Summary
Цель этого протокола заключается в том, чтобы показать, как загрузить CFDA на различные участки нижней части Арабиопсис. Затем мы представляем результирующий шаблон распределения CF в побегах.
Abstract
Симпластический трассировщик 5 (6)-carboxyfeceв диацетат (КФДА) широко применяется в живых растениях, чтобы продемонстрировать межклеточные связи, флоэмы транспорта и сосудистой паттерн. Этот протокол показывает движение снизу к началу карбоксефлюфторисеин (CF) движения в арабидопсис , используя корень-резки и гипокотиля-щипать процедуры соответственно. Эти две различные процедуры приводят к различной эффективности движения CF: около 91% появление CF в побеги с гипокотиля-щипать процедуру, в то время как только около 70% появление CF с корневой процедурой. Простое изменение загрузочных участков, приводящее к существенным изменениям в мобильной эффективности этого симпластикового красителя, предполагает, что движение CF может подлежать симпластическому регулированию, скорее всего, на основе корневого-гипокотилового соединения.
Introduction
Многие флуоресцентные индикаторы с диапазоном спектральных свойств, таких как 5 (6)-carboxyfluorescein (CF)1, 8-гидроксипирен-1, 3, 6-трисульфонная кислота2, ЛЮЦИФЕР желтый CH (lych)3, esculin и cter4, были разработаны и применяется в растениях для контроля за симпластическим движением и активностью флоема. Как правило, симпластмассовый краситель загружается в разрез в целевой ткани и последовательное рассеивание репортера в другие части растения продемонстрирует межклеточные связи. Хотя механизм поглощения красителя до конца не изучен, широко признается принцип, лежащий в основе движения CF внутри живых клеток. Эстер форме CF (CF диацетат, CFDA) не флуоресцентные, но мембраны проницаемой. Это свойство позволяет быстрое распространение мембраны красителя в клетки. Оказавшись внутри живые клетки, внутриклеточные эстеразы удалить ацетат групп на 3 ' и 6 ' положение CFDA, выпуская флуоресцентные и мембранно-непроницаемой CF (рис. 1, в качестве альтернативы относятся Райт et al.2); CF может после этого двинуть через плазмодесмами к другим частям заводов.
Хорошо налаженная процедура с CFDA является то, что он может быть загружен в исходный лист и используется для мониторинга флоэмы потокового и флоэмы разгрузки в тканях раковины многих видов, например, как разгрузка CF в корень арабидопсис 5, флоэмы разгрузки во время картофельной бугорка6, флоэмы разгрузки в никотиана раковина листья7, и так далее. Подобными погрузочные подходы, другие исследования приняли этот краситель, чтобы продемонстрировать симпластическую связь между хозяином и паразитами8,9, или выявить симбиотические отношения10,11.
Еще один способ сделать использование этого красителя является загрузка его в конкретных ячеек или одной ячейки путем микроинъекции, чтобы определить его структуру распределения. Такие сложные методы значительно облегчили наше более глубокое понимание плазмодесмами-опосредованной межклеточной коммуникации, особенно в развитии концепции симпластикового домена12,13. Например, Микроинъекция КФДА в котиледонские клетки арабидопсис привела к появлению красителя-сцепления в гипокотилном эпидермисе, но неувязке в базовых клетках или в корневых эпидермисе, поэтому гипокотиловый эпидермис образует симпластический домен14. Похожие домены, такие как устьиные клетки охраны15, сито элемент-компаньон клетки16, корень волосяных клеток14 и корень крышка17,18 были определены методом микроинъекций. Самое удивительное, некоторые домены позволяют трассирующими молекулам двигаться в определенном направлении. Возьмите трихоме домена, например, микроинъекции флуоресцентного зонда в поддерживающей эпидермального ячейки приводит к потоку трассирующими в домен трихома, однако, обратная инъекция не держит true19. В недавнем отчете также обнаружены аналогичные ситуации в симпластичных доменам20- и эмбрионов седума. Таким образом, все вышеперечисленные случаи подразумевают, что замена загрузочных участков может привести к новым озарению в симпластическую коммуникацию. Наш предыдущий эксперимент, направленный на рассечения маршрута от корня до стрелять мобильных глушителей определили Роман симпластический домен, или HEJ (гипокотиля-эпиотилового соединения) зона, которая была дополнительно проверена через корневой нагрузки (неканонической мойки нагрузки) CFDA эксперимент21. Здесь, мы далее разрабатывать корень-к-стрелять CF движение с помощью простого метода и восстановить потенциальную симпластмассовый домен путем переноса загрузки сайтов. Кроме того, эта процедура может быть адаптирована для различения генетических фонов, которые изменили корень-к-стрелять междугородной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. арабидопсис вертикальный рост в MS средний
- Интерьер ламинара кабинета потока необходимо рассматривать с 30 мин УФ-светом и 15 мин воздуха перед использованием. Убедитесь в том, чтобы закрыть стеклянную дверь, когда УФ свет идет. Спрей все инструменты и пластины с 70% этанола перед размещением их в шкафу.
