und Längsbildgebung der aktivitätsevozierten Plastizität. Die wesentlichen Vorteile und Grenzen der Technik werden diskutiert.
Protocol
Alle beschriebenen Methoden wurden von der Regierung von Oberbayern (Lizenz 2016_ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-16-48) und vom Stanford and Max-Planck Florida Institute for Neuroscience Administrative Panels on Laboratory Animal Care genehmigt.
1. Vorbereitung der Bildkanüle
- Halten Sie einen Präzisionsbohrer auf einem Bohrständer, der mit einem beweglichen Linealtisch geliefert wird.
- Klemmen Sie ein Edelstahlrohr mit einem Durchmesser von 3,0 mm auf den beweglichen Linealtisch.
- Schneiden Sie das Rohr auf einen 1,6 mm langen Metallring. Wenn die Ränder des Rings nach dem Schneiden nicht stumpf sind, melden Sie die Unregelmäßigkeiten auf.
- Spülen Sie den Metallring und einen kreisförmigen Glasdeckel mit 4 mm Durchmesser in 100% Aceton und lassen Sie sie für 5 min trocknen.
- Legen Sie den Metallring und die Glasabdeckung auf einen glatten, gleichmäßigen und sauberen Arbeitsplatz unter einem Stereoskop.
- Legen Sie einen Tropfen UV-härtenden optischen Klebstoff auf eine glatte Oberfläche, wie z. B. eine Petrischale. Verwenden Sie eine Nadel oder einen Spachtel, um den Klebstoff zu einer dünnen (<0,5 mm) Schicht zu verteilen.
- Verwenden Sie Zangen, um eine Seite des Metallrings in den Klebstoff zu tauchen. Achten Sie besonders darauf, das Innere des Rings nicht zu versiegeln. Wenn dies geschieht, verwenden Sie eine Nadel, um den optischen Klebstoff im Ring zu brechen.
- Positionieren Sie den Metallring mit Hilfe des Stereoskops in der Mitte des Glasdeckels, wobei die Seite des Rings mit Klebstoff bedeckt ist, der den Deckel berührt. An der Schnittstelle zwischen Metallring und Deckblatt sollte sich ein dünner Klebering bilden. Vermeiden Sie eine Klebstoffausbreitung in die Mitte des Deckels.
- Schalten Sie die UV-härtende LED-Treibereinheit ein und leuchten Sie 1 min (365 nm).
VORSICHT: UV-Licht provoziert Hautverbrennungen und ist ein mutagenes Mittel. Tragen Sie eine UV-Schutzbrille und bedecken Sie Hände und Arme mit Handschuhen und einem Labormantel, um Hauteinwirkung zu vermeiden. - Um den Klebstoff gleichmäßig auszuhärten, stellen Sie sicher, dass alle Seiten des Rings gleichmäßig beleuchtet sind, indem Sie die Richtung der Lichtquelle ändern.
- Lassen Sie den Klebstoff mindestens 2 h, vorzugsweise über Nacht aushärten.
- Halten Sie die Kanüle vom offenen Ende des Metallrings mit Hilfe eines Hämostats fest. Mit einem Zahnbohrer mit einer rotierenden Datei ausgestattet und arbeiten unter dem Stereoskop, Datei aus dem überschüssigen Glas Abdeckung, bis bündig mit den Seiten des Rings (Abbildung 1A).
2. Implantation der bildgebenden Kanüle über den dorsalen Hippocampus
- Vorbereitung der Ausrüstung und Einrichtung
- Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente sauber und steril sind. Wenn Sie einen Glasperlensterilisator zur Sterilisation verwenden, reinigen Sie die Instrumente und legen Sie sie vor der Anwendung 10 min in den Sterilisator (auf 250 °C eingestellt). Alternativ können Sie die Instrumente vor dem Gebrauch autoklavieren.
- Bereiten Sie alle Materialien, die für die Operation benötigt werden, sowie chirurgische Instrumente, so dass sie leicht erreicht werden können.
- Stellen Sie sicher, dass es genügend frisch zubereitete Medikamente wie Schmerzmittel oder entzündungshemmende Medikamente gibt.
- Stellen Sie sicher, dass es genügend Isofluran für die gesamte Dauer der Operation (ca. 1 h pro Operation) gibt.
- Schalten Sie den Heizteppich ein und stellen Sie ihn auf 37 °C, um die Temperatur der Tiere unter Anästhesie stabil zu halten.
- Stellen Sie sicher, dass das Aufräumsystem für Isofluran funktioniert.
- Öffnen Sie das Ventil des Sauerstoffflusses.
- Anästhesie-Induktion und Tierfixierung
- Legen Sie die Maus in die Anästhesie-Induktionskammer bei 3% Isofluran in 1 L/min O2 und warten Sie, bis sie das Bewusstsein verliert. Bewerten Sie die Anästhesie mit dem Zehenkneifreflextest.
- Wiegen Sie das Tier.
- Entzündungshemmende (Meloxicam, 1mg/Kg) und Schmerzmittel (Vetalgin, 200mg/kg) subkutan anwenden.
- Positionieren Sie die Maus auf dem Heizteppich. Stellen Sie sicher, dass das Tier nicht in direktem Kontakt mit dem Heizteppich ist, um thermische Verbrennungen zu vermeiden.
