Summary
该协议的目的是展示如何将 CFDA 加载到拟南芥底部的不同部位。然后给出了在芽中产生的 CF 分布模式。
Abstract
对塑性示踪剂 5 (6)-羧基荧光素二乙酸酯 (CFDA) 已广泛应用于活植物中, 以证明细胞间的连接、韧皮部的迁移和血管模式。该方案分别采用根切法和下胚切法显示拟南芥中的底部到顶部羧基荧光素 (cf) 运动。这两个不同的程序导致不同的效率 CF 运动: 约91% 的 CF 出现在芽与下胚轴捏过程, 而只有约70% 的外观 CF 与根切割程序。加载位置的简单变化, 导致这种共生染料的移动效率发生重大变化, 这表明 CF 运动可能受到共生调节的影响, 很可能是由根下胚轴连接。
Introduction
许多具有光谱特性的荧光示踪剂, 如 5 (6)-羧荧光素 (CF)1、8-羟基苯甲酸1、3、6-三硫基苯甲酸2、路西奥黄 CH(lsch) 3、ES奎因和 cter4, 已经开发出来,应用于植物中, 以监测共体运动和韧皮部的活性。一般情况下, 共生染料被加载到目标组织中的切割中, 记者连续分散到植物的其他部位将证明细胞间的通信。虽然染料吸收的机制还没有得到充分的理解, 但活细胞内 CF 运动的原理已经得到了广泛的认可。CF (CF 二乙酸酯, CFDA) 的酯形态为非荧光, 但膜渗透性。这种特性允许染料快速地将膜扩散到细胞中。一旦进入活细胞, 细胞内酯酶去除 CFDA 3 ' 和 6 ' 位置的醋酸盐基团, 释放荧光和膜不渗透 CF (图 1, 也参考赖特等人 2);然后, CF 可以通过质粒移动到植物的其他部分。
一个既定的程序与 CFDA 是, 它可以加载到源叶, 并用于监测韧皮部流和韧皮部卸载在许多物种的水槽组织, 例如, cf 卸载在拟南芥根5, 韧皮部卸载马铃薯块茎化过程中6、韧皮部卸除在烟叶中, 叶7, 依此类推。通过类似的加载方法, 其他研究采用这种染料来证明宿主和寄生虫8,9之间的共生联系, 或揭示共生关系10,11.
另一种利用这种染料的方法是通过微注射将其加载到特定的细胞或单个细胞中, 以确定其分布模式。这种复杂的技术极大地促进了我们对质粒介导的细胞间通信的更深入理解, 特别是在共生域 12、13 概念的发展过程中。例如, 在拟南芥子叶细胞中注射 cfda 导致下胚轴表皮的染料耦合模式, 但在底层细胞或根表皮中产生非耦合, 因此下胚轴表皮形成共用域14。类似的领域, 如气孔保护细胞15, 筛片元素-伴生细胞16 , 根毛细胞14和根帽17,18已被确定为微注射技术。最令人惊讶的是, 有些领域允许示踪分子向某一方向移动。以滴管域为例, 微注射荧光探针进入支撑表皮细胞, 导致示踪剂流入滴虫域, 但反向注射并不成立 19.最近的一份报告还在Sedum胚胎20的共生域中发现了类似的情况。因此, 所有上述情况都意味着, 交换加载站点可能会导致对共生通信的新见解。我们以前的实验旨在剖析根-拍摄移动沉默的路径确定了一个新的共生域, 或 HEJ (低音节-表观结合部交界处) 区, 这是进一步验证通过根加载 (非规范的正弦加载) CFDA实验21。在这里, 我们进一步阐述根到拍摄 cf 运动使用一个简单的方法, 并通过移动加载站点恢复一个潜在的符号域。此外, 这一程序可以适应区分改变根对镜头长途运输的遗传背景。
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Protocol
1. 多发性能级研究中的垂直生长
- 层流柜的内部需要在使用前使用30分钟的紫外线和15分钟的气流进行处理。当紫外线亮起时, 请务必关闭玻璃门。在将所有工具和板材放入机柜之前, 请先将其喷洒70% 的乙醇。
- 在层流柜下的标准90毫米直径 Petri 培养皿中制备 Murashige 和 Skoog (MS) 介质。
注: MS 介质包含以下组件: 20.6 mM NH 4no3, 18.8 mm kno 3, 1.25 mmKh 2 po 4, 1.5 mm MgSO 4·7H2 o, 3 mm ccl 2·2H o, 0.1mm mnso4·H2 o, 1.03 μMna 2moo4·2h2H,0.1 Mm h 3bo 3, 30Μm znso 4·7h 2 o, 0.1μm cuso 4·5h 2H, 0.1μm cl 2 ·6h 2o, 1.03 m ki, 97μMM2o, 114.5μm 乙二胺四乙酸 (edta), 4.07 微米烟酸, 2.44 微米吡啶辛酯 glycine, 0.15μm 硫胺素 Glycine, 2.44 mm 甘氨酸, 555 微米肌肌醇, 87.7 mm 蔗糖和 10G/l 琼脂。 - 将灭菌的尖端或牙签与 MS 培养基接触, 然后将灭菌的种子一个接一个地浸入播种卡指示的每个培养皿的固定位置, 从而使灭菌的尖端或牙签保湿。
