Summary
이 프로토콜의 목표는 애기장 대의 아래 부분의 다른 사이트에 cfda를 로드 하는 방법을 보여주기 위한 것입니다. 그런 다음 촬영에 CF의 결과 분포 패턴을 제시 합니다.
Abstract
Symplastic 트레이 서 5 (6)-carboxyfluorescein 디 아세테이트 (CFDA)는 세포 간 연결, 걸러 수송 및 혈관 패터 닝을 보여주기 위해 살아있는 식물에 널리 적용 되 고 있다. 이 프로토콜은 뿌리 절단 및 피하-핀치 과정을 각각 사용 하 여 애기 장 대의 CARBOXYFLUORESCEIN (CF) 이동을 보여준다. 이 두 가지 절차는 CF 이동의 다양 한 효율성을 초래 합니다: 약 91%는 반면에 하 부 틸 핀치 절차를 가진 촬영에서 CF의 외관, 루트 절단 절차와 CF의 약 70% 외관. 로딩 사이트의 간단한 변화는이 symplastic 염료의 이동 효율에 상당한 변화를 초래 하 고, CF 운동은 대부분 뿌리 hypocotyl 접합부에 의해 symplastic 규제 될 수 있음을 시사 한다.
Introduction
다양 한 스펙트럼 특성을 가진 많은 형광 추적자 (carboxyfluorescein)1, 8 hydroxypyrene, 3, 6 트리 설파 닉 산2, 루시퍼 옐로우 CH (lych)3,에 스 컬 린 및 cter4가 개발 되어 symplastic 운동 및 걸러 활동을 모니터링 하는 식물에 적용. 일반적으로, symplastic 염료는 표적 조직에서 절단으로 로딩 되 고, 리포터의 순차적 분산은 식물의 다른 부분으로 전달 되어 세포 간 통신을 보여줄 것 이다. 염료 흡수의 메커니즘은 완전히 이해 되지 않았지만, 살아있는 세포 내부의 CF 움직임을 기본으로 하는 원리는 널리 인정 받고 있습니다. CF (CF 디 아세테이트, CFDA)의 에스테 르 형태는 비 형광 이지만 막 투과성입니다. 이 속성은 세포에 염료의 급속 한 막 확산을 허용. 살아있는 세포 내부에서, 세포내 에스테 라 제는 CFDA의 3 ' 및 6 ' 위치에서 아세테이트 그룹을 제거 하 고, 형광 및 막 불 투과성 CF를 방출 한다 (도 1을 참조 하면 라이트 외2). CF는 plasmodesmata를 통해 식물의 다른 부분으로 이동할 수 있습니다.
CFDA와 잘 확립 된 절차는 소스 잎에 로드 하 고 많은 종의 싱크 조직에서 걸러 스트리밍 및 걸러 언로드를 모니터링 하는 데 사용 될 수 있다는 것입니다, 예를 들어, 애기 장 뿌리에서 CF 언로드로5, 걸러 언로드 감자 결 절 화6동안, 니코 티아 나 세 면 대에서 걸러 하 역, 등등7잎. 유사한 하 중 접근법에 의해, 다른 연구는 숙주와 기생충 사이에 symplastic 연결을 보여주기 위해이 염료를 채택8,9, 또는 공생 관계를 공개 하는10,11.