- Sichern Sie den Kopf am stereotaktischen Apparat und positionieren Sie den Nasenkegel, um die Schnis zu bedecken. Um die Anästhesie aufrechtzuerhalten, verringern Sie Isofluran auf 1,5-2%. Während der gesamten Operation, überwachen Mauszustand durch visuelle Überwachung der Atmung und durch Testen Zehen-Pinch-Reflex. Regulieren Sie isoflurane Prozentsatz, wenn nötig.
- Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen auf, um Austrocknung und mögliche Erblindung zu verhindern.
HINWEIS: Für Anästhesie und Tiermedikamente sind alternative Methoden und Medikamente möglich. Bitte beachten Sie Ihre Tierlizenz und die verwandte Literatur.
- Optische Kanülenimplantation
- Schalten Sie die Lichtquelle ein.
- Entfernen Sie das Haar und desinfizieren Sie die Haut über den Mauskopf.
- Entfernen Sie mit Schere und Zange die Kopfhaut der Maus. Beginnen Sie mit einem kleinen Schnitt in der Kopfhaut in einer Position in der Nähe von Lambda. Fahren Sie fort, indem Sie die Kopfhaut auf beiden Seiten öffnen. Bewegen Sie sich zunächst seitlich in Richtung der Ohren, dann rostral, in Richtung der Augenbahnen, um ein Dreieck auf der sagittalen Achse zu bilden, ca. 4 mm rostral zu bregma. Achten Sie darauf, nicht zu nah an Ohren und Augen zu schneiden, sondern bregma und Lambda, sowie parietale Knochen und die hintere Hälfte der Frontalknochen aussetzen.
- Tragen Sie einen Tropfen (ca. 10 mg) Lidocain (28,9 % v/v in Alkohol) auf den Schädel auf.
- Löschen Sie das Periost und trocknen Sie den Schädel mit einem Wattestäbchen.
- Positionieren Sie die Ohrstangen, um den Mauskopf zu fixieren.
- Machen Sie eine kleine Kraniotomie, mit einem Mikrobohrer mit einem 0,5 mm Breitengrat. Positionieren Sie das Loch in den frontalen Knochen gegenüber dem abgebildeten Hippocampus, ca. 1,5 mm von der sagittalen Naht und 2 mm von der koronalen Naht entfernt.
- Schrauben Sie eine 0,86 mm breite Edelstahl-Knochenschraube in das Schädelloch.
- Reinigen Sie bei Bedarf den Schutt und trocknen Sie den Schädel.
- Herstellung einer Mischung aus schnell klebendem Zement
- Mit einem kleinen Löffel (Durchmesser 4,5 mm) 1-1,5-Level-Messlöffel L-Pulver in einen Mischbrunnen geben.
- Geben Sie 3-4 Tropfen Quick Base in den Brunnen.
- Geben Sie 1 Tropfen Universal-Katalysator in den Brunnen.
- Rühren Sie die Mischung für 5-10 s mit einem Präzisions-Applikator.
HINWEIS: Alternative Zemente sind verfügbar. Bitte beachten Sie die Anweisungen des Herstellers.
- Verwenden Sie Präzisionsapplikatoren, um schnellen Klebezement über Schädel, Schraube und umgebende Haut aufzutragen. Lassen Sie es für 30 s bis 1 min trocknen.
- Verwenden Sie einen Trephinbohrer mit einem Durchmesser von 3,0 mm, um eine Kraniotomie im parietalen Knochen zu machen. Positionieren Sie das Loch etwa 1,5 mm von der sagittalen Naht und 2 mm von der Lambdoid-Naht entfernt.
- Entfernen Sie vorsichtig die Knochenklappe.
- Überprüfen Sie die Größe der Kraniotomie mit der Kanüle, um sicherzustellen, dass sie passt. Verwenden Sie einen Mikrobohrer mit einer Breite von 0,5 mm oder 0,9 mm, um die Kraniotomie bei Bedarf zu vergrößern.
- Entfernen Sie die Meninges mit Dumont Zange.
- Ablate kortikale Materie, um die externe Kapsel zu erreichen. Verwenden Sie eine stumpfe Nadel mit einem Durchmesser von 0,9 mm (19 Gauge), die mit einer Vakuumpumpe verbunden ist. Bewässern Sie mit Derinin, um eine Austrocknung des exponierten Gewebes zu vermeiden und Restblut nach der Blutung abzuwaschen. Saugen Sie das kortikale Gewebe langsam, jeweils 50-100 m, bis sich der Kortex von der Kapsel löst und die Fasern des Cingulums oder des Corpus callosumfreisetzt. Wechseln Sie die Nadel häufig, um Verstopfung zu verhindern.
- Fasern erstrecken sich hauptsächlich in drei Richtungen (Abbildung 1B). Die Rückenfasern vorsichtig schälen, bis die tiefsten Fasern(Alveus des Hippocampus) freigelegt sind.
- Spülen Sie das Gewebe mit Saline. Verwenden Sie dünne Zangen, um die untere Kanüle in eine Saline zu tauchen und sie über dem Schädelloch zu positionieren. Kanülen und Gewebe müssen mit Einer Saline versiegelt werden, um Luftblasen zwischen Kanüle und Gewebe zu vermeiden.
