Summary
Le but de ce protocole est de montrer comment charger la CFDA dans différents sites des parties inférieures de l' Arabidopsis. Nous présentons ensuite le modèle de distribution de CF dans les pousses.
Abstract
Le traceur symplastique 5 (6)-carboxyfluorescéine diacétate (CFDA) a été largement appliqué dans les plantes vivantes pour démontrer la connexion intercellulaire, le transport de phloème et le modelage vasculaire. Ce protocole montre le mouvement de la carboxyfluorescéine de bas en haut (CF) dans l' Arabidopsis à l’aide de la procédure de découpage des racines et de l’hypocotyle-pincement respectivement. Ces deux procédures différentes résultent en différentes efficacités du mouvement des FC: environ 91% de l’apparition de CF dans les pousses avec la procédure d’hypocotyle-pincement, alors que seulement environ 70% de l’apparition de CF avec la procédure de coupe des racines. Le simple changement des sites de chargement, entraînant des changements significatifs dans l’efficacité mobile de ce colorant symplastique, suggère que le mouvement des FC pourrait être soumis à la régulation symplasique, probablement par la jonction racine-hypocotyle.
Introduction
De nombreux traceurs fluorescents avec une gamme de propriétés spectrales, comme l’acide 5 (6)-carboxyfluorescéine (CF) 1,8-hydroxypyrène-1, 3, 6-trisulphonique2, Lucifer Yellow ch (Lych)3, esculine et cter4, ont été développés et appliqué dans les plantes pour surveiller le mouvement symplastique et l’activité de phloème. En général, un colorant symplastique est chargé dans une coupe dans le tissu cible et la dispersion séquentielle du reporter dans d’autres parties de la plante démontrera la communication intercellulaire. Bien que le mécanisme d’absorption des colorants ne soit pas pleinement compris, le principe sous-jacent du mouvement des FC à l’intérieur des cellules vivantes a été largement reconnu. La forme ester de CF (diacétate des FC, CFDA) est non-fluorescente, mais perméable à la membrane. Cette propriété permet la diffusion rapide de la membrane du colorant dans les cellules. Une fois à l’intérieur des cellules vivantes, les estérases intracellulaires éliminent les groupes d’acétate à la position 3 'et 6 'de la CFDA, libérant les CF fluorescentes et imperméables à la membrane (figure 1, alternativement, Wright et al.2); Les FC peuvent alors se déplacer à travers les plasmodesmes vers d’autres parties de plantes.
Une procédure bien établie avec CFDA est qu’il peut être chargé dans les feuilles de source et utilisé pour surveiller le streaming phloème et le déchargement du phloème dans les tissus de l’évier de nombreuses espèces, par exemple, comme le déchargement des FC dans la racine Arabidopsis 5, le déchargement phloème pendant la tuberisation de la pomme de terre6, le déchargement du phloème dans l’évier Nicotiana laisse7, et ainsi de suite. Par des approches de chargement similaires, d’autres études ont adopté ce colorant pour démontrer la liaison symplasique entre l’hôte et le parasite8,9, ou pour révéler les relations symbiotiques10,11.
Une autre façon de faire usage de ce colorant est de le charger dans des cellules spécifiques ou une seule cellule par microinjection pour déterminer son modèle de distribution. De telles techniques sophistiquées ont grandement facilité notre compréhension plus approfondie de la communication intercellulaire médiée par plasmodesmata, en particulier dans le développement du concept de domaine symplastique12,13. Par exemple, la microinjection de CFDA dans les cellules de cotylédons de l' Arabidopsis a entraîné le modèle de couplage de colorant dans l’épiderme de l’hypocotyle, mais sans couplage dans les cellules sous-jacentes ou dans l’épiderme des racines, par conséquent l’épiderme hypocotyle forme une domaine symplastique14. Des domaines similaires, tels que les cellules de la garde stomatale15, les cellules de l’élément-compagnon16, les cellules capillaires14 et la coiffe des racines17,18 ont été identifiés par la technique de la microinjection. Le plus surprenant, certains domaines permettent aux molécules traceurs de se déplacer dans une certaine direction. Prenez le domaine de trichome par exemple, la microinjection d’une sonde fluorescente dans la cellule épidermique de soutien conduit au flux de traceur dans le domaine de trichome, cependant, l’injection inverse ne tient pas vrai19. Un rapport récent a également trouvé des situations similaires dans les domaines symplasiques de l’embryon Sedum 20. Ainsi, tous les cas ci-dessus impliquent que l’échange de sites de chargement peut conduire à de nouveaux aperçus de la communication symplastique. Notre expérience précédente visant à disséquer la voie du silençage mobile de la racine à la pousse a identifié un nouveau domaine symplastique, ou la zone Hej (hypocotyle-épicotyle), qui a été vérifiée par le chargement des racines (chargement de l’évier non canonique) CFDA l’expérience21. Ici, nous élaborons en outre le mouvement de la racine à la pousse des FC en utilisant une méthode simple et de récupérer un domaine symplastique potentiel en déplaçant les sites de chargement. En outre, cette procédure peut être adaptée pour différencier les antécédents génétiques qui ont modifié le transport de longue distance de la racine à la pousse.