이 염료의 사용을 확인 하는 또 다른 방법은 그것의 분포 패턴을 결정 하기 위해 마이크로 주입에 의해 특정 세포 또는 단일 세포로 그것을 로드 하는 것 이다. 이러한 정교한 기술은 특히 symplastic 도메인12의 개념의 개발에서, plasmodesmata 매개 된 세포 간 통신에 대 한 우리의 깊은 이해를 크게 촉진 했다. 예를 들어, 애기 장 대의 자 엽 세포에 cfda의 미세 주입은 표 피 층에 염료 결합 패턴을 초래 하였으나 기저 세포에서 또는 뿌리 표 피에 비 결합 하 여, 따라서 배 축의 표 피를 형성 symplastic 도메인14. 구를 가드 셀 (15)과 같은 유사 도메인, 체 성분-동반자 세포 (16), 뿌리 모 세포 (14 ) 및 루트 캡 (17 )은 미세 주입 기술에 의해 확인 되었다. 놀랍게도 일부 도메인은 추적 자가 특정 방향으로 움직일 수 있도록 합니다. 난다 도메인을 예로 들면, 지지 표 피 세포에 형광 프로브의 미세 주입은 트라이 홈 도메인에 트레이 서의 흐름에 이르게, 그러나, 역방향 주입은 진정한19을 보유 하지 않습니다. 최근의 보고서는 또한 Sedum 배아 (20)의 symplastic 도메인에서 유사한 상황을 발견 했다. 따라서 위의 모든 경우는 로딩 사이트의 스와핑이 symplastic 통신에 대 한 새로운 통찰력으로 이어질 수 있음을 의미 합니다. 우리의 이전 실험 루트-투-촬영 모바일 침묵의 경로를 해 부 하는 것을 목표로 하는 새로운 symplastic 도메인, 또는 HEJ (저 산소 접합) 영역, 루트 로딩을 통해 더 확인 되었다 (비 정식 싱크 로드) CFDA 실험21. 여기, 우리는 또한 간단한 방법을 사용 하 여 루트-촬영 CF 움직임을 정교 하 고 로딩 사이트를 이동 하 여 잠재적 인 symplastic 도메인을 복구. 또한,이 절차는 루트-촬영 장거리 전송을 변경 한 유전 배경을 차별화 하기 위해 적응 될 수 있다.
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Protocol
1. 애기 장 대 MS 배지에서 수직 성장
- 층 류 캐비닛의 내부는 사용 전에 30 분의 자외선과 15 분의 공기 흐름으로 처리 해야 합니다. UV 표시등이 켜져 있을 때 유리 도어를 닫아야 합니다. 모든 공구와 플레이트를 캐비닛에 배치 하기 전에 70% 에탄올로 분무 하십시오.
- 층 류 캐비닛 아래 표준 90 mm 직경의 페 트리 디쉬에서 무라 시 게와 스 쿤 크 (MS) 배지를 준비 한다.
참고: MS 미디어에는 다음과 같은 구성 요소가 포함 되어 있습니다. 20.6 mM NH4아니오3, 18.8 mm kno3, 1.25 mm 2 PO4,1.5 mm 2· 2 시간2분, 0.1· H2o, 1.03 µ m 나2무4·2시간 3 분 0.1 mM, 30 µm 즈 소 4 · 7 월3일(일), 0.1 µ m.5시간 2 분, 0.1µ, 1.39, 97 µ FeSO4 · 114.5 µm ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 4.07 µ m 니코틴산, 2.44 µ m 피리 독신 hcl, 0.15 µ m 티 아민 Hcl 2.68 mm 글리신, 555 µ m 묘-이노 시 톨, 87.7 mm 자당 및 10G/L 한 천. - 팁 또는 이쑤시개를 MS 배지에 터치 하 여 멸 균 된 팁 또는 이쑤시개를 보습 한 다음, 시드 카드에 의해 표시 된 각 페 트리 디쉬의 고정 된 위치에 하나씩 멸 균 된 종자를 찍어 냅니다.
- 파라핀 필름과 점착 테이프를 사용 하 여 페 트리 디쉬를 밀폐 하 여 생 육 실 (22 ° c, 70%)의 맑은 스탠드에 수직으로 배치 하 고 16 시간 동안의 빛과 어둠의 8 시간 (조명으로 오전 6 시 ~ 오후 10 분)의 하루 주기로 놓습니다. 애기 장 대 식물은 파 종 후 9-13 일에 cfda 적재를 위한 준비가 되어 있습니다.
참고: 다음 절차는 오후 2 시 ~ 오후 5에서 오후에 수행 됩니다.
2. CFDA 루트 절단 절차 로드
- 사용 직전에 신선한 CFDA 작업 솔루션을 준비 하십시오. 5 µ M의 작업 농도로-20°c 냉동 고에 저장 된 1mm CFDA 원 액을 멸 균 초순 수로 희석 하십시오.
- 미세 다공성 파라핀 막 필름 ( 재료 표참조)을 3mm x 3mm 크기의 작은 조각으로 자릅니다.
