Summary
このプロトコルの目的は、シロイヌナズナの底部の異なるサイトに CFDA をロードする方法を示すことです。次に、シュートで CF の結果の分布パターンを提示します。
Abstract
Symplastic トレーサー 5 (6)-carboxyfluorescein スジ (CFDA) は、細胞間接続、師部輸送、血管パターニングを実証するために、生きた植物に広く適用されています。このプロトコルは、それぞれルート切断と胚軸の手順を使用して、シロイヌナズナ内の下から上の CARBOXYFLUORESCEIN (CF) の動きを示します。これらの2つの異なる手順は、CF の動きの異なる効率をもたらします: 約 91% 胚軸での芽の CF の外観, 一方、根切断手順で CF の約 70% の外観.ローディングサイトの単純な変更は、この symplastic 染料のモバイル効率の著しい変化をもたらし、CF の動きは、おそらく根胚軸接合部によって、symplastic 規制の対象となるかもしれないことを示唆している。
Introduction
5 (6)-carboxyfluorescein (CF)1、8-hydroxypyrene-1、3、6-trisulphonic 酸2、ルシファーイエロー CH (LYCH)3、Esculin および結実4などのスペクトル特性の範囲を有する多くの蛍光トレーサーが開発され、symplastic の動きおよび師部の活動を監察するために植物で適用される。一般的には、symplastic 色素を標的組織の切断に装填し、レポーターを植物の他の部分に順次分散させることで、細胞間通信を実証することができます。色素吸収のメカニズムは完全には解明されていないが、生細胞内の CF 運動の根底にある原理は広く認められている。CF (CF スジ、CFDA) のエステル形態は非蛍光性であるが、膜透過性である。この特性は、色素の細胞への迅速な膜拡散を可能にします。生きた細胞の中で一旦、細胞内エステラーゼは、CFDA の 3 ' および 6 ' 位置で酢酸基を除去し、蛍光および膜非透過性 CF を放出する (図 1、またはライト et al.2を参照)。CF は、plasmodesmata を通って植物の他の部分に移動することができます。
CFDA の確立された手順は、それがソースの葉にロードし、多くの種のシンク組織内の師部ストリーミングおよび師部アンロードを監視するために使用することができるということであり、例えば、シロイヌナズナルート5、師部における CF アンロードとして、ジャガイモ tuberization6の間に、 Nicotianaシンク内の師部アンロードは7を残し、というように。同様のローディングアプローチによって、他の研究は、宿主と寄生虫8、9との間の symplastic 接続を実証するためにこの染料を採用し、または共生関係10、11を明らかにする。
この染料を使用する別の方法は、その分布パターンを決定するためにマイクロインジェクションによって特定の細胞または単一細胞にそれをロードすることである。このような洗練された技術は、特に symplastic ドメイン12,13の概念の開発において、plasmodesmata 媒介性細胞間通信に対する我々の深い理解を促進した。例えば、シロイヌナズナの子葉細胞への CFDA のマイクロインジェクションは、胚軸表皮における色素結合パターンをもたらしたが、基になる細胞または根表皮では非カップリングであり、したがって胚軸表皮はsymplastic ドメイン14.同様のドメインは、例えば、気孔ガード細胞15、篩要素−コンパニオンセル 16、根毛細胞14および根キャップ17、18などの微量注入技術によって同定されている。驚くべきことに、一部のドメインでは、トレーサー分子を特定の方向に動かすことができます。トライコームドメインを取るたとえば、支持表皮細胞への蛍光プローブのマイクロインジェクションは、トライコームドメインへのトレーサーの流れにつながりますが、逆注射は真の19を保持しません。最近の報告はまた、セダム胚20の symplastic ドメインにおいて同様の状況を見出した。したがって、上記のすべてのケースは、ローディングサイトのスワップが symplastic コミュニケーションに新たな洞察をもたらす可能性があることを暗示しています。ルート・ツー・シュートのモバイル・サイレンシングの経路を分析することを目的とした以前の実験で、新規の symplastic ドメイン、または HEJ (胚軸-epicotyl ジャンクション) ゾーンを特定し、ルートローディング (非標準のシンクローディング) を通じてさらに検証しました CFDA実験21.ここでは、ロードサイトをシフトすることにより、簡単な方法で symplastic の潜在的なドメインを回復させることにより、ルートツーシュート CF の動きをさらに詳しく説明します。さらに、この手順は、ルートからシュートへの長距離輸送を変更した遺伝的背景を区別するように調整することができる。