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Protocol
1. Arabidopsis croissance verticale dans le milieu MS
- L’intérieur de l’armoire à écoulement laminaire doit être traité avec 30 min de lumière UV et 15 min d’air avant utilisation. Assurez-vous de fermer la porte vitrée lorsque la lumière UV est allumé. Vaporisez tous les outils et plaques avec 70% d’éthanol avant de les placer dans l’armoire.
- Préparer le milieu Murashige et Skoog (MS) dans une boîte de Petri standard de 90 mm de diamètre sous une armoire à flux laminaire.
NOTE: le médium MS contient les éléments suivants: 20,6 mM NH4no3, 18,8 mm kno3, 1,25 mm KH2po4, 1,5 mM MgSO4· 7H2o, 3 mm CaCl2· 2H2o, 0,1 mm MnSO4· H2o, 1,03 μM na2Moo4· 2H2o, 0,1 mm H3Bo3, 30 μm ZnSO4· 7h2o, 0,1 μM CUSO4· 5h2o, 0,1 μM COCl2· 6H2o, 1,39 μm Ki, 97 μ M FeSO4 · 7H2O, 114,5 μM d’acide éthylenediaminetétraacétique (EDTA), 4,07 μM d’acide nicotinique, 2,44 μM de pyridoxine hcl, 0,15 μm de thiamine hcl, 2,68 mm de glycine, 555 μm de myo-inositol, 87,7 mm de saccharose et 10 g/L de gélose. - Hydrater les pointes stérilisées ou les cure-dents en touchant la pointe ou les cure-dents au milieu MS, puis tremper les graines stérilisées une par une sur la position fixe de chaque boîte de Petri indiquée par la carte de semis.
- Sceller la boîte de Petri avec du film de paraffine et du ruban adhésif et la placer verticalement sur un stand clair dans une salle de croissance (22 ° c, 70% d’humidité) avec un cycle de jour de 16 h de lumière et 8 h d’obscurité (éclairage de 6 heures à 22 heures). L’usine Arabidopsis est prête pour le chargement CFDA le jour 9-13 après le semis.
Remarque: la procédure suivante est effectuée dans l’après-midi de 14h à 17h.
2. chargement CFDA avec la procédure de découpe de la racine
- Préparez une solution de travail CFDA fraîche immédiatement avant utilisation. Diluer la solution stock de 1 mM de CFDA stockée dans un congélateur de-20 ° c avec de l’eau ultrapure stérile à une concentration de travail de 5 μM.
- Coupez le film microporeux de la membrane de paraffine (voir tableau des matériaux) en petits morceaux de 3 mm x 3 mm de diamètre.
- Découvrez les plantes qui poussent dans la pièce à 22 ° c et effacez l’excès d’humidité avec une serviette en papier. Placez les petits morceaux de film sous chaque racine.
NOTE: de ceci à l’étape 2,6, l’ensemble du processus devrait être complété dans les 15 min. - Soulever les plantes sur le couvercle de la boîte de Petri. Coupez les racines dans une position d’environ 5-10 mm sous la jonction racine-hypocotyle. Replacez la partie de tournage sur le film sur le support.
- Appliquer avec précaution 0,25 μL de CFDA sur l’extrémité de coupe de chaque racine sous un microscope disséant. Évitez d’éclabousser les autres parties de la plante.
- Couvrir la plaque et laisser les plantes sous la lumière pour 2-3 h (22 ° c) dans la salle de croissance.
- Rincez les plantes colorées trois fois séquentiellement dans trois béchers distincts remplis d’eau distillée, puis observez les plantes sous un microscope stéréo-fluorescence avec un zoom de 1,4 x à 3,3 x (voir le tableau des matériaux). Pour la détection de fluorescence, utilisez un cube filtrant à haut rendement (excitation 470/20 nm, 495 nm divisé et 525/50 nm émission) monté pour transmettre le signal de fluorescence.
3. chargement CFDA avec procédure d’hypocotyle-pincement
- Préparez une solution de travail CFDA fraîche immédiatement avant utilisation. Diluer la solution de stock de 1 mM de CFDA stockée dans un congélateur de-20 ° c avec de l’eau ultrapure stérile (voir le tableau des matériaux) à une concentration de travail de 5 μm.
- Coupez le film microporeux de la membrane de paraffine (voir tableau des matériaux) en petits morceaux de 3 mm x 3 mm de diamètre.
- Découvrez les plantes qui poussent dans la pièce à 22 ° c et effacez l’excès d’humidité avec une serviette en papier.
