Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di mostrare come caricare il CFDA in diversi siti delle parti inferiori di Arabidopsis. Presentiamo quindi il modello di distribuzione risultante di CF nei germogli.
Abstract
Il simplastico Tracer 5 (6)-carbossimetilfluoreina diacetato (CFDA) è stato ampiamente applicato in piante viventi per dimostrare la connessione intercellulare, il trasporto floema e il patterning vascolare. Questo protocollo Mostra il movimento da basso a superiore della carbossimetilfluoreina (CF) nell' Arabidopsis utilizzando rispettivamente la procedura di taglio radicale e di ipocotilizzazione. Queste due diverse procedure si traducono in diverse efficienze del movimento CF: circa il 91% dell'aspetto di CF nei germogli con la procedura di ipocotilio-pizzicamento, mentre solo circa 70% aspetto di CF con la procedura di root-Cutting. Il semplice cambiamento dei siti di carico, con conseguenti cambiamenti significativi nell'efficienza mobile di questo colorante simplastico, suggerisce che il movimento CF potrebbe essere soggetto alla regolazione simplastico, molto probabilmente dalla giunzione radice-ipocotyl.
Introduction
Molti traccianti fluorescenti con una gamma di proprietà spettrali, come 5 (6)-carbossilfluoreina (CF) 1,8-idrossipirene-1, 3, 6-acido trisolfonico2, Lucifero giallo ch (Lych)3, esculin e CTER4, sono stati sviluppati e applicato nelle piante per monitorare il movimento simplastico e l'attività floema. Generalmente, un colorante simplastico viene caricato in un taglio nel tessuto bersaglio e la dispersione sequenziale del reporter in altre parti dell'impianto dimostrerà la comunicazione intercellulare. Anche se il meccanismo di assorbimento del colorante non è pienamente compreso, il principio sottostante movimento CF all'interno di cellule vive è stato ampiamente riconosciuto. La forma di estere di CF (diacetato CF, CFDA) è non fluorescente, ma permeabile alla membrana. Questa proprietà consente una rapida diffusione della membrana del colorante nelle cellule. Una volta all'interno delle cellule vive, le esterasi intracellulari rimuovono i gruppi di acetato alla posizione 3' e 6' di CFDA, rilasciando la CF fluorescente e impermeabile alla membrana (Figura 1, in alternativa, fare riferimento a Wright et al.2); CF può quindi muoversi attraverso il plasmodesmi ad altre parti di piante.
Una procedura consolidata con CFDA è che può essere caricata in foglie di origine e utilizzata per monitorare lo streaming floema e lo scarico floema nei tessuti lavello di molte specie, ad esempio, come scarico CF nella radice di Arabidopsis 5, scarico floema durante la tuberizzazione di patate6, scarico floema nel lavello Nicotiana lascia7, e così via. Con approcci di carico simili, altri studi hanno adottato questo colorante per dimostrare la connessione simplastico tra host e parassita8,9, o per rivelare le relazioni simbiotiche10,11.
