Summary
Målet med denne protokollen er å vise hvordan du laster CFDA inn i ulike områder av de nederste delene av Arabidopsis. Vi presenterer deretter den resulterende fordelingen mønster av CF i skuddene.
Abstract
Symplastic Tracer 5 (6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) har blitt mye brukt i levende planter for å demonstrere intercellulære forbindelse, phloem transport og vaskulær mønster. Denne protokollen viser den nederste til toppen carboxyfluorescein (CF) bevegelse i Arabidopsis ved hjelp av rot-skjæring og hypocotyl-knipe prosedyren hhv. Disse to prosedyrene gir ulik effektivitet i CF-bevegelsen: ca 91% av CF i skuddene med hypocotyl-knipe prosedyre, mens det bare er ca 70% av CF med rot-skjæring prosedyre. Den enkle endringen av lasting nettsteder, noe som resulterer i betydelige endringer i den mobile effektiviteten av denne symplastic fargestoff, antyder CF bevegelse kan være gjenstand for symplastic regulering, mest trolig av root-hypocotyl Junction.
Introduction
Mange fluorescerende Bevegelsesuskarphet med en rekke Spectral egenskaper, for eksempel 5 (6)-carboxyfluorescein (CF)1, 8-hydroxypyrene-1, 3, 6-trisulphonic acid2, LUCIFER Yellow ch (LYCH)3, Esculin og CTER4, har blitt utviklet og anvendt inne planter å dataskjerm symplastic bevegelse og phloem aktivitet. Vanligvis en symplastic fargestoff er lastet inn i et kutt i målet vev og sekvensiell dispersjon av reporteren i andre deler av anlegget vil demonstrere intercellulære kommunikasjon. Selv om mekanismen av fargestoff absorpsjon ikke er fullt ut forstått, har prinsippet underliggende CF-bevegelse i levende celler blitt allment anerkjent. Ester formen av CF (CF diacetate, CFDA) er ikke-fluorescerende, men membran gjennomtrengelig. Denne egenskapen tillater rask membran diffusjon av fargestoff i celler. Når du er inne i levende celler, intracellulære esterazami fjerne acetate grupper på 3 ' og 6 ' posisjon CFDA, slippe fluorescerende og membran-ugjennomtrengelig CF (figur 1, alternativt henvise Wright et al.2); CF kan deretter gå gjennom Plasmodesmata til andre deler av planter.
En veletablert prosedyre med CFDA er at den kan lastes inn i kilden blader og brukes til å overvåke phloem streaming og phloem lossing i vasken vev av mange arter, for eksempel, som CF lossing i Arabidopsis root5, phloem lossing under potet tuberization6, phloem lossing i Nicotiana vasken blader7, og så videre. Ved lignende lasting tilnærminger, har andre studier vedtatt dette fargestoff å demonstrere symplastic sammenhengen mellom verten og parasitten8,9, eller for å avdekke symbiotisk forhold10,11.
