Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie man den CFDA in verschiedene Standorte der unteren Teile von Arabidopsis zuladen. Wir stellen dann das resultierende Verteilungsmuster von CF in den Triebe vor.
Abstract
Der Symplastik-Tracer 5 (6)-carboxyfluorescein Diacetat (CFDA) wurde in lebenden Pflanzen weit verbreitet eingesetzt, um die interzelluläre Verbindung, den Phloemtransport und das Gefäßmuster zu demonstrieren. Dieses Protokoll zeigt die Bewegung von unten nach oben (CF) in der Arabidopsis , indem das Wurzelschneiden bzw. das Hypokotyl-Kipingverfahren verwendet wird. Diese beiden verschiedenen Verfahren führen zu unterschiedlichen Wirkungsgraden der CF-Bewegung: Etwa 91% des Erscheinungsbildes von CF in den Triebe mit dem Hypokotyl-Knicken, während nur etwa 70% des Erscheinungsbildes von CF mit dem Wurzelschneideverfahren. Die einfache Änderung der Ladestationen, die zu erheblichen Veränderungen in der mobilen Effizienz dieses Symplastikfarbstoffs führt, deutet darauf hin, dass CF-Bewegung der Symplastik-Regelung unterliegen könnte, wahrscheinlich durch die Knotenhypokotyl-Kreuzung.
Introduction
Viele fluoreszierende Tracer mit einer Reihe von spektralen Eigenschaften, wie 5 (6)-carboxyfluorescein (CF)1,8Hydroxypyren-1,3,3,6-Trisulphonsäure2, Luzifer gelb CH (LYCH)3, Esculin und CTER4, wurden entwickelt und In Pflanzen zur Überwachung der Bewegung und der Phloem-Aktivität. In der Regel wird ein Symplastikfarbstoff in einen Schnitt im Zielgewebe geladen und die sequenzielle Zerstreuung des Reporters in andere Teile der Anlage wird die interzelluläre Kommunikation demonstrieren. Obwohl der Mechanismus der Farbstoffaufnahme nicht vollständig verstanden ist, ist das Prinzip, das der CF-Bewegung in lebenden Zellen zugrunde liegt, weithin anerkannt. Die Ester-Form von CF (CF Diacetat, CFDA) ist nicht fluoreszierend, aber membrandurchlässig. Diese Eigenschaft ermöglicht eine schnelle Membrandiffusion des Farbstoffs in Zellen. Einmal in lebenden Zellen, intrazelluläre Estoren entfernen die Acetatgruppen an der 3 ' und 6 ' Position der CFDA und lösen die fluoreszierende und membranundurchlässige CF (Abbildung1, alternativ Wright et al.2); CF kann sich dann durch die Plasmodesmata zu anderen Pflanzenteilen bewegen.
Ein etabliertes Verfahren mit CFDA ist, dass es in Quellblätter geladen werden kann und verwendet werden kann, um das Phloem-Streaming und die Phloem-Entladung im Spülgewebe vieler Arten zu überwachen, z.B. wie CF Entladen in der Arabidopsis-Wurzel 5, Phloem-Entladung Während der Kartoffeltuberisation6, Phloem-Entladung in der Nicotiana-Spüle Blätterblätter7, und so weiter. Durch ähnliche Ladeansätze haben andere Studien diesen Farbstoff übernommen, um die symplastische Verbindung zwischen Wirt und Parasit8,9zudemonstrieren oder die symbiotischen Beziehungen10, 11 aufzudecken.