Un altro modo per fare uso di questo colorante è quello di caricarlo in cellule specifiche o singola cellula mediante microiniezione per determinare il suo modello di distribuzione. Tali tecniche sofisticate hanno notevolmente facilitato la nostra più profonda comprensione della comunicazione intercellulare mediata da plasmodesmato, in particolare nello sviluppo del concetto di dominio simplastico12,13. Ad esempio, la microiniezione di CFDA in cellule di cotilina di Arabidopsis ha provocato il modello di accoppiamento colorante nell'epidermide ipocotilica ma non accoppiamento nelle cellule sottostanti o nell'epidermide radice, pertanto l'epidermide ipocotilica forma un dominio simplastico14. Domini simili, come le cellule di guardia stomatale15, elemento setaccio-cellule compagno16, cellule dei capelli di radice14 e tappo di radice17,18 sono stati identificati con la tecnica di microiniezione. Sorprendentemente, alcuni domini consentono alle molecole traccianti di muoversi in una certa direzione. Prendete il dominio Tricomi, ad esempio, la microiniezione di una sonda fluorescente nella cellula epidermica di supporto conduce al flusso di tracciante nel dominio Tricomi, tuttavia, l'iniezione inversa non tiene vero19. Un recente rapporto ha anche trovato situazioni simili nei domini simplastico dell'embrione Sedum 20. Così, tutti i casi di cui sopra implicano che lo scambio di siti di carico può portare a nuove intuizioni sulla comunicazione simplastico. Il nostro esperimento precedente con l'obiettivo di sezionare il percorso di silenziamento mobile root-to-Shoot ha identificato un nuovo dominio simplastico, o la zona di Hej (igenici-epicotil), che è stata ulteriormente verificata attraverso la CFDA carico di radice (non canonica) esperimento21. Qui, abbiamo ulteriormente elaborato il movimento CF Root-to-Shoot utilizzando un metodo semplice e recuperare un potenziale dominio simplastico spostando i siti di carico. Inoltre, questa procedura può essere adattata per differenziare gli sfondi genetici che hanno alterato il trasporto a lunga distanza da root a sparare.
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Protocol
1. Arabidopsis crescita verticale in MS medio
- L'interno dell'armadio a flusso laminare deve essere trattato con 30 minuti di luce UV e 15 minuti di flusso d'aria prima dell'uso. Assicurarsi di chiudere la porta di vetro quando la luce UV è acceso. Spruzzare tutti gli utensili e le piastre con 70% di etanolo prima di metterli nel cabinet.
- Preparare il mezzo Murashige e Skoog (MS) in una piastra di Petri standard di 90 mm di diametro sotto un armadio a flusso laminare.
Nota: il supporto MS contiene i seguenti componenti: 20,6 mM NH4No3, 18,8 mm kno3, 1,25 mm KH2po4, 1,5 mM MgSO4· 7h2o, 3 mm CAcl2· 2h2o, 0,1 mm MnSO4· H2o, 1,03 μm na2Moo4· 2h2o, 0,1 mm H3Bo3, 30 μm ZnSO4· 7h2o, 0,1 μm CuSO4· 5h2o, 0,1 μm COCL2· 6h2o, 1,39 μm Ki, 97 μ M FeSO4 · 7H2O, 114,5 μm acido etilendiamaminetetraacetico (EDTA), 4,07 μm acido nicotinico, 2,44 μm piridossina hcl, 0,15 μm tiamina hcl, 2,68 mm glicina, 555 μm myo-inositolo, 87,7 mm saccarosio e 10 g/L agar. - Idratare le punte sterilizzate o stuzzicadenti toccando la punta o stuzzicadenti al mezzo MS, quindi immergere i semi sterilizzati uno per uno sulla posizione fissa di ogni piatto di Petri indicato dalla carta di semina.
- Sigillare la capsula di Petri con pellicola di paraffina e nastro adesivo e posizionarla verticalmente su un supporto trasparente in una sala di crescita (22 ° c, 70% di umidità) con un ciclo giornaliero di 16 ore di luce e 8 h di oscurità (illuminazione da 6 am a 10 PM). Lo stabilimento di Arabidopsis è pronto per il caricamento CFDA il giorno 9-13 dopo la semina.
Nota: la seguente procedura viene eseguita nel pomeriggio da 2 pm a 5 PM.
2. CFDA carico con la procedura di taglio della radice
- Preparare la soluzione di lavoro CFDA fresca immediatamente prima dell'uso. Diluire la soluzione di magazzino CFDA da 1 mM immagazzinata in congelatore da-20 ° c con acqua ultrapura sterile ad una concentrazione di lavoro di 5 μM.
- Tagliare la pellicola di membrana di paraffina microporosa (vedere la tabella dei materiali) in piccoli pezzi di dimensioni 3 x 3 mm.