- Подготовка Murashige и Skoog (MS) средний в стандартной 90 мм диаметром чашки Петри под ламинаровый шкаф потока.
Примечание: MS среды содержит следующие компоненты: 20,6 mM н.4No3, 18,8 mm kno3, 1,25 mM х2PO4, 1,5 mm Mgso4· 7h2, 3 мм КАГЛ2· 2H2o, 0,1 mm мнсо4· H2o, 1,03 мкм на2му4· 2H2o, 0,1 mmH 3Бо3, 30 мкм Знсу4· 7h2o, 0,1 мкм кузо4· 5H2o, 0,1 мкм Кокл2· 6h2o, 1,39 мкм ки, 97 μ M FeSO4 · 7H2O, 114,5 мкм этилендиакинетическая кислота (ЭДТА), 4,07 мкм никотиновая кислота, 2,44 мкм Пирдоксин совместимого, 0,15 мкм тиамина совместимого, 2,68 mm глицин, 555 мкм миоинозитол, 87,7 mm сахароза и 10 г/л агар. - Увлажняют стерилизованные советы или зубочистки, касаясь кончика или зубочистки на носитель MS, затем опустите стерилизованные семена по одному на фиксированное положение каждой чашки Петри, указанной семенными картами.
- Печать чашку Петри с парафин пленки и липкой лентой и поместить его вертикально на четкую позицию в комнате роста (22 ° c, 70% влаги) с дневного цикла 16 ч света и 8 ч тьмы (освещение с 6 утра до 10 вечера). Арабидопсис завод готов к загрузке CFDA на день 9-13 после посева.
Примечание: Следующая процедура выполняется во второй половине дня с 14:00 до 17:00.
2. CFDA нагрузки с процедурой корневой резки
- Подготовьте новое рабочее решение CFDA непосредственно перед использованием. Разбавить 1 мм CFDA складе решение хранится в-20 °C Морозильник с стерильной ультраапертуры воды для рабочей концентрации 5 мкм.
- Вырезать микро-пористой пленкой парафин пленки (см. таблицу материалов) на мелкие кусочки 3 мм х 3 мм размер.
- Раскройте заводы в комнате на 22 °C и очистит избыток влаги с бумажным полотенцем. Поместите маленькие кусочки пленки ниже каждого корня.
Примечание: от этого к шагу 2,6, весь процесс должен быть завершен в течение 15 минут. - Поднимите растения на крышку чашки Петри. Отрежьте корни в положении около 5-10 мм ниже корня-гипокотилового соединения. Поместите стрелять часть обратно на пленку на среде.
- Осторожно нанесите 0,25 мкл CFDA на передний конец каждого корня под рассеивающей микроскопом. Избегайте брызг на другие части растения.
- Обложка пластины и оставить растения под светом для 2-3 h (22 ° c) в комнате роста.
- Промыть окрашенных растений три раза последовательно в трех отдельных байдарочников заполнены с дистиллированной водой, а затем наблюдать растений под стерео-флуоресцентного микроскопа с увеличением масштаба от 1,4 x до 3,3 x (см. таблицу материалов). Для обнаружения флуоресценции используйте куб фильтра высокой эффективности (возбуждение 470/20 Нм, раскол 495 нм и выброс 525/50 Нм), установленный для передачи сигнала флуоресценции.
3. CFDA нагрузка с гипокотиля-щипать процедуры
- Подготовьте новое рабочее решение CFDA непосредственно перед использованием. Разбавить 1 мм CFDA складе решение хранится в-20 °C Морозильник с стерильной ультраапертура воды (см. таблицу материалов) для рабочей концентрации 5 мкм.
- Вырезать микро-пористой пленкой парафин пленки (см. таблицу материалов) на мелкие кусочки 3 мм х 3 мм размер.
- Раскройте заводы в комнате на 22 °C и очистит избыток влаги с бумажным полотенцем.
Примечание: от этого к шагу 3,7, весь процесс должен быть завершен в течение 15 минут. - Положите небольшой кусочек пленки под корень-гипокотиловый перекресток каждого растения.
- Используйте щипцы, чтобы аккуратно ущипнуть гипокотиля рядом с корневой гипокотиловый узел под Рассекающий Микроскоп.
- Осторожно нанесите 0,1 мкл CFDA на рану на участке под рассеивающей микроскопом. Избегайте брызг на другие части растения.
- Обложка пластины, и оставить растения под светом (22 ° c) для 2-3 h.