Eine andere Möglichkeit, diesen Farbstoff zu verwenden, besteht darin, ihn mittels Mikroinjektion in bestimmte Zellen oder einzelne Zellen zu laden, um sein Verteilungsmuster zu bestimmen. Solche ausgeklügelten Techniken haben unser tieferes Verständnis von plasmodesmata-vermittelter interzellulärer Kommunikation erheblich erleichtert, insbesondere bei der Entwicklung des Konzepts dersymplastischen Domäne 12,13. Zum Beispiel führte die Mikroinjektion von CFDA in Cotyyledon-Zellen von Arabidopsis zu dem Farbkupplungsmuster in der Hypokotyl-Epidermis, aber ohne Kopplung in den darunterliegenden Zellen oder in der Wurzelepidermis, daher bildet die Hypocotyl-Epidermis eine Symplastik-Domain14. Ähnliche Domänen, wie die Stomatalwachszellen 15, Siebelement-Begleitzellen 16, Wurzelhaarzellen14 und Wurzeldeckel 17,18wurden durch Mikroinjektionstechnikidentifiziert. Am erstaunlichsten ist, dass sich einige Domains in eine bestimmte Richtung bewegen können. Nehmen wir zum Beispiel die Trichom-Domäne: Die Mikroinjektion einer Leuchtstoffarzene in die tragende Epidermzellzelle führt zum Tracer-Fluss in die Trichome-Domäne,die Reverse Injektion hält jedoch nicht bei 19. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht hat auch ähnliche Situationen in den symplastischen Domänen des Sedum Embryo20 gefunden. So implizieren alle oben genannten Fälle, dass der Austausch von Ladestationen zu neuartigen Erkenntnissen in die Symplastik-Kommunikation führen kann. Unser vorheriges Experiment, den Weg des robo-to-shoot mobilen Schweigens zu zerlegen, identifizierte eine neuartige Symplastik-Domäne oder die HEJ-Zone (Hypocotyl-Epicotyl-Knotenpunkt), die durch die Wurzelbelastung (nicht-kanonische Sink-Belastung) CFDA weiter verifiziert wurde. Experiment21. Hier erarbeiten wir die Wurzel-zu-Shof-CF-Bewegung mit einer einfachen Methode weiter und erhalten durch die Verschiebung der Ladestationen eine mögliche Symplastik-Domäne. Darüber hinaus kann dieses Verfahren an die Differenzierung genetischer Hintergründe angepasst werden, die den Fernverkehr verändert haben.
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Protocol
1. Arabidopsis vertikales Wachstum im MS-Medium
- Das Innere des Laminarstromschrankes muss vor dem Gebrauch mit 30 min UV-Licht und 15 Minuten Luftstrom behandelt werden. Achten Sie darauf, die Glastür zu schließen, wenn UV-Licht eingeschaltet ist. Sprühen Sie alle Werkzeuge und Platten mit 70% Ethanol, bevor Sie sie in den Schrank legen.
- Bereiten Sie das Murashige und Skoog (MS) Medium in einer Standard-Petrischale mit 90 mm Durchmesser unter einem laminaren Fließschrank vor.
NOTE: Das MS-Medium enthält folgende Komponenten: 20,6 mM NH4 NO3, 18,8 mM KNO 3, 1.25 mM KH2PO4, 1.5 mM MgSO4 · 7H 2 O, 3 mM CaCl2· 2H2 O, 0,1 mM MnSO4· H2 O,1.03 μMNa2MoO4· 2H2 O,0,1 mMH3 BO3, 30 μM ZnSO 4 · 7H 2 O, 0,1 μM CuSO4 · 5H 2 O, 0,1 μM CoCl2 · 6H 2 O, 1.39 μM KI, 97, M FeSO4·7H2O, 114.5 μM Ethylenediaminetetraacetikinsäure (EDTA), 4.07 μM Nikotinic Acid, 2.44 μM Pyridoxin HCl, 0,15 μM Thiamin HCl, 2,68 mM Glycin, 555 μM myo-inositol, 87,7 mM Saccharose und 10 g/L Agar. - Die sterilisierten Spitzen oder Zahnstocher anfeuchten, indem Sie die Spitze oder Zahnstocher auf das MS-Medium berühren, dann die sterilisierten Samen einzeln auf die feste Position jedes Petrischellers tauchen, das durch die Aussaatkarte angezeigt wird.
- Die Petrischale mit Paraffinfolie und Klebeband versiebenhalten und vertikal auf einen klaren Stand in einem Wachstumsraum (22 ° C, 70% Feuchtigkeit) mit einem Tageszyklus von 16 h Licht und 8 h Dunkelheit (Beleuchtung von 6 bis 22 Uhr) legen. Die Arabidopsis-Anlage ist nach der Aussaat am Tag 9-13 für die CFDA-Verladung bereit.
Achtung: Die folgende Prozedur wird am Nachmittag von 14 bis 17 Uhr durchgeführt.
2. CFDA-Verladung mit dem Wurzelschneideverfahren
- Bereiten Sie sofort vor dem Einsatz eine neue CFDA-Arbeitslösung vor. Die 1 mM CFDA Lagerlösung, die in-20 ° C Gefrierschrank mit sterilem ultrarem Wasser gelagert ist, verdünnen Sie eine Arbeitskonzentration von 5 μM.
- Die mikroporöse Paraffin-Membranfolie (siehe Materialtabelle) in kleine Stücke von 3 mm x 3 mm schneiden.