- Scopri le piante in crescita nella stanza a 22 ° c e cancella l'umidità in eccesso con un tovagliolo di carta. Posizionare i piccoli pezzi di pellicola sotto ogni radice.
Nota: da questo al passo 2,6, l'intero processo deve essere completato entro 15 minuti. - Sollevare le piante sul coperchio della capsula di Petri. Tagliare le radici in una posizione di circa 5-10 mm sotto la giunzione radice-ipocotilile. Riposiziona la parte di ripresa sul film sul supporto.
- Applicare con cautela 0,25 μL di CFDA sull'estremità di taglio di ogni radice sotto un microscopio dissezione. Evitare schizzi in altre parti dell'impianto.
- Coprire la piastra e lasciare le piante sotto la luce per 2-3 h (22 ° c) nella sala di crescita.
- Sciacquare le piante colorate tre volte sequenzialmente in tre bicchieri separati riempiti con acqua distillata, quindi osservare le piante sotto un microscopio a fluorescenza stereo con zoom da 1.4 x a 3.3 x (vedere la tabella dei materiali). Per il rilevamento della fluorescenza, utilizzare un cubo filtrante ad alta efficienza (470/20 Nm di eccitazione, 495 Nm di divisione e 525/50 Nm di emissione) montato per trasmettere il segnale di fluorescenza.
3. CFDA carico con procedura di ipocotilio-pizzicare
- Preparare la soluzione di lavoro CFDA fresca immediatamente prima dell'uso. Diluire la soluzione di magazzino CFDA da 1 mM immagazzinata in congelatore da-20 ° c con acqua ultrapura sterile (vedere la tabella dei materiali) ad una concentrazione di lavoro di 5 μm.
- Tagliare la pellicola di membrana di paraffina microporosa (vedere la tabella dei materiali) in piccoli pezzi di dimensioni 3 x 3 mm.
- Scopri le piante in crescita nella stanza a 22 ° c e cancella l'umidità in eccesso con un tovagliolo di carta.
Nota: da questo al passo 3,7, l'intero processo deve essere completato entro 15 minuti. - Posare un piccolo pezzo di pellicola sotto il nodo radice-ipocotilio di ogni pianta.
- Usare pinze per pizzicare delicatamente l'ipocotilio vicino alla giunzione radice-ipocotilile sotto un microscopio dissezione.
- Applicare con cautela 0,1 μL di CFDA sul sito della ferita sotto un microscopio dissezione. Evitare schizzi in altre parti dell'impianto.
- Coprire la piastra e lasciare le piante sotto la luce (22 ° c) per 2-3 h.
- Sciacquare le piante colorate tre volte sequenzialmente in tre bicchieri separati riempiti con acqua distillata, quindi osservare le piante sotto un microscopio a fluorescenza stereo con zoom da 1.4 x a 3.3 x (vedere la tabella dei materiali). Per il rilevamento della fluorescenza, montare un cubo filtrante ad alta efficienza (470/20 Nm di eccitazione, 495 Nm di divisione e 525/50 Nm di emissione) per trasmettere il segnale di fluorescenza.
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Representative Results
Il movimento symplastic è spesso soggetto a fluttuazioni ambientali. Perturbazione dello stato vegetativo in crescita, e anche il processo di preparazione dei tessuti influenzerà il limite di esclusione di dimensioni di Plasmodesmata, influenzando così il trasporto simplastico22. Per migliorare l'efficienza di colorazione, confiniamo il nostro funzionamento nella sala di crescita, dove la temperatura e l'umidità è strettamente controllata, e anche eseguire l'intera procedura il più rapidamente possibile (idealmente entro 10-15 min dopo aver sollevato il coperchio della piastra di Petri). Queste precauzioni durante un esperimento possono ridurre efficacemente i tassi di colorazione delle riprese non riuscite.