- Drücken Sie die Kanüle in den Schädel (Abbildung 1C), bis der Glasdeckel in Kontakt mit den Fasern ist.
- Trocknen Sie den Schädel gut mit Absorptionsdreiecken, Wattestäbchen und/oder der Vakuumpumpe.
- Herstellung einer Mischung aus schnell klebendem Zement (siehe Schritt 2.3.10).
- Verwenden Sie Präzisionsapplikatoren, um schnellen Klebstoffzement über den Schädel aufzutragen. Kleber auch auf den Rand der Kanüle auftragen. Achten Sie darauf, den Klebstoff nicht in die Kanüle laufen zu lassen. Lassen Sie es für 30 s bis 1 min trocknen.
- Verwenden Sie einen stereotaxic Arm, um eine Kopfhalterplatte über der Kanüle in Kontakt mit dem Schädel zu positionieren.
- Herstellung einer Mischung aus Zahnacryl
- Mit einem Löffel (Durchmesser von 9 mm) 1 Fülllöffel (1 Teil) Pulver in einen Mischbrunnen geben.
- Geben Sie 2-3 Teile flüssigkeitsmenge im selben Brunnen. Das gesamte Pulver mit der Flüssigkeit bedecken.
- Rühren Sie für 1 min mit einem Spachtel.
HINWEIS: Alternative Acrylfarben sind verfügbar. Bitte beachten Sie die Anweisungen des Herstellers.
- Verwenden Sie einen Spachtel oder einen Präzisions-Applikator, um Acryl auf den Schädel aufzutragen. Bedecken Sie den gesamten freiliegenden Schädel, die Schraube und die offene Haut mit Zahnacryl. Das macht die Vorbereitung stabil. Lassen Sie Acryl nicht den Hals, die Ohren und die Augen herunterlaufen.
- Lassen Sie das Acryl trocknen und härten Sie ca. 15 min aus.
- Tragen Sie einen abnehmbaren Klebefilm auf die Kopfhalterplatte auf, um zu verhindern, dass Schmutz in die Kanüle gelangt. Es wird empfohlen, dass die Filmgröße mit der der Platte übereinstimmt.
- Isofluran-Fluss ausschalten, das Tier aus stereotaktischen Geräten entfernen und es auf einer Heizplatte positionieren, um die physiologische Körpertemperatur zu erhalten, während es aus der Anästhesie aufwacht.
- Überwachen Sie das Tier, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die Brustbehebung aufrechtzuerhalten.
- Das Tier, das operiert wurde, erst dann an die Gesellschaft anderer Tiere zurück, wenn es vollständig geborgen wurde.
3. Postoperative Pflege
- Überprüfen Sie den Status der Maus für 2 Tage nach der Operation, indem Sie das Gewicht und das allgemeine Verhalten überwachen.
- Entzündungshemmende (Meloxicam, 1mg/Kg) und Schmerzmittel (Vetalgin, 200mg/kg) für 2 Tage nach der Operation subkutan anwenden
HINWEIS: Alternative Überwachungsverfahren, Medikamente und Dosierungen sind für die postoperative Versorgung möglich. Bitte beachten Sie Ihre Tierlizenz und die verwandte Literatur.
4. Vorbereitung der Bildgebungssitzung
- Schalten Sie das Bildgebungs-Setup im Voraus ein und lassen Sie den Laser aufwärmen und stabilisieren, falls erforderlich.
- Anästhesisieren Sie die Maus (siehe Schritt 2.2.1).
- Verwenden Sie Zangen, um den Klebefilm vorsichtig von der Kopfhalterplatte zu entfernen. Halten Sie die Maus in einer Hand und die Kopfhalterplatte mit den Fingern. Entfernen Sie den Film vorsichtig, um eine Beschädigung der Zubereitung zu vermeiden.
- Positionieren Sie die Maus unter dem Mikroskop, über den Heizteppich und befesten Sie die Kopfplatte am Halter (Abbildung 1D).
- Positionieren Sie den Nasenkegel, um die Schnarbe zu bedecken und Isofluran auf 1,5-2% zu verringern.
- Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Mausaugen auf.
- Reinigen Sie die bildgebende Kanüle, indem Sie sie mit entionisiertem Wasser abspülen. Verwenden Sie eine Spritze und eine dünne Nadel, um Wasser in die Kanüle und eine Vakuumpumpe zu lassen, um es zu entfernen.
5. Imaging-Sitzung
- Verwenden Sie niedrige Vergrößerung, lange Arbeitswege Ziele, um die Kanüle visuell auf Restwasser, Schmutz, Integrität und das Vorhandensein von Fluoreszenz zu überprüfen.
- Richten Sie die Kanüle an der optischen Achse aus, indem Sie die Winkel der Kopfhalterarme anpassen.
- Wechseln Sie auf die 25X 1.0 NA, 4 mm WD oder die 40X 0.8 NA, 3 mm WD, Wasser-Tauchobjektive. Fügen Sie genügend entionisiertes Wasser hinzu, um die Kanüle zu füllen und überschüssiges Wasser auf der Kanüle zu halten. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen.