- Entdecken Sie die wachsenden Pflanzen im Raum bei 22 ° C und löschen Sie die überschüssige Feuchtigkeit mit einem Papiertuch. Legen Sie die kleinen Filmstücke unter jede Wurzel.
Hinweis: Von diesem bis zu Schritt 2.6 sollte der gesamte Prozess innerhalb von 15 Minuten abgeschlossen sein. - Die Pflanzen auf den Petrischülel heben. Schneiden Sie die Wurzeln in einer Position von 5-10 mm unter dem Wurzel-Hypokotyl-Kreuz. Legen Sie den Dreh auf den Film auf das Medium zurück.
- Unter einem Trennmikroskop werden vorsichtig 0,25 μL CFDA auf das Schneidende jeder Wurzel aufgetragen. Vermeiden Sie es, auf andere Pflanzenteile zu spritzen.
- Die Platte bedecken und die Pflanzen 2-3 h im Wachstumsraum unter Licht lassen.
- Spülen Sie die gebeizten Pflanzen dreimal sequenziell in drei separaten Bechern, die mit destilliertem Wasser gefüllt sind, und beobachten Sie dann die Pflanzen unter einem Stereo-Fluoreszenzmikroskop mit Zoom von 1,4 x bis 3,3x (siehe Materialliste). Für die Fluoreszenzerkennung verwenden Sie einen hocheffizienten Filterwürfel (470/20 nm Anregung, 495 nm Split und 525/50 nm Emission), der montiert wird, um das Fluoreszenzsignal zu übertragen.
3. CFDA Verladung mit Hypocotyl-Kneigeverfahren
- Bereiten Sie sofort vor dem Einsatz eine neue CFDA-Arbeitslösung vor. Die 1 mM CFDA Lagerlösung, die in-20 ° C Gefrierschrank mit sterilem ultrarem Wasser gelagert ist (siehe Materialtabelle), wird auf eine Arbeitskonzentration von 5 μM geparkt.
- Die mikroporöse Paraffin-Membranfolie (siehe Materialtabelle) in kleine Stücke von 3 mm x 3 mm schneiden.
- Entdecken Sie die wachsenden Pflanzen im Raum bei 22 ° C und löschen Sie die überschüssige Feuchtigkeit mit einem Papiertuch.
Hinweis: Von diesem bis zum Schritt 3.7 sollte der gesamte Prozess innerhalb von 15 Minuten abgeschlossen sein. - Legen Sie ein kleines Stück Film unter die Wurzel-Hypocotyl-Knotenpunkt jeder Pflanze.
- Verwenden Sie Zangen, um das Hypokotyl in der Nähe des Wurzel-Hypokotyl-Knokls unter einem sich abgetrennten Mikroskop sanft zu kneifen.
- Unter einem Abschnittmikroskop vorsichtig 0,1 μL CFDA auf die Wundstelle auftragen. Vermeiden Sie es, auf andere Pflanzenteile zu spritzen.
- Bedecken Sie die Platte und lassen Sie die Pflanzen unter Licht (22 ° C) für 2-3 h.
- Spülen Sie die gebeizten Pflanzen dreimal sequenziell in drei separaten Bechern, die mit destilliertem Wasser gefüllt sind, und beobachten Sie dann die Pflanzen unter einem Stereo-Fluoreszenzmikroskop mit Zoom von 1,4 x bis 3,3x (siehe Materialliste). Für die Fluoreszenzerkennung sollten Sie einen hocheffizienten Filterwürfel (470/20 nm Anregung, 495 nm Split und 525/50 nm Emission) montieren, um das Fluoreszenzsignal zu übertragen.
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Representative Results
Die Bewegung von Symplastic ist häufig Umweltschwankungen unterworfen. Die Störung des Pflanzenanbauzustandes, und auch der Prozess der Gewebeaufbereitung wird die Größe der Ausschlussgrenze von Plasmodesmata beeinflussen, wodurch sichder Symplastik-Transport 22. Um die Färbung zu verbessern, beschränken wir unseren Betrieb auf den Wachstumsraum, in dem Temperatur und Feuchtigkeit streng kontrolliert werden, und führen auch das gesamte Verfahren so schnell wie möglich durch (idealerweise innerhalb von 10-15 Minuten nach dem Heben des Deckels der Petrischale). Diese Vorsichtsmaßnahmen während eines Experiments können effektiv die Raten der erfolglosen Schießfärbung reduzieren.