En annen måte å gjøre bruk av dette fargestoffet er å laste det inn i bestemte celler eller en enkelt celle ved microinjection å bestemme dens fordelings mønster. Slike sofistikerte teknikker har i stor grad tilrettelagt vår dypere forståelse av Plasmodesmata-mediert intercellulære kommunikasjon, spesielt i utviklingen av begrepet symplastic Domain12,13. For eksempel microinjection av CFDA i cotyledon celler av Arabidopsis resulterte i Dye-kopling mønster i hypocotyl epidermis, men ikke-kopling i de underliggende cellene eller i roten epidermis, derfor hypocotyl epidermis danner en symplastic domene14. Lignende domener, for eksempel nålene Guard Cells15, sil element-Companion Cells16, rot hårceller14 og root cap17,18 har blitt identifisert av microinjection teknikk. Mest overraskende, noen domener tillate Tracer molekyler til å bevege seg i en bestemt retning. Ta Trichome domenet for eksempel microinjection av en fluorescerende sonde inn i støtte epidermal cellen fører til flyten av Tracer inn i Trichome domenet, men omvendt injeksjon ikke holder sant19. En fersk rapport har også funnet lignende situasjoner i symplastic domener av Sedum embryo20. Dermed, alle ovennevnte tilfeller antyde at bytte av lasting nettsteder kan føre til romanen innsikt i symplastic kommunikasjon. Våre foregående eksperiment satsing å analysere ruten av rot-å-skudd transportabel deaktivere kjennemerke en romersk symplastic domenen, eller det HEJ (Hypocotyl-epicotyl Junction) sone, hvilke var fremme bekreftet igjennom det rot-lessing (ingen-Canonical synke-lessing) CFDA eksperiment21. Her, vi videre utdype root-to-Shoot CF bevegelse ved hjelp av en enkel metode og gjenopprette en potensiell symplastic domene ved skiftende lasting nettsteder. Videre kan denne prosedyren tilpasses til å differensiere genetisk bakgrunn som har endret rot-til-Shoot langdistanse transport.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Arabidopsis vertikal vekst i MS medium
- Interiøret i laminær Flow kabinett må behandles med 30 min UV-lys og 15 min luftstrøm før bruk. Pass på at du lukker glassdøren når UV-lyset er på. Spray alle verktøy og plater med 70% etanol før du plasserer dem i skapet.
- Forbered Murashige og Skoog (MS) medium i en standard 90 mm diameter Petri parabolen under en laminær Flow kabinett.
Merk: MS-mediet inneholder følgende komponenter: 20,6 mM NH4no3, 18,8 mM kno3, 1,25 mM KH2PO4, 1,5 mm MgSO4· 7H2o, 3 mm CaCl2· 2h2o, 0,1 mm MnSO4· H2O, 1,03 μM na2MoO4· 2H2o, 0,1 mm H3bo3, 30 μM ZnSO4· 7H2o, 0,1 μM CuSO4· 5h2o, 0,1 μM CoCl2· 6h2o, 1,39 μm KI, 97 μ M FeSO4 · 7H2O, 114,5 μm ethylenediaminetetraacetic yre (EDTA), 4,07 ΜM nikotins syre, 2,44 μm pyridoksin hcl, 0,15 μm Tiamin hcl, 2,68 mm glycine, 555 μM Myo-inositol, 87,7 mm sukrose og 10 g/L agar. - Fukte sterilisert tips eller tannpirkere ved å berøre spissen eller tannpirkere til MS medium, deretter dyppe den sterilisert frø en etter en på fast stilling av hver Petri parabolen indikert av seeding kortet.
- Forsegle Petri parabolen med parafin film og klebrig tape og plassere den vertikalt på en klar stand i en vekst rom (22 ° c, 70% fuktighet) med en dag syklus på 16 h av lys og 8 h av mørket (belysning fra 6 am til 10 PM). Den Arabidopsis anlegget er klar for CFDA lasting på dag 9-13 etter såing.
Merk: følgende prosedyre er utført på ettermiddagen fra 2 pm til 5 PM.
2. CFDA lasting med roten kutte prosedyren
- Forbered frisk CFDA arbeids løsning umiddelbart før bruk. Fortynne 1 mM CFDA lagerløsning lagret i-20 ° c fryser med sterilt ultrarent vann til en fungerende konsentrasjon på 5 μM.
- Skjær mikro-porøse para fin membran film (se tabell over materialer) i små biter på 3 mm x 3 mm størrelse.
- Avdekke de voksende plantene i rommet ved 22 ° c og fjerne overflødig fuktighet med et papir håndkle. Plasser de små film bitene under hver rot.
Merk: fra denne til trinn 2,6, hele prosessen skal være ferdig innen 15 min. - Løft plantene på Petri fatet lokket. Skjær røttene i en posisjon ca 5-10 mm under roten-hypocotyl krysset. Plasser skyte del tilbake på filmen på mediet.