- 22 ° c에서 방에서 성장 하는 식물을 발견 하 고 종이 타월과 여분의 습기를 취소 합니다. 각 루트 아래에 작은 필름 조각을 놓습니다.
참고: 이것에서 2.6 단계까지 전체 프로세스는 15 분 이내에 완료 되어야 합니다. - 식물을 배양 접시 뚜껑에 올립니다. 루트-hypocotyl 접합부 아래 약 5-10 mm의 위치에 뿌리를 자릅니다. 촬영 부분을 매체의 필름에 다시 놓습니다.
- 신중 하 게 해 부 현미경의 각 루트의 절단 끝에 CFDA의 0.25 µ L을 적용 합니다. 식물의 다른 부분에 튀는 것을 피하십시오.
- 플레이트를 덮고 성장 실에서 2-3 h (22°c)를 위해 식물을 빛 아래에 두십시오.
- 3 회 염색 한 식물을 증류수로 채워진 세 개의 분리 된 비 커에서 순차적으로 헹 구 고, 그 다음 식물을 1.4 x에서 3.3 x로 확대 한 입체 형광 현미경으로 관찰 한다 ( 재료 표참조). 형광 검출을 위해, 고효율 필터 큐브 (470/20 nm 여기, 495 nm 분할 및 525/50 nm 방출)를 사용 하 여 형광 신호를 전송 합니다.
3. hypocotyl 핀치 절차를 사용 하 여 CFDA 로드
- 사용 직전에 신선한 CFDA 작업 솔루션을 준비 하십시오. 5 µ M의 작업 농도로-20°c 냉동 고에 저장 된 1mm의 CFDA 원 액을 멸 균 초순 수 ( 재료 표참조)로 희석 하십시오.
- 미세 다공성 파라핀 막 필름 ( 재료 표참조)을 3mm x 3mm 크기의 작은 조각으로 자릅니다.
- 22 ° c에서 방에서 성장 하는 식물을 발견 하 고 종이 타월과 여분의 습기를 취소 합니다.
참고: 이것에서 3.7 단계까지 전체 프로세스는 15 분 이내에 완료 되어야 합니다. - 각 공장의 루트-저 축의 교차점 아래에 필름의 작은 조각을 놓는다.
- 집게를 사용 하 여 해 부 현미경 아래에 있는 근-저 부 틸 접합부 근처의 피하 부를 부드럽게 핀치 합니다.
- 신중 하 게 해 부 현미경 아래 상처 사이트에 CFDA의 0.1 µ L을 적용 합니다. 식물의 다른 부분에 튀는 것을 피하십시오.
- 플레이트를 덮고 2-3 h의 식물을 빛 (22°c)에서 남겨 둡니다.
- 3 회 염색 한 식물을 증류수로 채워진 세 개의 분리 된 비 커에서 순차적으로 헹 구 고, 그 다음 식물을 1.4 x에서 3.3 x로 확대 한 입체 형광 현미경으로 관찰 한다 ( 재료 표참조). 형광 검출을 위해 고효율 필터 큐브 (470/20 nm 여기, 495 nm 분할 및 525/50 nm 방출)를 탑재 하 여 형광 신호를 전송 합니다.
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Representative Results
Symplastic 운동은 종종 환경 변동에 따라 달라질 수 있습니다. 식물 성장 상태의 섭 동, 및 심지어 조직 준비의 과정은 plasmodesmata의 크기 배제 한계에 영향을 미칠 것 이다, 따라서 symplastic 수송에 영향을 미치는22. 염색 효율을 개선 하기 위해, 우리는 온도와 습기가 단단히 제어 되는 성장 실에서 우리의 작업을 제한 하 고 또한 가능한 한 빨리 전체 절차를 수행 합니다 (이상적으로 10-15 분 이내에 페 트리 디쉬의 뚜껑을 들어 올려). 실험 중 이러한 예방 조치는 실패 한 촬영 얼룩의 비율을 효과적으로 줄일 수 있습니다.