NOTE: de ceci à l’étape 3,7, l’ensemble du processus devrait être complété dans les 15 min. - Poser un petit morceau de film sous la jonction racine-hypocotyle de chaque plante.
- Utiliser forceps pour pincer doucement l’hypocotyle près de la jonction racine-hypocotyle sous un microscope disséçant.
- Appliquer avec précaution 0,1 μL de CFDA sur le site de la plaie sous un microscope disséant. Évitez d’éclabousser les autres parties de la plante.
- Recouvrir la plaque et laisser les plantes sous la lumière (22 ° c) pour 2-3 h.
- Rincez les plantes colorées trois fois séquentiellement dans trois béchers distincts remplis d’eau distillée, puis observez les plantes sous un microscope stéréo-fluorescence avec un zoom de 1,4 x à 3,3 x (voir le tableau des matériaux). Pour la détection de fluorescence, montez un cube filtrant à haut rendement (excitation 470/20 nm, 495 nm divisé et 525/50 nm émission) pour transmettre le signal de fluorescence.
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Representative Results
Le mouvement symplastic est souvent soumis à des fluctuations environnementales. Perturbation de l’état de culture de la plante, et même le processus de préparation tissulaire affectera la limite d’exclusion de la taille des plasmodesmes, affectant ainsi le transport symplastique22. Pour améliorer l’efficacité de coloration, nous limitons notre fonctionnement dans la salle de croissance, où la température et l’humidité est étroitement contrôlée, et aussi effectuer l’ensemble de la procédure aussi rapidement que possible (idéalement dans 10-15 min après avoir soulevé le couvercle de boîte de Petri). Ces précautions au cours d’une expérience peuvent réduire efficacement les taux de coloration des pousses infructueuses.
Nous avons décrit deux procédures légèrement différentes pour démontrer le mouvement des pousses-pupille des FC. Normalement, les deux procédures peuvent conduire à la coloration des FC dans les pousses environ 2 h après l’alimentation (figure 2). Néanmoins, les deux procédures produisent des rendements de coloration différents. La procédure de pincement de l’hypocotyle entraîne une efficacité de coloration de 91%, tandis que la procédure de coupe des racines produit 70% (test tde Welch, p < 0,001) (figure 3). Nous avons également essayé de charger le colorant par une méthode de pincement de racine et a trouvé une efficacité de coloration encore plus faible par rapport à la méthode de coupe-racine, suggérant que l’approche pour charger le colorant dans la racine ne tient pas compte de la différence de coloration entre la racine et l’hypocotyle des sites de chargement (figure 3). Le signal des FC se trouve principalement dans le vasculature, mais seulement peu de plantes montrent le motif demi-feuille (figure 2) comme on le voit dans d’autres schémas de mouvement de la macromolécule21. Une fois que le signal des FC est propagé à la pousse, il peut être maintenu pendant plus de 72 h et le signal ne peut pas se décharger plus loin à d’autres types de cellules; Cela est conforme aux résultats publiés antérieurement17.
Figure 1 : Illustration schématique de l’absorption de CFDA et du mouvement des FC dans les cellules de la plante. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La figure 2 : Signal CF dans les pousses de 9, 11 et 13 jours après le semis (DAS) Arabidopsis plantes. Le signal CF peut être détecté dans les deux cotylédons et les vraies feuilles (A, B, C). Dans la majorité des plantes, le signal des FC est observé dans la système vasculaire Après 2-3 heures de chargement avec la méthode de coupe des racines ou d’hypocotyl-pincement. Ce n’est que dans un cas très rare (moins de 0,5%) que la méthode de pincement de l’hypocotyle peut générer un motif de coloration partielle dans le cotylédon de 7 DAS Arabidopsis (D). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : L’efficacité de coloration avec la méthode de chargement des racines (root-Cutting et root-pinching) et la méthode d’hypocotyle-pinching. L’efficacité de coloration chez 9 plants de DAS a été déterminée dans trois expériences indépendantes (n = 26 dans l’expérience de pincement des racines; n = 335 dans l’expérience de découpage des racines; n = 522 dans la méthode d’hypocotyle-pincement). La barre d’erreur indique une erreur standard. indique p < 0,001. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Des études émergentes ont montré que les plantes peuvent réagir rapidement aux stimuli externes23, y compris la manipulation introduite dans les procédures expérimentales22. Dans notre expérience initiale, notre surveillance de cette connaissance conduit souvent à l’échec de coloration. Avec ces leçons, nous suggérons que les précautions suivantes doivent être maintenues à l’esprit lors de l’exécution de cette expérience: (1) les semences après la récolte doivent être conservées dans une armoire de stockage réglée à une basse température et à une faible humidité; (2) la manipulation des végétaux, en particulier l’exposition à l’air dans l’armoire, doit être maintenue à un minimum de temps; (3) les conditions expérimentales doivent être maintenues constantes, par exemple, toutes les procédures doivent être effectuées dans une salle de croissance.