- Påfør forsiktig 0,25 μL av CFDA på skjære enden av hver rot under et dissekere mikroskop. Unngå sprut til andre deler av anlegget.
- Dekkplaten og la plantene under lys for 2-3 h (22 ° c) i vekst rommet.
- Skyll beiset plantene tre ganger sekvensielt i tre separate kanner fylt med destillert vann, deretter observere plantene under et stereo-fluorescens mikroskop med zoom fra 1,4 x til 3.3 x (se tabell over materialer). For fluorescens deteksjon, bruk en høy virkningsgrad filter kube (470/20 NM eksitasjon, 495 NM splitt og 525/50 NM utslipp) montert for å overføre fluorescens signalet.
3. CFDA lasting med hypocotyl-knipe prosedyre
- Forbered frisk CFDA arbeids løsning umiddelbart før bruk. Fortynne 1 mM CFDA lagerløsning lagret i-20 ° c fryser med sterilt ultrarent vann (se materialfortegnelsen) til en arbeids konsentrasjon på 5 μM.
- Skjær mikro-porøse para fin membran film (se tabell over materialer) i små biter på 3 mm x 3 mm størrelse.
- Avdekke de voksende plantene i rommet ved 22 ° c og fjerne overflødig fuktighet med et papir håndkle.
Merk: fra denne til trinn 3,7, hele prosessen skal være ferdig innen 15 min. - Legg et lite stykke film under roten-hypocotyl knutepunkt for hver plante.
- Bruk tang for å forsiktig klemme hypocotyl nær rot-hypocotyl krysset under et dissekere mikroskop.
- Påfør forsiktig 0,1 μL av CFDA på sårstedet under et dissekere mikroskop. Unngå sprut til andre deler av anlegget.
- Dekkplaten, og la plantene under lys (22 ° c) for 2-3 h.
- Skyll beiset plantene tre ganger sekvensielt i tre separate kanner fylt med destillert vann, deretter observere plantene under et stereo-fluorescens mikroskop med zoom fra 1,4 x til 3.3 x (se tabell over materialer). For fluorescens deteksjon, montere en høy virkningsgrad filter kube (470/20 NM eksitasjon, 495 NM splitt og 525/50 NM utslipp) til å overføre fluorescens signalet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Symplastic bevegelser er ofte gjenstand for miljømessige svingninger. Forstyrrelsene av planten voksende tilstand, og selv prosessen med vev forberedelse vil påvirke størrelsesgrensen utelukkelse av Plasmodesmata, og dermed påvirke symplastic transport22. For å forbedre farging effektivitet, begrenser vi vår drift i vekst rommet, hvor temperaturen og fuktighet er strengt kontrollert, og også utføre hele prosedyren så raskt som mulig (ideelt innen 10-15 min etter løfte lokket av Petri parabol). Disse forholdsreglene under et eksperiment kan effektivt redusere frekvensen av mislykkede skyte flekker.
Vi beskrev to litt forskjellige prosedyrer for å demonstrere CF Shoot-Ward bevegelse. Normalt kan begge prosedyrene føre til at CF flekker i skuddene ca 2 h etter fôring (figur 2). Likevel gir de to prosedyrene ulik farge effektivitet. Hypocotyl-knipe prosedyren resulterer i 91% farging effektivitet, mens rot-skjæring prosedyren produserer 70% (Welch ' s t-test, p < 0,001) (Figur 3). Vi har også prøvd lasting av fargestoff av en rot-knipe metode og funnet en enda lavere farging effektivitet sammenlignet med root-cutting metode, noe som tyder på at tilnærmingen til å laste fargestoff i roten ikke står for farging forskjellen mellom roten og hypocotyl lasting av nettsteder (Figur 3). CF-signalet finnes hovedsakelig i blodkar, men bare noen få planter viser halv Bladmønsteret (figur 2) som sett i andre Makromolekyl bevegelsesmønstre21. Når CF signalet er spredt til skyte, kan det opprettholdes for mer enn 72 h og signalet kan ikke losse videre til andre celletyper; Dette er i overensstemmelse med tidligere publiserte resultater17.