- Verwenden Sie 2P-Anregungs- und Bildfluoreszenzsignale.
HINWEIS: Das Bildgebungsprotokoll ist in hohem Maße von der Zeit und den räumlichen Maßstäben abhängig, die abgebildet werden sollen. Weitere Informationen zu den Bildeinstellungen, die wir zur Erstellung der in diesem Artikel gezeigten Bilder verwendet haben, finden Sie in den repräsentativen Ergebnissen und in der Diskussion.
Representative Results
Da die Kanüle nur dorsal zu CA1 platziert wird, ist der dorsale Aspekt der CA1 im Vergleich zum ventralen dem Mikroskop proximaler. Der Alveus ist die proximalste Struktur, gefolgt von Stratum Oriens (SO), Stratum pyramidale (SP), Stratum radiatum (SR) und Stratum lacunosum moleculare (SLM), der distalsten Schicht (Abbildungen 1B , C). Als repräsentative Ergebnisse werden die Längs-2P-Bildgebung der neuronalen Struktur mit subzellulärer Auflösung und der aktivitätsevozierten Plastizität mit zellulärer Auflösung dargestellt. Um die Fluorophore grün fluoreszierendes Protein (GFP), d2Venus und TurboFP635 zu begeistern, wird ein femtosekundengepulster Ti:Sapphire-Laser verwendet, der auf 920 nm abgestimmt ist, und die durchschnittliche Laserleistung wird an der Probe auf 5-25 mW eingestellt. Die verschiedenen Emissionswellenlängen werden mit Emissionsfiltern und verschiedenen Photomultiplierröhren getrennt.
Längsbildgebung der dendritischen Struktur und dendritischen Stacheln Dynamik.
Um hippocampale PNs spärlich zu kennzeichnen und ihre Struktur zu visualisieren, wird eine Transgen-Mauslinie (M-Linie) von Thy1-GFP verwendet. Thy1-GFP-Mäuse drücken zytoplasmisch verbessertes GFP unter der Kontrolle des Thy1-Promotors in einer spärlichen, zufälligen Population von PNs25aus. Im Allgemeinen ist die Hauptachse von CA1 PNs in etwa senkrecht zur XY-Bildebene (Abbildung enden 1B, Abbildung 2A und Ergänzender Film 1). Basale Dendriten erstrecken sich in der SO, vom Soma zur Kanüle, während sich apikale und apikale Tuftdendrite distally zur Kanüle erstrecken, in die entgegengesetzte Richtung (Ergänzender Film 1). Da die Zubereitung die tiefsten Fasern des Alveus intakt lässt, sollten einige fluoreszierende Fasern, die das Sichtfeld durchqueren, direkt unter der Kanüle sichtbar sein (Abbildung 2A und Film 1). Das Präparat ermöglicht die Abbildung von PN-Dendriten mit Rückenauflösung (Abbildung 2 A-C). Zur Abbildung dendriten und dendritischen Stacheln, eine 25X 1.0 NA, 4 mm WD, Wasser Immersion kommerzielle Objektivlinse verwendet.
Für die Längsspurenverfolgung werden während der ersten Bildgebungssitzung mehrere Hirnregionen im Sichtfeld der Kanüle definiert. Jede Region entspricht einer Fläche von ca. 240 x 240 m und enthält zwischen 1 und 7 dendritische Segmente (Abbildung 2B). Diese Bereiche werden manuell einem dreidimensionalen Stapel mit geringer Vergrößerung zugeordnet, der das Muster der GFP-Expression in der Lautstärke unterhalb der Bildkanüle zeigt (Abbildung 2A). Dann werden 1 'm z-step-Bildstapel von CA1 PN-Basaldendriten in verschiedenen Zeitintervallen (von 24 h bis 3 Tagen) für bis zu etwa 14 Tage erfasst (Abbildung2C). Längere Bildgebungsdauern und Intervalle sind möglich26. Jede Bildgebungssitzung dauert ca. 60 bis 90 min. Obwohl die meisten Bilder von dendritischen Stacheln in der SO sind, ist es auch möglich, dendritische Stacheln in den schrägen Dendriten von SR (Abbildungen 2D-F) abzubilden. Neben der Wirbelsäulendichte ermöglicht diese Methode die Untersuchung der Wirbelsäulendynamik durch Quantifizierung ihrer Überlebens-, Gewinn- und Verlustraten26,27,28,29,30, 31 , 32. Um dendritische Stacheln im Laufe der Zeit zu punkten und zu verfolgen (Abbildung 2C), wird eine benutzerdefinierte MATLAB-Schnittstelle verwendet. Dies ermöglicht die Ausrichtung der zu verschiedenen Zeitpunkten erfassten Bildstapel und unterstützt die manuelle Beschriftung von Dendriten und Stacheln bei der Verfolgung von dendritischen Längen und Wirbelsäulenpositionen im Laufe der Zeit26. Wichtig ist, dass diese Methode verwendet werden kann, um (jenach Zeitpunkt, ausgenommen den ersten) zwischen bereits existierenden und neugeborenen dendritischen Stacheln zu unterscheiden. Dies ist wichtig, da die verschiedenen Klassen der dendritischen Stacheln vermutlich unterschiedliche Rollen bei der Speichererfassung und -aufbewahrung haben33.