Un autre aspect de cette expérience qui doit être souligné est que le volume de chargement de CFDA devrait être maintenu aussi petit que possible. L’excès de solution conduit souvent à des artefacts dans lesquels l’excès de la solution CFDA peut se propager jusqu’à la pousse à travers l’action capillaire, ce qui teintent les trichomes de jeunes feuilles de l’évier. Bien qu’une étape de lavage avant l’imagerie puisse diminuer cet artefact, la meilleure approche consiste à charger un montant minimum pour éviter les complications causées par une solution excédentaire.
Avec ces précautions techniques résolues, le mouvement de la racine à la pousse de CFDA peut être observé de façon stable comme illustré à la figure 2. Lorsque les plantes vieillissent, disons plus de 24 jours, les plantes Arabidopsis semblent perdre la capacité de transmettre les FC à la pousse, pour laquelle nous n’avons pas encore trouvé une explication exacte. L’un des indices possibles provient de son accumulation intracellulaire. Selon les rapports de Wright et coll.2, CF est susceptible d’être séquestré par des vacuoles, par conséquent, les FC libres intracellulaires au cours de la translocation réduit graduellement à la séquestration dans les plus grandes vacuoles des plantes vieillissantes.
Une caractéristique évidente de cette procédure est le schéma de distribution des CF dans le tournage. Ce modèle vasculaire rappelle ceux en chargeant le colorant dans la feuille source1,24,25, conduisant ainsi à une illusion que le colorant se déplace également par le phloem. En fait, la translocation de bas en haut des FC ne peut pas être obtenue par le phloème étant donné que la racine est un tissu d’évier fort et le mouvement de la fusillade de CFDA va à l’encontre du streaming phloème. Ce processus peut plutôt être facilité par le transport du xylème, comme le montre Botha etal. Brièvement, le CFDA peut être repris par les vaisseaux du xylème, traités dans des cellules de parenchyme et translocalisés plus loin à l’élément tamis du cours d’eau du phloème25. Par conséquent, l’expérience de chargement de cette façon peut ne pas refléter l’activité du phloème, mais le mouvement symplastique des FC doit se produire comme la forte fluorescence peut être détectée. En d’autres termes, ce mouvement des FC de bas en haut peut résulter du transport combiné du xylème et du transport symplastique par les cellules du parenchyme.
Le transport symplastique est souvent soumis à la formation de domaine symplastique13et, dans certaines circonstances, il affiche un transport unidirectionnel19,20. Une façon de vérifier rapidement est de déplacer les sites de chargement. En effet, lorsque nous avons élaboré ce processus en utilisant la même méthode, nous avons constaté que le simple changement de site de chargement, du côté racine au côté hypocotyle proximale à la jonction racine-hypocotyle, entraînerait un changement significatif de l’efficacité mobile de CFDA (figure 3). La différenciation mobile des FC due aux sites de chargement distincts suggérerait que la jonction racine-hypocotyle est un autre domaine symplastique, où la barrière symplasique est formée pour les signaux tirés de la fusillade des racines. Une autre conception expérimentale avec d’autres molécules est nécessaire pour explorer cette possibilité.
Jusqu’à présent, cette méthode simple peut fournir un mouvement de fusillade stable de CFDA. Cette caractéristique peut être étudiée plus avant pour distinguer les plantes avec le mouvement de racine-à-pousse compromis ou amélioré qui a rarement été étudié.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la Fondation nationale des sciences naturelles de la Chine (31671257) et le centre d’innovation collaborative Hubei pour l’industrie céréalière (LXT-16-18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KNO3 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017218 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | |
| MgSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013018 | |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 20011160 | |
| MnSO4·H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013418 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10019818 | |
| Boric Acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10024018 | |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10008218 | |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10007216 | |
| KI | Sinopharm Chemical Reagent | 10017160 | |
| FeSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10012118 | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent | 10009717 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| KOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10017018 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent | 10021418 | |
| Myo-inositol | MACKLIN | I811835 | |
| Nicotinic Acid | MACKLIN | N814565 | |
| Pyridoxine HCl | MACKLIN | V820447 | |
| Thiamine HCl | MACKLIN | T818865 | |
| Glycine | MACKLIN | G800880 | |
| Agar powder | Novon | ZZ14022 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Zoom V16 | |
| Dissecting microscope | SDPTOP | SRE-1030 | |
| 200μl pipette | Dragon Laboratory Instruments | 713111110000-20-200ul | |
| 2.5μl pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Fine forceps | TWEEZERS | ST-15 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM-996 | |
| Stainless steel double-sided blade | Gillette | Platinum-Plus Double-Edge Blade |
References
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