Figur 1 : En skjematisk illustrasjon for CFDA-opptak og CF-bevegelse i anleggets celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : CF signal i skuddene på 9, 11 og 13 dag etter såing (Das) Arabidopsis plantene. CF signal kan oppdages i både cotyledons og sanne blader (A, B, C). I de fleste planter er CF-signalet observert i blodkar etter 2-3 timers lasting med enten rot-skjæring eller hypocotyl-knipe metoden. Bare i en svært sjeldne tilfeller (mindre enn 0,5%), hypocotyl-knipe metoden kan generere en delvis farging mønster i cotyledon av 7 DAS Arabidopsis (D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Farging effektivitet med root-lasting metoden (root-skjæring og root-knipe) og hypocotyl-knipe metode. Den farging effektivitet i 9 DAS planter ble bestemt i tre uavhengige eksperimenter (n = 26 i roten-knipe eksperiment; n = 335 i roten-skjæring eksperiment; n = 522 i hypocotyl-knipe metoden). Feil linjen angir standard feil. indikerer p < 0,001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Emerging studier har vist at plantene kan raskt svare på eksterne stimuli23, inkludert manipulasjon introdusert til den eksperimentelle prosedyrer22. I vårt første eksperiment fører vår forglemmelse av denne kunnskapen ofte til farging svikt. Med disse leksjonene, foreslår vi at følgende forholdsregler bør holdes i bakhodet når du utfører dette eksperimentet: (1) frøene etter høsting bør oppbevares i et kabinett satt til en lav temperatur og lav fuktighet; (2) manipulering av planter, særlig eksponering for luft i kabinettet, bør holdes på et minimum tid; (3) de eksperimentelle forholdene bør holdes konstant, for eksempel, alle prosedyrene skal utføres i en vekst rom.
Et annet aspekt i dette eksperimentet som må påpekt er at lasting volumet av CFDA bør holdes så liten som mulig. Overflødig løsning fører ofte til gjenstander der overflødig CFDA løsningen kan diffus opp til skyte gjennom kapillær handling, og dermed missfarging av trichomes av unge synke blader. Selv om et vasketrinn før bildebehandling kan redusere denne gjenstanden, er den beste tilnærmingen å laste et minimumsbeløp for å unngå komplikasjoner forårsaket av overflødig løsning.
Med disse tekniske forholdsreglene løst, kan rot-til-skudd bevegelse av CFDA være stabilt observert som vist i figur 2. Når plantene blir eldre, sier over 24 dager, Arabidopsis plantene ser ut til å miste evnen til å overføre CF til skyte, som vi ennå ikke har funnet en eksakt forklaring. En mulig ledetråd kommer fra dens intracellulære akkumulering. Ifølge rapportene av Wright et al.2, er CF ansvarlig for å bli sequestrated av vakuoler, derfor er INTRACELLULÆRE gratis CF i løpet av translokasjon reduseres gradvis til opptak i de større vakuoler av aldrende planter.
En åpenbar funksjon i denne prosedyren er fordelingen mønster av CF i skyte. Dette vaskulær mønster minner om de ved lasting av fargestoff i kilde bladet1,24,25, og dermed fører til en illusjon at fargestoff også beveger seg gjennom phloem. Faktisk kan bunn-til-topp translokasjon av CF ikke oppnås gjennom phloem gitt det faktum at roten er en sterk vask vev og shootward bevegelse av CFDA går mot phloem streaming. I stedet kan denne prosessen bli muliggjort av xylem transport som vist av Botha et al.25. Kort sagt kan CFDA tas opp gjennom xylem-fartøy, behandles i parenchyma celler og videre translocated til sil element av phloem stream25. Derfor kan innlastings forsøket på denne måten ikke gjenspeile aktiviteten til phloem, men den symplastic bevegelsen av CF må forekomme ettersom den sterke fluorescens kan oppdages. Med andre ord, denne bunn-til-topp CF bevegelsen kan skyldes den kombinerte xylem transport og symplastic transport gjennom parenchyma celler.