Längsbildgebung der aktivitätsevozierten Plastizität.
Um die aktivitätsevozierte Plastizität in CA1 PNs abzubilden, wird der dorsale CA1-Hippocampusbereich mit einem viralen Vektor injiziert, der grüne Fluoreszenz destabilisierte d2Venus über eine verbesserte Form des synaptischen aktivitätsresponsiven Elements (E-SARE) innerhalb des Arc exibilisiert. Enhancer/Promoter und roter Fluoreszenz TurboFP635 über den ePGK-Promoter 34. Dies ermöglicht die Abbildung von aktivitätsbeschworenen Plastizitäten von Hunderten von CA1 PNs in jedem Tier35. Angesichts der sehr dichten Kennzeichnung von PNs ist es in der Regel nicht möglich, die Dendriten von CA1 PNs (Supplementary Movie 2) aufzulösen.
Um die Somata von CA1 PNs abzubilden, wird eine 40X 0.8 NA, 3 mm WD, Wasser immersion Objektiv objektiv verwendet. Für die Längsspurenverfolgung werden während der ersten Bildgebungssitzung 1 bis 9 Hirnregionen pro Maus definiert. Jede Region entspricht einer Fläche von ca. 300 x 300 m und enthält zwischen 50 und 150 Zellen (Abbildung 3A). Diese Bereiche werden manuell lokalen Gewebe-Landmarken zugeordnet, die bei einer niedrigeren Vergrößerung sichtbar sind. Dann werden 3 -m-Z-Step-Bildstapel erfasst, die den SP von CA1 PNs (Abbildung 3A und Supplementary Movie 2) in verschiedenen Zeitintervallen (von 24 h bis 6 Tagen) für bis zu etwa 30 Tage umfassen. Jede Bildgebungssitzung dauert ca. 60 bis 90 min. E-SARE-Aktivierungsspitzen 6 bis 8 h nach einer Exposition gegenüber einer neuen oder angereicherten Umgebung (EE, Abbildung 3B) und zerfällt im Laufe weniger Tage. So stellen wir in der Regel 6 bis 8 h nach der Erfahrung ab und lassen 5 Tage zwischen den Bildsitzungen35zu.
Um die Fluoreszenzwerte d2Venus und TurboFP635 zu quantifizieren, wird ein kreisförmiger Interessenbereich von 4,64 m Durchmesser gezeichnet, der kleiner ist als ein neuronaler Zellkörper, zentriert auf das Zellsoma. Wir kommen dann zum nächsten Zeitpunkt, bewerten den Soma derselben Zelle auf die gleiche Weise und iterieren dieses Verfahren für alle Zeitpunkte und alle sichtbaren Zellen im Längsschnitt-Dataset. Der Mittelwert der (aktivitätsabhängigen) d2Venus-Emission jedes Neurons wird durch seine mittlere (aktivitätsunabhängige) TurboFP635-Emission normalisiert. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der langzeitigen Dynamik der Ensembleplastizität von CA1 PNs35 (Abbildung 3C).
Abbildung 1: Vorbereitung der optischen Bildgebung im tiefen Gehirn in vivo. (A). Die Ansichten oben (links) und "Links" (rechts) der Beispielabbildungen cannuals. Bildgebende Kanülen haben einen transparenten Glasboden, um den optischen Zugang zum Hippocampus zu ermöglichen. (B). Schematische Beschreibung der Zubereitung, die die relative Position der bildgebenden Kanüle, einer CA1 PN und der drei Faserschichten von dorsal bis ventral hervorhebt. (C, D). Schematische Beschreibung des Bildgebungs-Setups (C) und der Tierfixierung (D) während einer Bildgebungssitzung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Längsbildgebung der dendritischen Struktur und dendritischen Stacheln Dynamik. (A). 2P-Bildstapel (Maximum Intensity Projection (MIP) von 59 Bildebenen, 2 m z-Abstand) von Neuronen und Dendriten, die von GFP in einer live beschrifteten Thy1-GFP-Maus beschriftet sind. (B). Höhere Vergrößerung (MIP von 53 Bildebenen, 1 m z-Abstand) mit den in SO gelegenen Basaldendriten. (C). Zeitraffer-Bildsequenz eines dendritischen Segments, das über 14 Tage abgebildet ist. Pfeilspitzen zeigen dendritische Stacheln an, die über 14 Tage verfolgt wurden. (D, E). 2P-Bildstapel von Neuronen und Dendriten, die von GFP in einer lebenden Thy1-GFP-Maus gekennzeichnet sind; (D) ZY-Projektion (31 Bildebenen, 3 m z-Abstand) und (E) XY-Projektionen (17 Bildebenen, 3 m z-Abstand). (F). Höhere Vergrößerung (einzelne Bildebene) Detaillierung apikalden Dendriten und dendritischen Stacheln in SR. Pfeilspitzen zeigen dendritische Stacheln. Anregung: 920 nm; Emissionsspitze: 510 nm. Skalenbalken: A, 50 m; B, 10 m; C, 2 m; D und E, 15 m; F, 4 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Längsbildgebung der aktivitätsevozierten Plastizität. (A). 