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Protocol
1. MS 培地のシロイヌナズナ垂直成長
- 層流キャビネットの内部は、使用前に30分の UV 光と15分の気流で処理する必要があります。UV ライトが点灯しているときは、必ずガラス扉を閉めてください。すべての工具とプレートを 70% のエタノールでスプレーしてから、キャビネットに入れます。
- Murashige および Skoog (MS) 媒体を層流キャビネットの下の標準的な 90 mm のペトリ皿で準備しなさい。
注: MS 媒体には、次のコンポーネントが含まれています。 20.6 mm NH4NO3, 18.8 mm KNO3, 1.25 mm KH2PO4, 1.5 MM MgSO4· 7h2o, 3 mM CaCl2· 2h2o, 0.1 mm MnSO4·H2o, 1.03 μ m Na2MoO4・ 2h2o, 0.1 mM H3BO3, 30 μ m ZnSO4・ CuSO 2 o, 0.1μ m 4 ・ 5h 2 o, 0.1 μ m CoCl2・ 6h 2 o, 1.39 μ m KI, 97 μM FeSO4 · 7H2O、114.5 μ m ethylenediaminetetraacetic 酸 (EDTA)、4.07 μ m のニコチン酸、2.44 μ m ピリドキシン hcl、0.15 μ m チアミン hcl、2.68 mm グリシン、555μ m のイノシトール、87.7 mm スクロースおよび 10G/L 寒天。 - 先端または爪楊枝を MS 培地に接触させることにより滅菌された先端または爪楊枝に潤いを及ぼし、その後、滅菌された種子を、播種カードによって示される各ペトリ皿の固定位置に1つずつ浸します。
- パラフィンフィルムと粘着テープを使用してペトリ皿を密封し、16時間の光の1日周期と8時間の暗闇 (6 am から 10 pm までの照明) で、成長室 (22 ° c、70% の水分) の明確なスタンドに垂直に置きます。シロイヌナズナ工場は播種後9-13 日目に CFDA を装填する準備ができています。
注: 以下の手順は午後2時から午後5時まで行われます。
2. ルートカット手順による CFDA ローディング
- すぐに使用する前に新鮮な CFDA 作業ソリューションを準備します。-20 ° c の冷凍庫に保存された 1 mM CFDA ストック液を5μ m の作業濃度に希釈します。
- 微小多孔性パラフィン膜膜 (材料表参照) を 3 mm x 3mm サイズの小片に切ります。
- 22° c で部屋で成長している植物を明らかにし、ペーパータオルで余分な水分をクリアします。各ルートの下に小さなフィルムピースを配置します。
注: これからステップ2.6 に、全体のプロセスは15分以内に完了する必要があります。 - ペトリ皿の蓋の上に植物を持ち上げます。根を胚軸ジャンクションの約 5-10 mm 下の位置に切ります。撮影部分をメディア上のフィルムに戻します。
- 慎重に解剖顕微鏡の下で各根の切断端に CFDA の0.25 μ l を加えなさい。植物の他の部分に飛散しないようにします。
- プレートをカバーし、成長室で 2-3 h (22 ° c) のための光の下に植物を残します。
- 染色した植物を蒸留水で満たされた3つのビーカーに3回連続してすすぎ、その後、1.4 x から 3.3 x までのズームを備えたステレオ蛍光顕微鏡下で植物を観察します (材料の表を参照してください)。蛍光検出の場合、高効率フィルタキューブ (470/20 nm 励起、495 nm スプリットおよび 525/50 nm エミッション) を使用して、蛍光シグナルを送信します。
3. 胚軸の CFDA ローディング
- すぐに使用する前に新鮮な CFDA 作業ソリューションを準備します。-20 ° c の冷凍庫に保存されている 1 mM CFDA ストック溶液を、滅菌した超純水 (材料表参照) を5μ m の作業濃度に希釈します。
- 微小多孔性パラフィン膜膜 (材料表参照) を 3 mm x 3mm サイズの小片に切ります。
- 22° c で部屋で成長している植物を明らかにし、ペーパータオルで余分な水分をクリアします。