Wir beschrieben zwei leicht unterschiedliche Verfahren, um die CF-Shooting-Bewegung zu demonstrieren. In der Regel können beide Verfahren zu CF-Färbung in den Triebe etwa 2 h nach der Fütterungführen (Abbildung2). Dennoch erzeugen die beiden Verfahren unterschiedliche Färbeeffekte. Das Hypokotyl-Kneikverfahren führt zu 91% Färbung, während das Wurzelschneidverfahren 70% ergibt (Welch es t -Test, p < 0.001) (Abbildung3). Wir haben auch versucht, den Farbstoff durch eine Wurzelkneifung zu laden und fanden eine noch geringere Färbung Effizienz im Vergleich zur Wurzelschneidemethode, was darauf hindeutet, dass der Ansatz, den Farbstoff in der Wurzel zu laden, nicht für den Färbegunterschied zwischen der Wurzel und dem Hypocotyl verantwortlich ist. Ladestationen (Bild 3). Das CF-Signal findet sich vor allem in der Vaskulatur, aber nur wenige Pflanzen zeigen das Halbblattmuster(Abbildung 2), wie in anderen Makromolekül Bewegungsmuster 21 gesehen. Sobald das CF-Signal auf das Shooting verteilt ist, kann es länger als 72 Stunden gehalten werden und das Signal kann nicht weiter auf andere Zelltypen entladen werden; Dies entspricht den zuvor veröffentlichten Ergebnissen17.
Bild 1 : Eine schematische Illustration für die CFDA-Aufnahme und CF-Bewegung in den Zellen der Pflanze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 2 : CF-Signal in den Triebe von 9, 11 und 13 Tagen nach Aussaat (DAS) Arabidopsis Pflanzen. Das CF-Signal kann sowohl in Cotyledons als auch in echten Blättern (A, B, C) erkannt werden. In den meisten Pflanzen wird das CF-Signal in der Vaskulatur nach 2-3 Stunden Beladung mit dem Wurzelschneiden oder Hypokotyl-Knicken beobachtet. Nur in sehr seltenen Fällen (weniger als 0,5%) kann die Hypokotyl-Kneikmethode im Cottyledon von 7 DAS Arabidopsis (D) ein partielles Färbenmuster erzeugen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 3 : Die Färbung der Effizienz mit der Wurzelbeladung (Root-Schneiden und Root-Flitzen) und Hypokotyl-Kneigung. Die Färbung in 9 DAS-Pflanzen wurde in drei unabhängigen Experimenten ermittelt (n = 26 im Wurzelkneifversuch; n = 335 im Wurzelschneidversuch; n = 522 in der Hypokotyl-Kneikmethode). Die Fehlerleiste zeigt den Standardfehler an. Zeigt p < 0.001 an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Aufstrebende Studien haben gezeigt, dass Pflanzen schnell auf äußere Reize23reagieren können, einschließlich Manipulationen, diein die experimentellen Verfahren eingeführt werden 22. In unserem ersten Experiment führt unsere Aufsicht über dieses Wissen oft zu einem Ferkeln. Mit diesen Lektionen schlagen wir vor, dass bei der Durchführung dieses Experiments folgende Vorsichtsmaßnahmen im Auge behalten werden: (1) die Samen nach der Ernte sollten in einem Aufbewahrungsschrank aufbewahrt werden, der auf eine niedrige Temperatur und niedrige Feuchtigkeit eingestellt ist; (2) Die Manipulation der Pflanzen, insbesondere der Lufteinwirkung im Schrank, sollte auf eine minimale Zeit gehalten werden; (3) Die Versuchsbedingungen sollten konstant gehalten werden, z.B. alle Eingriffe sollten in einem Wachstumsraum durchgeführt werden.
Ein weiterer Aspekt in diesem Experiment, auf den hingewiesen werden muss, ist, dass das Ladevolumen von CFDA so klein wie möglich gehalten werden sollte. Überschüssige Lösung führt oft zu Artefakten, in denen sich die überschüssige CFDA-Lösung durch Kapillarwirkung bis zum Schuss ausbreiten kann und so die Trichome der jungen Spülblätter ertönen. Obwohl ein Waschschritt vor der Bildgebung dieses Artefakt mindern kann, ist der beste Ansatz, einen minimalen Betrag zu laden, um Komplikationen zu vermeiden, die durch übermäßige Lösung verursacht werden.