2P-Bilder (einzelne Bildebenen) von einer Live-Maus, die die gleichen Zellen am Baseline Tag 0 und nach EE an Tag 1zeigt. (B). 2P-Bildstapel (MIPs von 4-6 Bildebenen, 3 m z-Spacing) mit E-SARE-Aktivierungsmustern speziell für Umgebung A (Tage 1, 19 und 25) und Umgebung B (Tage 7 und 13). Grün: d2Venus Fluoreszenz. Rot: TurboFP635 Fluoreszenz. Anregung: 920 nm; d2Venus Emissionsspitze: 530 nm; TurboFP635 Emissionsspitze: 635nm. Skalenbalken: A, 20 m; B, 10 m. Diese Zahl wurde von Attardo et al., 201835geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Bildgebung der neuronalen Struktur im Hippocampus DG mittels Dreiphotonenmikroskopie (3P). (A-H). 3P-Bilder (Einzelbildebenen) von Neuronen und Dendriten, die von GFP in einer live beschrifteten Thy1-GFP-Maus (A-E) PNs in den CA1- und (F-H)-Granulatzellen in der GD gekennzeichnet sind. Anregung: 1400 nm; Emissionsspitze: 510 nm. Maßstabsleiste: 40 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzender Film 1: Bildgebungsfeld in einer Live-Thy1-GFP-Maus. 2P-Bildstapel (83 Bildebenen, 7 m z-Abstand) von Neuronen und Dendriten, die durch GFP (weiß) beschriftet sind, in einer lebenden Thy1-GFP-Maus, die sich vom Boden der Kanüle bis zu SLM erstreckt. Um den Zerfall des Fluoreszenzsignals mit zunehmender Tiefe zu berücksichtigen, verwendeten wir einen nichtlinearen Gradienten des Verstärkungsgewinns von Photomultiplierröhren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzender Film 2: Bildgebung der aktivitätsbeschworenen Plastizität. 2P-Bildstapel (28 Bildebenen, 3 m z-Abstand) von Neuronen, die E-SARE-Reporter mit IEG-Expression in einer Live-Maus ausdrücken, die SP. Grün: d2Venus fluoreszenz. Rot: TurboFP635 Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Hier wird ein Verfahren zur wiederholten 2P-Bildgebung der dorsalen CA1 bei lebenden Mäusen beschrieben. Nach der Operation erholt sich die Maus in der Regel innerhalb von 2 Tagen. Das Verfahren induziert minimale Astrogliose26,43. Blutungen und Ödeme, die auf die Operation folgen könnten, werden in der Regel innerhalb von 10 bis 14 Tagen erneut adsorbiert. In der Regel ist das Präparat ab 14 Tagen nach der Implantation ausreichend klar, um eine intravitale Bildgebung durchzuführen. Der Erfolg der Operation hängt nicht von der Arbeit in einer sterilen Umgebung ab. Es ist jedoch entscheidend, ein hohes Maß an Hygiene aufrechtzuerhalten, um Komplikationen aufgrund von chirurgisch-assoziierten Infektionen zu vermeiden. Dies wird durch eine sorgfältige Reinigung der chirurgischen Instrumente vor und nach der Operation und durch Wärmesterilisation unmittelbar vor jeder Anwendung (Schritt 2.1.1) erreicht. Die optische Kanüle wird in einem sauberen, sterilisierten Behälter aufbewahrt und kurz vor der Implantation mit steriler Saline abgeführt. Die Durchführung gängiger chirurgischer Praxen der Händedesinfektion und Reinigung der chirurgischen Station ist ebenfalls sehr wichtig. Das Präparat bleibt stabil und ermöglicht eine zelluläre und subzelluläre Auflösung simperge Für mehrere Wochen26,35.
Kritische Schritte, Änderungen und Fehlerbehebung.
Es ist wichtig, die äußere Kapsel zu schälen, bis die tiefsten Fasern freigelegt sind. Wenn der Alveus nicht entlarven wird, kann dies dazu führen, dass er sich nicht auf den Soma von PNs konzentrieren kann, oder in einer reduzierten Auflösung, die dendritische Stacheln abbilden, wenn kommerzielle Ziele mit 3- oder 4-mm-WD verwendet werden. Zu diesem Zweck ist es sinnvoll, den Neocortex sehr langsam mit einer Nadel mit 0,9 mm Durchmesser abzustreifen und dann auf eine 0,3-0,5 mm Durchmessernadel (24-29 Gauge) umzuschalten, um eine feinere Kontrolle der Absaugung beim Entfernen der dorsalsten Fasern zu erhalten. Alternativ können feine Zangen verwendet werden, um den verbleibenden Kortex nach der Faserexposition36zu entfernen.
Blutungen während der Operation können problematisch sein, da Blut die Sicht versperrt. Es wird empfohlen, auf die Bildung des Gerinnsels zu warten und dann mit Derinline zu spülen, um Restblut wegzuwaschen. Wiederholen Sie dies bei Bedarf.