- 用石蜡膜和胶带封住 petri 盘, 并将其垂直放置在生长室内的透明支架上 (22°c, 70% 的水分), 白天周期为16小时的光线和8小时的黑暗 (照明时间为早上6点至晚上 10点)。拟南芥工厂已准备好在播种后的第9-13 天装载美国食品和药物管理局。
注: 下午2点至5点进行以下手术。
2. CFDA 加载与根系切割程序
- 在使用前立即准备新的 CFDA 工作解决方案。将储存在-20°c 冷冻机中的 1 mM CFDA 库存溶液稀释至5μm 的工作浓度。
- 将微孔石蜡膜 (见材料表) 切割成3毫米 x 3 毫米大小的小块。
- 在22°c 的温度下发现房间里生长中的植物, 用纸巾清除多余的水分。将小胶片放在每个根的下方。
注: 从这一步骤2.6 到步骤 2.6, 整个过程应在15分钟内完成。 - 将植物举到培养皿盖上。将根部切割在根-下胚轴交界处下方约5-10 毫米的位置。将拍摄部分重新放到介质上的胶片上。
- 在解剖显微镜下, 小心地将 FFDA 的0.25Μl 应用于每个根部的切割端。避免溅到植物的其他部位。
- 盖上板材, 将植物放在光线下 2-3小时 (22°C) 的生长室。
- 在三个充满蒸馏水的独立烧杯中依次冲洗三次染色植物, 然后在立体荧光显微镜下使用1.4倍至3.3秒的变焦观察这些植物 (见《材料表》)。对于荧光检测, 使用安装的高效滤光片立方体 (470/20 nm 激发、495 nm 分裂和 525/50 纳米发射) 来传输荧光信号。
3. CFDA 负载与低血压夹紧程序
- 在使用前立即准备新的 CFDA 工作解决方案。用无菌的超纯水 (见材料表) 将储存在-20°c 冷冻机中的 1 MM cfda 库存溶液稀释至5μm 的工作浓度。
- 将微孔石蜡膜 (见材料表) 切割成3毫米 x 3 毫米大小的小块。
- 在22°c 的温度下发现房间里生长中的植物, 用纸巾清除多余的水分。
注: 从这一步到3.7 步, 整个过程应在15分钟内完成。 - 在每个植物的根下胚轴结下放置一小块薄膜。
- 使用钳子在解剖显微镜下轻轻捏靠近根下胚轴连接点的下胚轴。
- 在解剖显微镜下, 小心地将 CFDA 的0.1Μl 涂抹在伤口部位。避免溅到植物的其他部位。
- 盖上盘子, 让植物在光线 (22°c) 下保持2-3小时。
- 在三个充满蒸馏水的独立烧杯中依次冲洗三次染色植物, 然后在立体荧光显微镜下使用1.4倍至3.3秒的变焦观察这些植物 (见《材料表》)。对于荧光检测, 安装高效滤光片立方体 (470/20 nm 激发、495 nm 分裂和 525/50 纳米发射) 来传输荧光信号。
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Representative Results
共变运动往往受到环境波动的影响。植物生长状态的扰动, 甚至组织制备过程都会影响质粒的大小排除极限, 从而影响共生体的迁移 22.为了提高染色效率, 我们将操作限制在温度和湿度受到严格控制的生长室内, 并尽快执行整个过程 (最好是在提升培养皿盖后10-15 内)。在实验中的这些预防措施可以有效地降低不成功的拍摄染色率。
我们描述了两个略有不同的程序, 以显示 CF 射击病房的运动。通常情况下, 这两个过程都会导致喂养后2小时左右的芽中的 CF 染色 (图 2)。然而, 这两种程序产生不同的染色效率。下胚轴夹紧程序的染色效率为 91%, 而根切过程的染色效率为 70% (Welch 的t-测试, p < 0.001) (图 3)。我们还尝试用根夹紧法加载染料, 发现与根部切割法相比, 染色效率更低, 这表明将染料加载到根部的方法不能解释根部和下胚轴之间的染色差异(图 3)。CF 信号主要存在于血管中, 但只有少数植物显示半叶模式 (图 2), 如其他大分子运动模式21所示。一旦 CF 信号扩散到拍摄, 它可以保持超过 72小时, 信号不能进一步卸载到其他细胞类型;这与以前公布的结果17 一致.