Symplastic transport er ofte underlagt Symplastic domene formasjon13, og i enkelte tilfeller viser den enveistransport19,20. En måte for en rask sjekk er å skifte lasting nettsteder. Faktisk, når vi utarbeidet denne prosessen ved hjelp av samme metode, fant vi den enkle endringen av lasting området, fra root side til hypocotyl side proksimale til root-hypocotyl veikryss, vil resultere i betydelig endring av CFDA mobile effektivitet (Figur 3). CF mobil differensiering på grunn av den distinkte lasting nettsteder ville foreslå at root-hypocotyl krysset er et annet symplastic domene, der symplastic barriere er dannet for rot-avledet shootward signaler. Videre eksperimentell design med andre molekyler er nødvendig for å utforske denne muligheten.
Så langt kan denne enkle metoden gi stabil shootward bevegelse av CFDA. Denne funksjonen kan bli ytterligere utforsket for å skille planter med kompromittert eller forbedret root-to-Shoot bevegelse som har sjelden blitt studert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Natural Science Foundation i Kina (31671257) og Hubei Collaborative Innovasjonssenter for korn industrien (LXT-16-18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KNO3 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017218 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | |
| MgSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013018 | |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 20011160 | |
| MnSO4·H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013418 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10019818 | |
| Boric Acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10024018 | |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10008218 | |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10007216 | |
| KI | Sinopharm Chemical Reagent | 10017160 | |
| FeSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10012118 | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent | 10009717 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| KOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10017018 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent | 10021418 | |
| Myo-inositol | MACKLIN | I811835 | |
| Nicotinic Acid | MACKLIN | N814565 | |
| Pyridoxine HCl | MACKLIN | V820447 | |
| Thiamine HCl | MACKLIN | T818865 | |
| Glycine | MACKLIN | G800880 | |
| Agar powder | Novon | ZZ14022 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Zoom V16 | |
| Dissecting microscope | SDPTOP | SRE-1030 | |
| 200μl pipette | Dragon Laboratory Instruments | 713111110000-20-200ul | |
| 2.5μl pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Fine forceps | TWEEZERS | ST-15 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM-996 | |
| Stainless steel double-sided blade | Gillette | Platinum-Plus Double-Edge Blade |
References
- Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. 6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation. American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).
- Wright, K. M., Oparka, K. J. The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy. Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport. Planta. 176 (4), 533-540 (1988).
- Knoblauch, M., et al. Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications. Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).
- Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis. The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).
- Viola, R., et al. Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading. The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).
- Roberts, A. G., et al. Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus. The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).
- Péron, T., et al. New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel). Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).
- Spallek, T., et al. Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).
- Complainville, A., et al. Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species. The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).
- Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules. Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).
- Robards, A. W., Lucas, W. J. Plasmodesmata. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).
- Roberts, A. G., Oparka, K. J. Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).
- Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).
- Palevitz, B. A., Hepler, P. K. Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow. Planta. 164 (4), 473-479 (1985).
- van Bel, A. J. E., Kempers, R. Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems. Planta. 183 (1), 69-76 (1991).
- Erwee, M. G., Goodwin, P. B. Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch. Planta. 163 (1), 9-19 (1985).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).
- Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata. Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).
- Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae). Planta. 245 (3), 491-505 (2017).
- Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement. Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).
- Radford, J. E., White, R. G. Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits. Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).
- Kollist, H., et al. Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network. Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).
- Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley. Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).
- Botha, C. E. J., et al. A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis? Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).