우리는 CF 촬영와 드의 움직임을 보여주기 위해 두 가지 약간 다른 절차를 설명 했다. 일반적으로 두 절차는 먹이 후 약 2 시간 동안 촬영에서 CF 염색을 초래할 수 있습니다 (그림 2). 그럼에도 불구 하 고, 두 절차는 다른 염색 효율성을 생산 하 고 있습니다. 하 부 틸-핀치 절차는 91% 염색 효율을 초래 하는 반면, 루트 절단 절차는 70% (웰 치의 t-테스트, p < 0.001)를 생성 합니다 (그림 3). 우리는 또한 뿌리 핀치 방법에 의해 염료를 로드 시도 하 고 루트 절단 방법에 비해 훨씬 더 낮은 염색 효율을 발견, 루트에 염료를 로드 하는 접근 방식은 루트와 저 축의 염색 차이를 고려 하지 않는 것을 시사 사이트 로드 (그림 3) CF 신호는 주로 혈관 구조에서 발견 되지만, 다른 거 대 분자 운동 패턴 (21)에서 보이는 바와 같이 반 잎 패턴 (그림 2)을 보여주는 몇 개의 식물만 있습니다. 일단 CF 신호가 촬영으로 확산 되 면, 그것은 72 이상에 대 한 유지 될 수 있으며, 신호는 다른 세포 유형에 더 내릴 수 없습니다; 이것은 이전에 게시 된 결과와 일치17.
그림 1 : CFDA 통풍 관 및 식물 세포의 CF 이동에 대 한 도식 적 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 씨 파의 9, 11, 13 일 후의 촬영 시 CF 시그널 (DAS) 애기 장 대 식물. CF 신호는 cotyledons와 진정한 잎 (A, B, C) 모두에서 검출 될 수 있다. 식물의 대다수에서, CF 신호는 뿌리 절단 또는 피하-핀치 방법 중 하나를 사용 하 여 2-3 시간 후에 혈관 구조에서 관찰 됩니다. 매우 드문 경우에만 (0.5% 미만), 상기 하 부 틸-핀치 법은 7 개 DAS 애기 장 대 (D)의 자 엽에서 부분적인 염색 패턴을 생성할 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 루트 로딩 방법 (근 력 절단 및 근 끼 임)과 저 부 틸 핀치 법으로 염색 효율이 높아집니다. 9 DAS 식물에서의 염색 효율은 3 개의 독립 실험에서 결정 하였으며, 뿌리를 꼬 집는 실험에서 n=26; n = 335을 절단 522 실험 하는 방법). 오류 막대는 표준 오류를 나타냅니다. p < 0.001을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
신생 연구는 식물이 실험 절차 (22)에 도입 된 조작을 포함 하는 외부 자극 (23)에 신속히 반응할 수 있다는 것을 보여주었다. 우리의 초기 실험에서,이 지식에 대 한 우리의 감독은 종종 염색 실패로 이어집니다. 이 단원에서는이 실험을 수행할 때 다음 예방 조치를 염두에 두어야 합니다. (1) 수확 후 씨앗은 저온과 낮은 수 분으로 설정 된 저장 캐비닛에 보관 해야 합니다. (2) 식물의 조작, 특히 캐비닛의 공기에 대 한 노출은 최소한의 시간으로 유지 되어야 합니다. (3) 실험 조건은 일정 하 게 유지 되어야 하며, 예를 들어, 모든 절차는 성장 실에서 수행 되어야 한다.
지적 되어야 하는이 실험의 또 다른 측면은 CFDA의 로딩 볼륨이 가능한 한 작게 유지 되어야 한다는 것입니다. 과잉 솔루션은 종종 과잉 CFDA 용액이 모 세관 작용을 통해 촬영까지 확산 될 수 있는 유물로 이어지고,이로 인해 젊은 싱크대 잎의 상체를 착 색 시킵니다. 이미징 전에 세척 단계는이 아티팩트를 감소 시킬 수 있지만, 가장 좋은 방법은 과잉 용액으로 인 한 합병증을 피하기 위해 최소 양을 로드 하는 것입니다.
이러한 기술적 예방 조치를 통해 CFDA의 루트-촬영 움직임을 그림 2와 같이 안정적으로 관찰할 수 있습니다. 식물이 나이가 될 때, 24 일을 통해 말, 애기 장 대 식물은 우리가 아직 정확한 설명을 발견 하지 않은 촬영에 CF를 전송 하는 기능을 잃을 것 같다. 하나의 가능한 단서는 그것의 세포내 축적에서 온다. 라이트에 의해 보고서에 따르면2, CF는 액 포에 의해 서 시 퀀 트 될 책임이 있습니다, 따라서, 트랜스 로케이션의 과정을 통해 세포내 무료 CF는 노화 식물의 더 큰 액 포에 격리 점차적으로 감소.