Abbiamo descritto due procedure leggermente diverse per dimostrare il movimento di tiro-rione CF. Normalmente, entrambe le procedure possono portare alla colorazione CF nei germogli circa 2 ore dopo l'alimentazione (Figura 2). Tuttavia, le due procedure producono diverse efficienze di colorazione. La procedura di ipocotilio-pizzicore provoca un'efficienza di colorazione del 91%, mentre la procedura di taglio radicale produce il 70% ( t-test di Welch, p < 0,001) (Figura 3). Abbiamo anche provato a caricare il colorante con un metodo di pizzicamento e abbiamo trovato un'efficienza di colorazione ancora più bassa rispetto al metodo di taglio delle radici, suggerendo che l'approccio per caricare il colorante nella radice non causa la differenza di colorazione tra la radice e l'ipocotilio siti di carico (Figura 3). Il segnale CF si trova principalmente nella vascolarizzazione, ma solo poche piante mostrano il modello a mezza foglia (Figura 2) come si vede in altri modelli di movimento macromolecola21. Una volta che il segnale CF è diffuso al tiro, può essere mantenuto per più di 72 h e il segnale non può scaricare ulteriormente ad altri tipi di cellule; Ciò è coerente con i risultati pubblicati in precedenza17.
Figura 1 : Un'illustrazione schematica per l'assorbimento di CFDA e il movimento CF nelle cellule della pianta. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2 : Segnale CF nei germogli di 9, 11 e 13 giorni dopo la semina (Das) Di Arabidopsis piante. Il segnale CF può essere rilevato sia in cotiledoni che in foglie vere (a, B, C). Nella maggior parte delle piante, il segnale di CF è osservato nella vascolarizzazione dopo 2-3 ore di carico con il metodo di taglio della radice o ipocotilio-pinching. Solo in casi molto rari (meno del 0,5%), il metodo di ipocotilizzazione può generare un modello di colorazione parziale nel Cotyledon di 7 DAS Arabidopsis (D). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3 : Le efficienze di colorazione con il metodo di root-Loading (root-taglio e root-pizzicare) e il metodo di ipocotilio-pinching. L'efficienza di colorazione in 9 piante DAS è stata determinata in tre esperimenti indipendenti (n = 26 nell'esperimento root-pizzicare; n = 335 nell'esperimento di root-Cutting; n = 522 nel metodo ipocotyl-pinching). La barra di errore indica un errore standard. indica p < 0,001. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
Studi emergenti hanno dimostrato che le piante possono reagire rapidamente agli stimoli esterni23, compresa la manipolazione introdotta nelle procedure sperimentali22. Nel nostro esperimento iniziale, la nostra supervisione di questa conoscenza spesso porta a un fallimento di colorazione. Con queste lezioni, suggeriamo di tenere a mente le seguenti precauzioni quando si esegue questo esperimento: (1) i semi dopo la raccolta devono essere conservati in un armadio di stoccaggio impostato a una bassa temperatura e bassa umidità; 2) la manipolazione delle piante, in particolare l'esposizione all'aria nell'armadio, deve essere mantenuta al minimo; (3) le condizioni sperimentali devono essere mantenute costanti, ad esempio, tutte le procedure devono essere eseguite in una sala di crescita.
Un altro aspetto in questo esperimento che deve essere sottolineato è che il volume di carico di CFDA deve essere mantenuto il più piccolo possibile. La soluzione in eccesso spesso porta a artefatti in cui la soluzione CFDA in eccesso può diffondersi fino al tiro attraverso l'azione capillare, tintando così i tricomi delle foglie del lavello giovani. Anche se una fase di lavaggio prima dell'imaging può diminuire questo artefatto, l'approccio migliore consiste nel caricare una quantità minima per evitare complicazioni causate dalla soluzione in eccesso.