注: これからステップ3.7 に、全体のプロセスは15分以内に完了する必要があります。 - 各植物の根胚軸接合部の下にフィルムの小片を置きます。
- 解剖顕微鏡の下の根胚軸接合部の近くに胚軸を穏やかにつまむように鉗子を使用してください。
- 0.1 μ l の CFDA を解剖顕微鏡下の創傷部位に慎重に塗布する。植物の他の部分に飛散しないようにします。
- プレートを覆い、2-3 h のために光 (22 ° c) の下に植物を残します。
- 染色した植物を蒸留水で満たされた3つのビーカーに3回連続してすすぎ、その後、1.4 x から 3.3 x までのズームを備えたステレオ蛍光顕微鏡下で植物を観察します (材料の表を参照してください)。蛍光検出のために、高効率フィルタキューブ (470/20 nm 励起、495 nm スプリットおよび 525/50 nm エミッション) を搭載し、蛍光信号を透過させる。
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Representative Results
Symplastic 運動はしばしば環境変動の対象となる。植物成長状態の摂動、および組織調製のプロセスさえも、plasmodesmata のサイズ排除限界に影響を与え、従って symplastic 輸送22に影響を与える。染色効率を向上させるために、温度と水分が厳重に管理されている成長室での作業を制限し、また、可能な限り迅速に (ペトリ皿の蓋を持ち上げてから10-15 分以内) 全体の手順を実行します。実験中にこれらの予防措置は、効果的にシュート染色の失敗率を減少させることができます。
我々は、CF シュートワード運動を実証するために、わずかに異なる2つの手順を説明した。通常、両方の手順は、摂食後約2時間のシュートにおける CF 染色につながる可能性がある (図 2)。それにもかかわらず、2つの手順は異なる染色効率をもたらします。胚軸によって、91% の染色効率が得られますが、根切法では 70%(ウェルチのt検定、p < 0.001) が生成されます (図 3)。我々はまた、根の挟み込み法によって染料をローディングしようとし、根切削法と比較してさらに低い染色効率を見いだし、根に染料を装填するアプローチは根と胚軸の間の染色の違いを考慮しないことを示唆した。サイトを読み込んでいます (図 3)。CF シグナルは、主に脈管構造で検出されますが、他の高分子運動パターン21で見られるように、ハーフリーフパターン (図 2) を示す植物はほとんどありません。CF 信号がシュートに拡散すると、72 h 以上維持でき、信号を他のセルタイプにアンロードすることはできません。これは、以前に公表された結果17と一致している。
図 1: 植物細胞の CFDA 取り込みと CF 移動の模式図。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 播種後 9, 11, 13 日目の CF シグナル (DAS)シロイヌナズナ植物。CF シグナルは、子葉と真の葉 (A、 B、 C) の両方で検出することができます。大部分の植物では、ルート切断または胚軸のいずれかの方法で荷重の2-3 時間後に、脈管構造で CF 信号が観測されます。非常にまれなケース (0.5% 未満) でのみ、胚軸法は、7 DAS シロイヌナズナ (D) の子葉において部分的な染色パターンを生成することができる。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 根ローディング法 (根切断と根挟み) と胚軸法による染色効率。9つの DAS 植物における染色効率は3回の独立した実験で決定された (根の挟み込み実験では n = 26、根切削実験では n = 335、胚軸法では n = 522)。エラーバーは標準エラーを示します。p < 0.001 を示します。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
新たな研究は、植物が迅速に実験手順22に導入された操作を含む外部刺激23に応答することができることを示している。最初の実験では、この知識の見落としはしばしば染色の失敗につながります。これらのレッスンでは、この実験を行う際に次の注意事項を念頭に置くことをお勧めします。 (1) 収穫後の種子は、低温と低水分に設定された貯蔵庫に保管する必要があります。(2) 植物の操作、特にキャビネット内の空気への暴露は、最小限の時間に抑える必要があります。(3) 実験条件は一定に保つ必要があります, 例えば, すべての手順は、成長室で実行する必要があります.
