이 프로토콜의 목표는 애기장 대의 아래 부분의 다른 사이트에 cfda를 로드 하는 방법을 보여주기 위한 것입니다. 그런 다음 촬영에 CF의 결과 분포 패턴을 제시 합니다.
Symplastic 트레이 서 5 (6)-carboxyfluorescein 디 아세테이트 (CFDA)는 세포 간 연결, 걸러 수송 및 혈관 패터 닝을 보여주기 위해 살아있는 식물에 널리 적용 되 고 있다. 이 프로토콜은 뿌리 절단 및 피하-핀치 과정을 각각 사용 하 여 애기 장 대의 CARBOXYFLUORESCEIN (CF) 이동을 보여준다. 이 두 가지 절차는 CF 이동의 다양 한 효율성을 초래 합니다: 약 91%는 반면에 하 부 틸 핀치 절차를 가진 촬영에서 CF의 외관, 루트 절단 절차와 CF의 약 70% 외관. 로딩 사이트의 간단한 변화는이 symplastic 염료의 이동 효율에 상당한 변화를 초래 하 고, CF 운동은 대부분 뿌리 hypocotyl 접합부에 의해 symplastic 규제 될 수 있음을 시사 한다.
다양 한 스펙트럼 특성을 가진 많은 형광 추적자 (carboxyfluorescein)1, 8 hydroxypyrene, 3, 6 트리 설파 닉 산2, 루시퍼 옐로우 CH (lych)3,에 스 컬 린 및 cter4가 개발 되어 symplastic 운동 및 걸러 활동을 모니터링 하는 식물에 적용. 일반적으로, symplastic 염료는 표적 조직에서 절단으로 로딩 되 고, 리포터의 순차적 분산은 식물의 다른 부분으로 전달 되어 세포 간 통신을 보여줄 것 이다. 염료 흡수의 메커니즘은 완전히 이해 되지 않았지만, 살아있는 세포 내부의 CF 움직임을 기본으로 하는 원리는 널리 인정 받고 있습니다. CF (CF 디 아세테이트, CFDA)의 에스테 르 형태는 비 형광 이지만 막 투과성입니다. 이 속성은 세포에 염료의 급속 한 막 확산을 허용. 살아있는 세포 내부에서, 세포내 에스테 라 제는 CFDA의 3 ‘ 및 6 ‘ 위치에서 아세테이트 그룹을 제거 하 고, 형광 및 막 불 투과성 CF를 방출 한다 (도 1을 참조 하면 라이트 외2). CF는 plasmodesmata를 통해 식물의 다른 부분으로 이동할 수 있습니다.
CFDA와 잘 확립 된 절차는 소스 잎에 로드 하 고 많은 종의 싱크 조직에서 걸러 스트리밍 및 걸러 언로드를 모니터링 하는 데 사용 될 수 있다는 것입니다, 예를 들어, 애기 장 뿌리에서 CF 언로드로5, 걸러 언로드 감자 결 절 화6동안, 니코 티아 나 세 면 대에서 걸러 하 역, 등등7잎. 유사한 하 중 접근법에 의해, 다른 연구는 숙주와 기생충 사이에 symplastic 연결을 보여주기 위해이 염료를 채택8,9, 또는 공생 관계를 공개 하는10,11.
이 염료의 사용을 확인 하는 또 다른 방법은 그것의 분포 패턴을 결정 하기 위해 마이크로 주입에 의해 특정 세포 또는 단일 세포로 그것을 로드 하는 것 이다. 이러한 정교한 기술은 특히 symplastic 도메인12의 개념의 개발에서, plasmodesmata 매개 된 세포 간 통신에 대 한 우리의 깊은 이해를 크게 촉진 했다. 예를 들어, 애기 장 대의 자 엽 세포에 cfda의 미세 주입은 표 피 층에 염료 결합 패턴을 초래 하였으나 기저 세포에서 또는 뿌리 표 피에 비 결합 하 여, 따라서 배 축의 표 피를 형성 symplastic 도메인14. 구를 가드 셀 (15)과 같은 유사 도메인, 체 성분-동반자 세포 (16), 뿌리 모 세포 (14 ) 및 루트 캡 (17 )은 미세 주입 기술에 의해 확인 되었다. 놀랍게도 일부 도메인은 추적 자가 특정 방향으로 움직일 수 있도록 합니다. 난다 도메인을 예로 들면, 지지 표 피 세포에 형광 프로브의 미세 주입은 트라이 홈 도메인에 트레이 서의 흐름에 이르게, 그러나, 역방향 주입은 진정한19을 보유 하지 않습니다. 최근의 보고서는 또한 Sedum 배아 (20)의 symplastic 도메인에서 유사한 상황을 발견 했다. 따라서 위의 모든 경우는 로딩 사이트의 스와핑이 symplastic 통신에 대 한 새로운 통찰력으로 이어질 수 있음을 의미 합니다. 우리의 이전 실험 루트-투-촬영 모바일 침묵의 경로를 해 부 하는 것을 목표로 하는 새로운 symplastic 도메인, 또는 HEJ (저 산소 접합) 영역, 루트 로딩을 통해 더 확인 되었다 (비 정식 싱크 로드) CFDA 실험21. 여기, 우리는 또한 간단한 방법을 사용 하 여 루트-촬영 CF 움직임을 정교 하 고 로딩 사이트를 이동 하 여 잠재적 인 symplastic 도메인을 복구. 또한,이 절차는 루트-촬영 장거리 전송을 변경 한 유전 배경을 차별화 하기 위해 적응 될 수 있다.
신생 연구는 식물이 실험 절차 (22)에 도입 된 조작을 포함 하는 외부 자극 (23)에 신속히 반응할 수 있다는 것을 보여주었다. 우리의 초기 실험에서,이 지식에 대 한 우리의 감독은 종종 염색 실패로 이어집니다. 이 단원에서는이 실험을 수행할 때 다음 예방 조치를 염두에 두어야 합니다. (1) 수확 후 씨앗은 저온과 낮은 수 분으로 설정 된 저장 캐비닛에 보관 해?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 중국의 국립 자연과학 재단 (31671257)과 곡물 산업 (LXT-16-18)에 대 한 후베이 공동 혁신 센터에 의해 자금을 지원 했다.
KNO3 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017218 | |
KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | |
MgSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013018 | |
CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 20011160 | |
MnSO4·H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013418 | |
Na2MoO4·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10019818 | |
Boric Acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | |
ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10024018 | |
CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10008218 | |
CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10007216 | |
KI | Sinopharm Chemical Reagent | 10017160 | |
FeSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10012118 | |
EDTA | Sinopharm Chemical Reagent | 10009717 | |
NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
KOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10017018 | |
Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent | 10021418 | |
Myo-inositol | MACKLIN | I811835 | |
Nicotinic Acid | MACKLIN | N814565 | |
Pyridoxine HCl | MACKLIN | V820447 | |
Thiamine HCl | MACKLIN | T818865 | |
Glycine | MACKLIN | G800880 | |
Agar powder | Novon | ZZ14022 | |
Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Zoom V16 | |
Dissecting microscope | SDPTOP | SRE-1030 | |
200μl pipette | Dragon Laboratory Instruments | 713111110000-20-200ul | |
2.5μl pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
Fine forceps | TWEEZERS | ST-15 | |
Parafilm | PARAFILM | PM-996 | |
Stainless steel double-sided blade | Gillette | Platinum-Plus Double-Edge Blade |