Eine enge Passform zwischen kanülen und der Kraniotomie trägt dazu bei, die Stabilität der Zubereitung zu erhöhen, indem die Kanüle vor dem Auftragen des Zements an Ort und Stelle gehalten wird, besonders wenn der äußere Rand der Kanüle mit dem Schädel bündig ist. Da die Größen des Trephinbohrers und der Kanüle aufeinander abgestimmt sind, kann eine lockere Passform aufgrund von Unregelmäßigkeiten an der Kanüle - die etwas größere Craniotomien erfordern (siehe Schritt 2.3.14) - oder einer unregelmäßigen Kraniotomie entstehen. Alle Kanülenunregelmäßigkeiten müssen abgelegt werden (Schritte 1.3 und 1.12) und das Trephin muss senkrecht zum Schädel gehalten werden, bis die Kraniotomie abgeschlossen ist (Schritt 2.3.12). Das Entfernen des Trephins aus dem Schädel, bevor die Kraniotomie abgeschlossen ist, kann zu unregelmäßigen Craniotomien führen.
Einschränkungen- Invasivität und Stabilität des Präparats.
Es ist schwierig, die Wirkung der kortikalen Ablation zu bewerten, da es mühsam ist, die betroffenen Gebiete direkt und indirekt genau zu definieren. Im Allgemeinen entfernt die Operation einen Teil des parietalen Kortex und einen Teil des visuellen und hinteren Sinnesrinds21. Der ablated Kortex projiziert nicht direkt auf den Hippocampus und Hippocampusgewebe wird weder berührt noch verletzt. Wichtig ist, dass die Implantation einer bildgebenden Kanüle die Hippocampusfunktion und insbesondere das hippocampalabhängige Lernennichtgrob verändert. 39. Dennoch wäre es wichtig zu quantifizieren, inwieweit sowohl die Kanüle als auch der äußere Teil des Implantats (Kopfhalterplatte und Zahnacrylkappe) chronische Stressoren sind, indem man die Corticosteron-Blutspiegel und das Nebennierengewicht im Vergleich zu unimplantierte Mäuse.
Die Zubereitung bleibt in der Regel von Wochen bis Monaten stabil26. Langfristig neigen Haut- und Knochenwachstum dazu, die Acrylkappe zu verdrängen und die Instabilität der bildgebenden Zubereitung zu erhöhen.
Optische Einschränkungen.
Herkömmliche 2P-Mikroskopie ermöglicht die Bildgebung bis zu etwa 1 mm tief in neokortikales Gewebe40,41. In Übereinstimmung damit ist es möglich, Dendriten und dendritische Stacheln im SR (Abbildung 2D-F) oder SLM36abzubilden. Die Bildgebung durch eine Kanüle stellt jedoch Einschränkungen für die effektive NA dar. Um die maximale Auflösung zu erreichen, sollten Durchmesser und Tiefe der bildgebenden Kanülen auf die bildgebende NA abgestimmt werden, da kleinere Durchmesser und längere Tiefen das Licht von hohen NA-Objektiven abschneiden. Bei der Bildgebung mit einem 1,0 NA-Wassertauchobjektiv durch eine 1,6 mm lange Kanüle wird beispielsweise ein Innendurchmesser von 3,65 mm benötigt, um die volle NA zu halten. Jedoch, mit einer Kanüle dieses Durchmessers wird die Kompression auf dem Hippocampus erhöhen und könnte die Gesundheit des Gewebes beeinflussen, aus diesem Grund verwenden wir eine Kanüle mit einem kleineren Durchmesser. Bei der Bildgebung mit einem Wassertauchobjektiv von 0,8 NA durch eine 1,6 mm lange Kanüle würde ein Innendurchmesser von 2,5 mm ausreichen, um die volle NA zu halten. Allerdings haben 0,8 NA-Wassertauchziele eine kürzere WD (3 mm in unserem Fall), die verhindern kann, dass sie sich auf den SP konzentrieren.
Diese Berechnungen gelten für die Mitte des Sichtfeldes am unteren Rand der Kanüle. Das seitliche Verschieben des bildgebenden Sichtfeldes - näher an den Rändern der Kanüle - oder die tiefere Fokussierung in das Gewebe - weiter von der Glasoberfläche der Kanüle entfernt - verringert jedoch die effektive NA an der Brennebene weiter und reduziert so die Auflösung. Dies führt zu einer nicht homogenen Auflösung über die verschiedenen Volumina des abgebildeten Gewebes hinweg und kann ein Problem für die quantitative Bildgebung bei subzellulärer Auflösung sein, insbesondere bei der Verwendung von Super-Resolution-Techniken wie der 2P-STED-Mikroskopie42. Diese Probleme sind weniger wichtig, wenn es um die Bildgebung bei zellulärer Auflösung geht.
Gewebebewegung.