指摘する必要があるこの実験のもう一つの側面は、CFDA の積載量をできるだけ小さく保つべきであるということです。過剰な溶液は、しばしば過剰な CFDA 溶液が毛管作用を通してシュートまで拡散することができ、それによって若いシンクの葉の毛状を着色するアーチファクトにつながる。イメージング前に洗浄手順を実行すると、このアーティファクトが減少する可能性がありますが、最善の方法は、過剰なソリューションによる合併症を避けるために最小量をロードすることです。
これらの技術的な注意事項が解決されると、図 2に示すように、CFDA の根からシュートへの移動を安定して観察することができます。植物が年をとると、24日間以上と言うと、シロイヌナズナの植物は、我々がまだ正確な説明を見つけていないシュートに CF を送信する能力を失っているようです。一つの考えられる手掛かりは細胞内蓄積に由来する。ライト et al.2による報告によれば、CF は液胞によって sequestrated され易く、従って、転座の経過にわたる細胞内遊離 CF は、老化した植物のより大きな液胞における隔離に徐々に減少する。
この手順の明らかな特徴の1つは、撮影における CF の分布パターンです。この血管パターンは、原料葉1、24、25に染料を装填することによってそれらを彷彿とさせ、従って染料が師部を通って移動するという錯覚をもたらす。実際には、CF のボトム・ツー・トップの転座は、根が強力なシンク組織であり、CFDA の shootward 運動が師部のストリーミングに反するという事実を考えると、師部を介して達成されないことがあります。むしろ、このプロセスは、・ボータ et al.25によって示されるような木部輸送によって促進され得る。手短に言えば、CFDA は、木部血管を通って取り込まれ、実質細胞で処理し、さらに、師部ストリーム25の篩要素に傷口することができる。したがって、この方法でのローディング実験は師部の活性を反映しないかもしれないが、強い蛍光が検出されることができるように CF の symplastic 運動が行われなければならない。言い換えれば、この下から上の CF の動きは、実質細胞を介して結合された木部輸送および symplastic 輸送から生じることがある。
Symplastic 輸送は、しばしば Symplastic ドメイン形成13の対象となり、特定の状況において、単方向輸送19,20を表示する。クイックチェックの1つの方法は、読み込みサイトをシフトすることです。実際、同じ方法でこのプロセスを精緻化したところ、ルート側から胚軸側の胚軸接合部までの単純なローディング部位の変化が、移動効率の CFDA に大きな変化をもたらすことがわかった (図 3)。個別のローディングサイトによる CF モバイルの差別化は、ルート胚軸ジャンクションが別の symplastic ドメインであり、ルート派生 shootward 信号用に symplastic バリアが形成されていることを示唆しています。この可能性を探るには、他の分子とのさらなる実験計画が必要である。
これまでのところ、この簡単な方法は、CFDA の安定した shootward 運動を提供することができる。この機能をさらに詳しく調べることにより、ほとんど研究されていない、感染した、または増強した根からシュートの運動を植物と区別することができます。
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Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
この研究は中国国家自然科学財団 (31671257) と湖北共同イノベーションセンター (LXT-16-18) によって賄われた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KNO3 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017218 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | |
| MgSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013018 | |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 20011160 | |
| MnSO4·H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013418 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10019818 | |
| Boric Acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10024018 | |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10008218 | |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10007216 | |
| KI | Sinopharm Chemical Reagent | 10017160 | |
| FeSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10012118 | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent | 10009717 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| KOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10017018 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent | 10021418 | |
| Myo-inositol | MACKLIN | I811835 | |
| Nicotinic Acid | MACKLIN | N814565 | |
| Pyridoxine HCl | MACKLIN | V820447 | |
| Thiamine HCl | MACKLIN | T818865 | |
| Glycine | MACKLIN | G800880 | |
| Agar powder | Novon | ZZ14022 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Zoom V16 | |
| Dissecting microscope | SDPTOP | SRE-1030 | |
| 200μl pipette | Dragon Laboratory Instruments | 713111110000-20-200ul | |
| 2.5μl pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Fine forceps | TWEEZERS | ST-15 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM-996 | |
| Stainless steel double-sided blade | Gillette | Platinum-Plus Double-Edge Blade |
References
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