이 절차의 한 가지 명백한 특징은 촬영에서 CF의 분포 패턴입니다. 이러한 혈관 패턴은 소스 잎1,24,25에 염료를 적재 하 여 염료가 걸러를 통해 이동 하는 환상으로 이어지는 것을 연상 시킨다. 사실은, 루트는 강한 싱크 조직과 CFDA의 총격전 운동 걸러 스트리밍에 대 한 간다 사실을 감안할 때 CF의 바닥 대 상단 트랜스 로케이션은 걸러을 통해 달성 되지 않을 수 있습니다. 오히려,이 과정은 botha에 의해 도시 된 바와 같이 자일 럼 수송에 의해 촉진 될 수 있다25. 간략하게, cfda는 자일 럼 세포에서 처리 되 고 걸러 stream25의 체 성분에 더 트랜스 위치 하는 자일 럼 용기를 통해 채택 될 수 있습니다. 따라서, 이러한 방법으로 로딩 실험은 걸러의 활성을 반영 하지 않을 수 있지만, 강력한 형광이 검출 될 수 있으므로 CF의 symplastic 운동이 발생 해야 한다. 즉,이 바닥 대 탑 CF 운동은 실질 세포를 통해 결합 된 자일 럼 수송 및 symplastic 전송 될 수 있습니다.
Symplastic 전송 되는 경우는 종종 symplastic 도메인 형성13, 그리고 특정 상황에서 단방향 전송19,20을 표시 합니다. 빠른 확인을 위한 한 가지 방법은 로딩 사이트를 이동 하는 것입니다. 실제로, 우리는 동일한 방법을 사용 하 여이 과정을 정교 하 게 할 때, 우리는 루트 쪽에서 피하 측에 근 위 측에 위치 하 중에 대 한 로딩 사이트의 간단한 변화를 발견, 뿌리-배 축의 접합, cfda 모바일 효율의 상당한 변화를 초래할 것 이다 (그림 3). 명백한 로딩 사이트에의 한 CF 모바일 차별화는 루트-hypocotyl 접합부가 다른 symplastic 도메인 이라는 것을 시사 할 것 이며, 여기서 symplastic 장벽이 루트에서 파생 된 총격전 신호에 대해 형성 됩니다. 이 가능성을 탐구 하기 위하여 그밖 분자를 가진 추가 실험적인 디자인은 필요 합니다.
지금까지,이 간단한 방법은 CFDA의 안정적인 총격전 움직임을 제공 할 수 있습니다. 이 기능은 더 이상 연구 되지 않은 손상 되거나 향상 된 루트-촬영 움직임을 가진 식물을 구별 하기 위해 탐구 될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국의 국립 자연과학 재단 (31671257)과 곡물 산업 (LXT-16-18)에 대 한 후베이 공동 혁신 센터에 의해 자금을 지원 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KNO3 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017218 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | |
| MgSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013018 | |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 20011160 | |
| MnSO4·H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013418 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10019818 | |
| Boric Acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10024018 | |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10008218 | |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10007216 | |
| KI | Sinopharm Chemical Reagent | 10017160 | |
| FeSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10012118 | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent | 10009717 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| KOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10017018 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent | 10021418 | |
| Myo-inositol | MACKLIN | I811835 | |
| Nicotinic Acid | MACKLIN | N814565 | |
| Pyridoxine HCl | MACKLIN | V820447 | |
| Thiamine HCl | MACKLIN | T818865 | |
| Glycine | MACKLIN | G800880 | |
| Agar powder | Novon | ZZ14022 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Zoom V16 | |
| Dissecting microscope | SDPTOP | SRE-1030 | |
| 200μl pipette | Dragon Laboratory Instruments | 713111110000-20-200ul | |
| 2.5μl pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Fine forceps | TWEEZERS | ST-15 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM-996 | |
| Stainless steel double-sided blade | Gillette | Platinum-Plus Double-Edge Blade |
References
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