Die Bewegung im Gewebe - die von Atmung und Herzschlag bei anästhesierten Tieren herrühren - neigt dazu, mit zunehmender Entfernung von der bildgebenden Kanüle schwerer zu werden. Dies liegt möglicherweise daran, dass die bildgebende Kanüle mechanischen Druck auf das Gehirn ausübt und somit einen Teil der Bewegung in der Nähe der Kanüle entgegenwirkt (ähnlich wie neokortikale Präparate). Obwohl die Abbildung von dendritischen Stacheln in SR und SLM in unseren Händen möglich ist, ist sie in unseren Händen am robustesten dorsal bis zur SO bis zu 200 m von der Oberfläche der Kanüle entfernt. Um Die Bewegung zu kompensieren, verwenden wir Resonanzscanner und Offline-Mittelung. Mehrere Bilder (4 bis 6 Wiederholungen) werden pro Bildebene eines Z-Stacks mit der maximal verfügbaren Geschwindigkeit (30 Frames/s) aufgenommen. Alle Wiederholungen für jede Z-Ebene werden dann dekonvolved (mit der kommerziellen Software, AutoQuant), registriert (mit ImageJ) und gemittelt in einem einzigen Bild26. Für die Abbildung von Somata ist die Bewegung bei Anästhesie oft vernachlässigbar35 und zwei Durchschnitte reichen oft aus, um Bewegungsartefakte zu kompensieren.
Zukünftige Anwendungen oder Anweisungen der Methode .
Die Zubereitung kann mit Mikroendoskopen26,43kombiniert werden. Mikroendoskope sind starre optische Sonden, die Gradienten-Refractive Index (GRIN)-Mikrolinsen verwenden, um Licht zu und von tiefem Gewebe zu leiten18. Die Verwendung von Mikroendoskopen ermöglicht Kanülen mit kleineren Durchmessern oder gar keine Kanülen. Kommerzielle Mikroendoskope sind jedoch weniger gut für optische Aberrationen korrigiert und haben niedrigere NA als kommerzielle Ziele. Die Stromsonden erreichen seitliche und axiale Auflösungen von 0,6-1 m, 10-12 m bzw.17,18,44. Der Einsatz von Mikroendoskopen ermöglicht auch die Kombination dieser Zubereitung mit kopfmontierten integrierten Weitfeldmikroskopen45,46,47.
Die Methode eignet sich auch in nicht-anästhesierten Mäusen zu verwenden, und es wurde verwendet, um zelluläre Aktivität mit Ca2+ Sensoren in wachen Kopf-fixierten Mäusen21,37,48,49zu untersuchen. In diesen Fällen ist es aufgrund der schnellen Zeitskalen der Fluoreszenzänderungen ratsam, die Zeilenregistrierung50zu implementieren. Es ist auch möglich, die Vorbereitung für die Bildgebung anderer Hippocampus-Unterregionen wie den tate gyrus (DG)39,51,52anzupassen. Durch die Kombination dieses Präparats mit 3P Anregung53,54 mit 1 MHz Frequenz pulsiertlaser auf 1400 nm abgestimmt, waren wir in der Lage, tiefer in die Hippocampus-Formation zu bilden, die die molekulare Schicht, Granulat-Zell-Schicht und die der GD (Abbildung 4), ohne die überlagernde CA1 zu entfernen.
Zusammenfassend stellen wir eine Methode vor, die einen optischen Zugang zum dorsalen Hippocampus ermöglicht und längs- und korrelative Untersuchungen der Dynamik der Hippocampusstruktur und -aktivität ermöglicht. Diese Technik erweitert die Möglichkeiten der Analyse der Hippocampusfunktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
U. A. F. wird von der Schram-Stiftung unterstützt; C.-W. T. P. und W. G. werden von der Max-Planck-Gesellschaft unterstützt; L.Y. und R.Y. werden von der Max-Planck-Gesellschaft und dem National Institute of Health (R01MH080047, 1DP1NS096787) unterstützt; A. C. wird unterstützt durch einen RP7-Zuschuss des Europäischen Forschungsrats, der Programme ERANET und I-CORE, des Chief Scientist Office des israelischen Gesundheitsministeriums, des Bundesministeriums für Bildung und Forschung, Roberto und Renata Ruhman, Bruno und Simone Lich, Nella und Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, das Henry Chanoch Krenter Institute for Biomedical Imaging and Genomics, The Israel Science Foundation the Perlman Family, Adelis, Marc Besen, Pratt und Irving I. Moskowitz stiftung; A. A. wird von der Max-Planck-Gesellschaft, der Schram-Stiftung und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt. Die 3P-Bilder wurden während des Advanced Course on Neuroimaging Techniques am Max-Planck-Florida-Institut für Neurowissenschaften aufgenommen. Der Advanced Course on Neuroimaging Techniques wird von der Max-Planck-Gesellschaft, dem Florida State Max-Planck Scientific Fellowship-Programm und dem Max-Planck-Institut unterstützt. Wir danken Thorlabs, Coherent und SpectraPhysics für die Unterstützung und Ausrüstung für das 2P / 3P Bildgebungssystem während des Kurses. Wir danken auch Henry Haeberle und Melissa Eberle für die Unterstützung des Systems während des Kurses.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
| MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
| MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
| Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
| Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
| Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
| Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
| Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
| UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
| UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
| Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
| Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
| Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
| Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
| Graefe Forceps - Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
| MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
| Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill - 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
| Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
| Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
| 3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
| Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
| Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
| Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
| Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
| Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
| Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
| Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
| CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
| Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
| KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
| Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
| Absorption Triangles - Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
| Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
| Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
| Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
| Blunt needles 0.9x23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
| Blunt needles 0.5x42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
| Blunt needles 0.3x23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
| Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
| Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
| Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
| Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
| Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
| Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
| Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
| Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
| 7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
| Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
| RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
| S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
| Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
| X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
| Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
| Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
| Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
| Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
| LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
| XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
| Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
| Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
| Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |
References
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