Con queste precauzioni tecniche risolte, il movimento root-to-shoot di CFDA può essere osservato stabilmente come mostrato in Figura 2. Quando le piante invecchiano, dicono più di 24 giorni, le piante di Arabidopsis sembrano perdere la capacità di trasmettere CF al tiro, per il quale non abbiamo ancora trovato una spiegazione esatta. Un possibile indizio deriva dal suo accumulo intracellulare. Secondo le relazioni di Wright et al.2, CF è suscettibile di essere sequestrata dai vacuoli, pertanto, la CF libera intracellulare nel corso della traslocazione riduce gradualmente al sequestro nei vacuoli più grandi di piante di invecchiamento.
Una caratteristica ovvia di questa procedura è il modello di distribuzione di CF nel tiro. Questo modello vascolare ricorda quelli caricando il colorante nella sorgente foglia1,24,25, portando così a un'illusione che il colorante si muove anche attraverso il phloem. Infatti, la traslocazione bottom-to-top di CF non può essere raggiunta attraverso il floema dato il fatto che la radice è un forte tessuto del lavandino e il movimento sparatore di CFDA va contro lo streaming floema. Piuttosto, questo processo può essere facilitato dal trasporto Xylem come mostrato da Botha et al.25. In breve, CFDA può essere assunto attraverso vasi Xylem, trasformati in cellule parenchima e ulteriormente traslocalizzati all'elemento setaccio del flusso floema25. Pertanto, l'esperimento di caricamento in questo modo potrebbe non riflettere l'attività di phloem, ma il movimento simplastico di CF deve avvenire come la forte fluorescenza può essere rilevata. In altre parole, questo movimento di CF bottom-to-top può derivare dal trasporto combinato Xylem e dal trasporto simplastico attraverso le cellule parenchima.
Il trasporto simplastico è spesso soggetto alla formazione di domini simplastico13, e in determinate circostanze Mostra un trasporto unidirezionale19,20. Un modo per un controllo rapido è quello di spostare i siti di caricamento. Infatti, quando abbiamo elaborato questo processo usando lo stesso metodo, abbiamo trovato il semplice cambiamento del sito di carico, dal lato root al lato ipocotilico prossimale alla giunzione radice-ipocotilica, si tradurrebbe in un cambiamento significativo dell'efficienza mobile CFDA (Figura 3). La differenziazione mobile CF a causa dei siti di carico distinti suggerirebbe che la giunzione radice-ipocotyl è un altro dominio simplastico, dove la barriera simplastico è formata per i segnali di sparamento derivati dalla radice. Ulteriore disegno sperimentale con altre molecole è necessario per esplorare questa possibilità.
Finora, questo metodo semplice può fornire stabile movimento sparto di CFDA. Questa funzione può essere ulteriormente esplorata per distinguere le piante con il movimento root-to-Shoot compromesso o migliorato che è stato raramente studiato.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (31671257) e dal centro di innovazione collaborativa di Hubei per l'industria del grano (LXT-16-18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KNO3 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017218 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | |
| MgSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013018 | |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 20011160 | |
| MnSO4·H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013418 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10019818 | |
| Boric Acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10024018 | |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10008218 | |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10007216 | |
| KI | Sinopharm Chemical Reagent | 10017160 | |
| FeSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10012118 | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent | 10009717 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| KOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10017018 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent | 10021418 | |
| Myo-inositol | MACKLIN | I811835 | |
| Nicotinic Acid | MACKLIN | N814565 | |
| Pyridoxine HCl | MACKLIN | V820447 | |
| Thiamine HCl | MACKLIN | T818865 | |
| Glycine | MACKLIN | G800880 | |
| Agar powder | Novon | ZZ14022 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Zoom V16 | |
| Dissecting microscope | SDPTOP | SRE-1030 | |
| 200μl pipette | Dragon Laboratory Instruments | 713111110000-20-200ul | |
| 2.5μl pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Fine forceps | TWEEZERS | ST-15 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM-996 | |
| Stainless steel double-sided blade | Gillette | Platinum-Plus Double-Edge Blade |
References
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