- Промыть окрашенных растений три раза последовательно в трех отдельных байдарочников заполнены с дистиллированной водой, а затем наблюдать растений под стерео-флуоресцентного микроскопа с увеличением масштаба от 1,4 x до 3,3 x (см. таблицу материалов). Для обнаружения флуоресценции, установите кубик фильтра высокой эффективности (470/20 Нм возбуждение, 495 нм раскол и 525/50 Нм излучения) для передачи сигнала флуоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Симпластиковое движение часто подвергается экологическим колебаниям. Возмущение растения растущего государства, и даже процесс подготовки тканей повлияет на ограничение размера отчуждения плазмодесмами, влияя тем самым на симпластический транспорт22. Для улучшения окрашивания эффективность, мы ограничиваем нашу работу в комнате роста, где температура и влажность плотно контролируется, а также выполнять всю процедуру как можно быстрее (в идеале в течение 10-15 мин после подъема крышку чашки Петри). Эти меры предосторожности во время эксперимента может эффективно снизить темпы неудачной съемки окрашивания.
Мы описали два несколько различных процедур для демонстрации CF стрелять-Уорд движения. Нормальн, обе процедуры могут вести к пятнать CF в побегах около 2 h после подавать (Диаграмма 2). Тем не менее, эти две процедуры дают различную эффективность окрашивания. Гипокотиля-щипать процедура приводит к 91% окрашивания эффективности, в то время как корень резки процедура производит 70% ( т-тест Уэлч, p < 0,001) (рис. 3). Мы также попытались загрузить краситель методом root-щипать и обнаружили еще более низкую эффективность окрашивания по сравнению с методом корневого резки, предполагая, что подход к загрузке красителя в корне не учитывает окрашивание разницы между корнем и гипокотилем загрузки участков (рис. 3). Сигнал CF главным образом найден в сосудах, но только немногие заводы показывают половин-лист образец (Рисунок 2) как увидено в других моделях макромолекула движения21. Как только сигнал CF распространен к съемке, его можно поддерживать для больше чем 72 h и сигнал не может выгрузить более далее к другим типам клетки; Это согласуется с ранее опубликованными результатами17.
Рисунок 1 : Схематическая иллюстрация для поглощения CFDA и движения CF в клетках завода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 2 : CF сигнал в побегах 9, 11 и 13 день после посева (DAS) Арабидопсис растениями. Сигнал CF может быть обнаружен как в котиледонс, так и в настоящих листьях (A, B, C). В большинстве растений, сигнал CF наблюдается в сосудах после 2-3 часов загрузки либо корень резки или гипокотиля-щипать метод. Только в очень редких случаях (менее 0,5%), гипокотиловый метод щипать может генерировать Частичное окрашивание в котыледоне 7 DAS арабидопсис (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 3 : Окрашивание эффективности методом корневой нагрузки (корень-резка и корень щипать) и гипокотиля-щипать метод. Окрашивание эффективности в 9 установках DAS было определено в трех независимых экспериментах (n = 26 в корне ущемляющего эксперимента; n = 335 в эксперименте по искоренению корня; n = 522 в методе гипокотиля-щипать). Панель ошибок указывает на стандартную ошибку. Указывает р < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Новые исследования показали, что растения могут быстро реагировать на внешние раздражители23, в том числе манипуляции, введенные в экспериментальных процедур22. В нашем первоначальном эксперименте, наш надзор за этими знаниями часто приводит к окрашиванию неудачи. С помощью этих уроков, мы предлагаем, что следующие меры предосторожности следует иметь в виду при выполнении этого эксперимента: (1) семена после сбора урожая должны храниться в шкафу для хранения установлен на низкую температуру и низкую влагу; (2) манипулирование растениями, особенно воздействием воздуха в кабинете, должно быть сведно к минимуму; (3) экспериментальные условия должны оставаться неизменными, например, все процедуры должны выполняться в комнате роста.
Еще один аспект этого эксперимента, который необходимо отметить, заключается в том, что объем загрузки CFDA должен быть как можно более малым. Избыточное решение часто приводит к артефактам, в которых избыток CFDA решение может диффундировать до стрелять через капилляры действия, тем самым тонирование трихом молодых листьев раковины. Хотя этап стирки перед визуализацию может уменьшить этот артефакт, оптимальным подходом является загрузка минимального количества, чтобы избежать осложнений, вызванных избыточным решением.
С помощью этих технических мер предосторожности, корень-к-стрелять движения CFDA может быть стабильно наблюдается, как показано на рисунке 2. Когда растения растут старше, скажем, в течение 24 дней, арабидопсис растения, кажется, теряют способность передавать CF к съемке, для которых мы еще не нашли точного объяснения. Одна возможная подсказка исходит от внутриклеточного накопления. Согласно отчетам Райт et al.2, CF подлежит секвестрации вакуолами, следовательно, внутриклеточный свободный CF над курсом трансикации уменьшает постепенно к улавливание в более больших вакуолам стареющих растений.