Mit dieser technischen Vorsichtsmaßnahme lässt sich die Wurzel-zu-Shoot-Bewegung von CFDA, wie in Abbildung2 gezeigt, stabil beobachten. Wenn Pflanzen älter werden, etwa über 24 Tage, scheinen die Arabidopsis-Pflanzen die Fähigkeit zu verlieren, CF an die Aufnahme zu übertragen, für die wir noch keine genaue Erklärung gefunden haben. Ein möglicher Anhaltspunkt kommt von seiner intrazellulären Akkumulation. Nach den Berichten von Wright et al. 2ist CF in der Lage, von Vakuolen sequestriert zu werden, daher reduziert sich der intrazellulär freie CF im Laufe der Translokation schrittweise auf die Sequestrierung in den größeren Vakuolen alternder Anlagen.
Ein offensichtliches Merkmal dieser Prozedur ist das Distributionsmuster von CF im Shooting. Dieses Gefäßmuster erinnert an jene, indem es den Farbstoff in dasQuellblatt1,24,25 lädt, was zu der Illusion führt, dass sich der Farbstoff auch durch das Phloem bewegt. In der Tat, die Bottom-to-Top-Translokation von CF kann nicht durch das Phloem erreicht werden, da die Wurzel ein starkes Senkelgewebe ist und die Schießwart-Bewegung von CFDA gegen Phloem Streaming verstößt. Vielmehr kann dieser Prozess durch den Xylem-Transport erleichtert werden, wie Botha et al. 25zeigt. Kurz gesagt, CFDA kann über Xylem-Gefäße aufgenommen werden, in Parenchyma-Zellen verarbeitet und weiter auf das Siebelement des Phloem-Stroms 25 umgeleitet werden. Daher kann das Verladeexperiment auf diese Weise nicht die Aktivität von Phloem widerspiegeln, aber die symplastische Bewegung von CF muss auftreten, wenn die starke Fluoreszenz erkannt werden kann. Mit anderen Worten: Diese CF-Bewegung von unten nach oben kann sich aus dem kombinierten Xylem-Transport und dem symplastischen Transport durch Parenchyma-Zellen ergeben.
Symplastik-Transport ist oft der Symplastik-Domäne Formation13unterworfen, und unter bestimmten Umständen zeigt es unidirektionalen Transport19,20. Eine Möglichkeit für einen schnellen Check ist die Verschiebung der Ladestationen. In der Tat, als wir diesen Prozess mit der gleichen Methode ausgearbeitet, fanden wir die einfache Änderung der Ladefläche, von der Wurzelseite auf die Hypocotyl-Seite proximal, die Wurzel-Hypocotyl-Kreuzung, würde zu einer signifikanten Änderung der mobilen Effizienz von CFDA führen (Abbildung3). Die TC-Tyobil-Figierung durch die unterschiedlichen Ladestationen würde darauf hindeuten, dass die Wurzel-Hypocotyl-Kreuzung eine weitere Symplastik-Domäne ist, in der die Symplastik-Barriere für die wurzelabgeleiteten Schießsignale gebildet wird. Um diese Möglichkeit zu erforschen, bedarf es eines weiteren experimentellen Designs mit anderen Molekülen.
Bisher kann diese einfache Methode für eine stabile Schießbewegung von CFDA sorgen. Dieses Feature kann weiter erforscht werden, um Pflanzen mit kompromittierter oder verbesserter Wurzelbewegung zu unterscheiden, die selten untersucht wurde.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31671257) und dem Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry (LXT-16-18) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KNO3 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017218 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | |
| MgSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013018 | |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 20011160 | |
| MnSO4·H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013418 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10019818 | |
| Boric Acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10024018 | |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10008218 | |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10007216 | |
| KI | Sinopharm Chemical Reagent | 10017160 | |
| FeSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10012118 | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent | 10009717 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| KOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10017018 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent | 10021418 | |
| Myo-inositol | MACKLIN | I811835 | |
| Nicotinic Acid | MACKLIN | N814565 | |
| Pyridoxine HCl | MACKLIN | V820447 | |
| Thiamine HCl | MACKLIN | T818865 | |
| Glycine | MACKLIN | G800880 | |
| Agar powder | Novon | ZZ14022 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Zoom V16 | |
| Dissecting microscope | SDPTOP | SRE-1030 | |
| 200μl pipette | Dragon Laboratory Instruments | 713111110000-20-200ul | |
| 2.5μl pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Fine forceps | TWEEZERS | ST-15 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM-996 | |
| Stainless steel double-sided blade | Gillette | Platinum-Plus Double-Edge Blade |
References
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