图 1: CFDA 在植物细胞中的吸收和 CF 运动示意图.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 播种后9、11和13天拍摄的 Cf 信号 (das)拟南芥植物.CF 信号可以在子叶和真叶 (a、 b、 c) 中检测到。在大多数植物中, CF 信号在2-3 小时的加载后, 通过根切或下胚轴夹紧的方法观察到血管。只有在非常罕见的情况下 (小于 0.5%), 下胚轴夹紧法才能在 7 DAS 拟南芥 (d) 的子叶中形成部分染色模式。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 根加载法 (根切和根夹紧法) 和下胚轴夹紧法染色效率.通过三个独立实验确定了 9个 DAS 植物的染色效率 (在根夹紧实验中 n = 26; 在根系切割实验中 n = 335; n = 522 在下胚轴夹持法)。错误栏指示标准错误。表示p < 0.001。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
新出现的研究表明, 植物可以对外部刺激23迅速作出反应, 包括在实验程序中引入的操作22。在我们最初的实验中, 我们对这些知识的监督往往导致染色失败。通过这些教训, 我们建议在进行本实验时应注意以下预防措施: (1) 收获后的种子应存放在低温、低水分的储物柜中;(2) 操纵植物, 特别是暴露在柜子里的空气中, 应保持在最低限度;(3) 实验条件应保持不变, 例如, 所有的程序都应在生长室进行。
这个实验需要指出的另一个方面是, CFDA 的负荷量应该尽可能小。过量的解决方案往往会导致伪影, 在这些产物中, 过量的 CFDA 溶液可以通过毛细管作用扩散到拍摄, 从而使年轻水槽叶的毛状物变色。尽管成像前的清洗步骤可以减少此伪影, 但最好的方法是加载最小量, 以避免因过量溶液而导致的并发症。
通过解决这些技术预防措施, 可以稳定地观察到 CFDA 的根到拍摄运动, 如图 2所示。当植物变老, 比如超过 24天,拟南芥植物似乎失去了将 cf 传递到拍摄的能力, 我们还没有找到确切的解释。一个可能的线索来自于它的细胞内积累。根据 Wright 等人的报告, cf 容易被液泡扣押, 因此, 在移位过程中, 细胞内游离 CF 在老化植物的较大液泡中逐渐减少为固存.
这个过程的一个明显的特点是 CF 在拍摄中的分布模式。这种血管模式让人想起那些通过在源叶1,24,25加载染料, 从而导致一种错觉, 染料也通过韧皮部移动。事实上, CF 的底部到顶部的移位可能无法通过韧皮部实现, 因为根是一个强大的水槽组织, 而 CFDA 的射击运动不利于韧皮部流。相反, 正如 Botha 等人25岁所表明的那样, 木质部运输可能会促进这一进程。简单地说, CFDA 可以通过木质部血管, 在薄壁细胞中处理, 并进一步转移到韧皮部流25的筛子元素.因此, 这种加载实验可能不能反映韧皮部的活性, 但由于可以检测到强荧光, CF 的共变运动必须发生。换句话说, 这种从下到上的 CF 运动可能是由于木质部通过薄壁细胞的联合木质部输运和共生体迁移造成的。
共模传输通常受符号域层13的影响, 在某些情况下, 它表现为单向传输19,20。快速检查的一种方法是转移装载站点。事实上, 当我们使用相同的方法阐述这个过程时, 我们发现加载位置的简单变化, 从根部侧到下胚轴侧近端到根-下胚轴交界处, 将导致 CFDA 移动效率的显著变化 (图 3)。CF 移动分化由于不同的加载位置将表明根下胚轴交界处是另一个共生域, 其中形成了对根衍生射击信号的共生屏障。需要与其他分子进行进一步的实验设计, 以探索这种可能性。
到目前为止, 这种简单的方法可以为 CFDA 提供稳定的射击运动。这一特点可以进一步探索, 以区分植物与妥协或增强的根到拍摄运动, 很少被研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由国家自然科学基金 (31671257) 和湖北粮食产业合作创新中心 (LXT-16-16-18) 资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KNO3 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017218 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | |
| MgSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013018 | |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 20011160 | |
| MnSO4·H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013418 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10019818 | |
| Boric Acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10024018 | |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10008218 | |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10007216 | |
| KI | Sinopharm Chemical Reagent | 10017160 | |
| FeSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10012118 | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent | 10009717 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| KOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10017018 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent | 10021418 | |
| Myo-inositol | MACKLIN | I811835 | |
| Nicotinic Acid | MACKLIN | N814565 | |
| Pyridoxine HCl | MACKLIN | V820447 | |
| Thiamine HCl | MACKLIN | T818865 | |
| Glycine | MACKLIN | G800880 | |
| Agar powder | Novon | ZZ14022 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Zoom V16 | |
| Dissecting microscope | SDPTOP | SRE-1030 | |
| 200μl pipette | Dragon Laboratory Instruments | 713111110000-20-200ul | |
| 2.5μl pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Fine forceps | TWEEZERS | ST-15 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM-996 | |
| Stainless steel double-sided blade | Gillette | Platinum-Plus Double-Edge Blade |
References
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