Одной из очевидных особенностей этой процедуры является распределение картины CF в съемках. Это сосудистая картина напоминает те, путем загрузки красителя в исходном листе1,24,25, что приводит к иллюзии, что краситель также движется через phloem. В самом деле, снизу к началу трансикации CF не может быть достигнута через флоэмы, учитывая тот факт, что корень сильного раковина ткани и шутвард движение CFDA идет вразрез с флоэмы потокового. Скорее, этот процесс может быть облегчен транспортом ксилема, как показано Botha et al.25. Кратко, CFDA могут быть приняты до через сосуды ксилема, обрабатываются в паренхимы клетки и далее преобразовано в сито элемента флоэмы поток25. Таким образом, нагрузочный эксперимент таким способом может не отражать активность phloem, но симпластиковое движение CF должно произойти, поскольку сильная флуоресценция может быть обнаружена. Другими словами, это движение снизу к началу CF может быть результатом комбинированного транспорта ксилема и симпластического транспорта через клетки паренхимы.
Симпластический транспорт часто подвергается симпластическому формированию домена13, и при определенных обстоятельствах он отображает однонаправленный транспорт19,20. Один из способов быстрой проверки является сдвиг загрузки сайтов. В самом деле, когда мы разработали этот процесс, используя тот же метод, мы обнаружили, что простое изменение загрузки сайта, от корневой стороны до гипокотиля стороны проксимальных к корневой гипокотиловый узел, приведет к значительному изменению CFDA мобильной эффективности (рис. 3). Дифференциация мобильной связи CF благодаря отчетным местам погрузки предполагает, что корень-гипокотиловый узел является еще одним симпластическим доменом, где образуется симпластический барьер для шутвард сигналов, полученных из корня. Для изучения этой возможности необходима дальнейшая экспериментальная конструкция с другими молекулами.
До сих пор этот простой метод может обеспечить стабильное шутвард движение CFDA. Эту функцию можно дополнительно изучить, чтобы различать растения с нарушенным или усиленным движением корня к выстрелу, которое редко изучалось.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась национальным фондом естественных наук Китая (31671257) и Хубэй совместный инновационный центр для зерновой промышленности (LXT-16-18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KNO3 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017218 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | |
| MgSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013018 | |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 20011160 | |
| MnSO4·H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013418 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10019818 | |
| Boric Acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10024018 | |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10008218 | |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10007216 | |
| KI | Sinopharm Chemical Reagent | 10017160 | |
| FeSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10012118 | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent | 10009717 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| KOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10017018 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent | 10021418 | |
| Myo-inositol | MACKLIN | I811835 | |
| Nicotinic Acid | MACKLIN | N814565 | |
| Pyridoxine HCl | MACKLIN | V820447 | |
| Thiamine HCl | MACKLIN | T818865 | |
| Glycine | MACKLIN | G800880 | |
| Agar powder | Novon | ZZ14022 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Zoom V16 | |
| Dissecting microscope | SDPTOP | SRE-1030 | |
| 200μl pipette | Dragon Laboratory Instruments | 713111110000-20-200ul | |
| 2.5μl pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Fine forceps | TWEEZERS | ST-15 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM-996 | |
| Stainless steel double-sided blade | Gillette | Platinum-Plus Double-Edge Blade |
References
- Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. 6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation. American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).
- Wright, K. M., Oparka, K. J. The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy. Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport. Planta. 176 (4), 533-540 (1988).
- Knoblauch, M., et al. Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications. Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).
- Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis. The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).
- Viola, R., et al. Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading. The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).
- Roberts, A. G., et al. Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus. The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).
- Péron, T., et al. New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel). Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).
- Spallek, T., et al. Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).
- Complainville, A., et al. Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species. The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).
- Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules. Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).
- Robards, A. W., Lucas, W. J. Plasmodesmata. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).
- Roberts, A. G., Oparka, K. J. Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).
- Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).
- Palevitz, B. A., Hepler, P. K. Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow. Planta. 164 (4), 473-479 (1985).
- van Bel, A. J. E., Kempers, R. Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems. Planta. 183 (1), 69-76 (1991).
- Erwee, M. G., Goodwin, P. B. Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch. Planta. 163 (1), 9-19 (1985).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).
- Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata. Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).
- Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae). Planta. 245 (3), 491-505 (2017).
- Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement. Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).
- Radford, J. E., White, R. G. Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits. Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).
- Kollist, H., et al. Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network. Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).
- Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley. Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).
- Botha, C. E. J., et al. A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis? Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).
