Summary
O objetivo deste protocolo é mostrar como carregar o CFDA em diferentes locais das partes inferiores de Arabidopsis. Apresentamos, então, o padrão de distribuição resultante da FC nas brotações.
Abstract
O Tracer symplastic 5 (6)-o diacetato do carboxyfluorescein (CFDA) foi aplicado extensamente em plantas vivas para demonstrar a conexão intercelular, o transporte do floema e o patterning vascular. Este protocolo mostra o movimento de carboxifluoresceína (CF) de baixo para cima na Arabidopsis usando o procedimento de corte radicular e o hipocótilo-pinching, respectivamente. Estes dois procedimentos diferentes resultam em eficiências diferentes do movimento do CF: aproximadamente 91% de aparência de CF nos tiros com o procedimento hypocotyl-beliscando, visto que somente aproximadamente 70% de aparência de CF com o procedimento da raiz-estaca. A simples mudança de locais de carregamento, resultando em mudanças significativas na eficiência móvel deste corante symplastic, sugere que o movimento CF pode estar sujeito à regulação symplastic, provavelmente pela junção raiz-hipocótilo.
Introduction
Muitos traçadores fluorescentes com uma escala de propriedades espectrais, tais como 5 (6)-carboxyfluorescein (CF)1, 8-hydroxypyrene-1, 3, 6-trisulphonic o ácido2, Lúcifer ch amarelo (lych)3, esculin e CTER4, foram desenvolvidos e aplicado em plantas para monitorar o movimento symplastic e a atividade do floema. Geralmente, uma tintura symplastic é carregada em um corte no tecido do alvo e a dispersão seqüencial do repórter em outras partes da planta demonstrará a comunicação intercelular. Embora o mecanismo da absorção da tintura não seja compreendido inteiramente, o movimento subjacente do CF do princípio dentro das pilhas vivas foi reconhecido extensamente. A forma de éster de CF (diacetato de CF, CFDA) é não-fluorescente, mas membrana-permeável. Esta propriedade permite a difusão rápida da membrana da tintura em pilhas. Uma vez dentro das células vivas, as esterases intracelulares removem os grupos de acetato na posição 3 ' e 6 ' do CFDA, liberando a FC fluorescente e membrana-impermeable (Figura 1, alternativamente, consulte Wright et al.2); O CF pode então mover-se através dos plasmodesmos a outras partes das plantas.
Um procedimento bem estabelecido com CFDA é que ele pode ser carregado em folhas de origem e usado para monitorar o fluxo de floema e descarga de floema nos tecidos de pia de muitas espécies, por exemplo, como a descarga de CF na raiz de Arabidopsis 5, descarregamento de floema durante a tuberização da batata6, o descarregamento de floema no dissipador de Nicotiana deixa7, e assim por diante. Por abordagens similares de carga, outros estudos adotaram esse corante para demonstrar a conexão symplastic entre hospedeiro e parasita8,9, ou para revelar as relações simbióticas10,11.
Outra maneira de fazer uso deste corante é carregá-lo em células específicas ou célula única por microinjeção para determinar o seu padrão de distribuição. Tais técnicas sofisticadas facilitaram muito nossa compreensão mais profunda da comunicação intercelular mediada por Plasmodesmata, particularmente no desenvolvimento do conceito de domínio symplastic12,13. Por exemplo, a microinjeção de CFDA em células cotiledôneas de Arabidopsis resultou no padrão de acoplamento de corante na epiderme do hipocótilo, mas não acoplamento nas células subjacentes ou na epiderme radicular, portanto, a epiderme do hipocótilo forma uma domínio symplastic14. Domínios semelhantes, como as células de guarda estomática15, células de companheiro de peneira16, células de cabelo raiz14 e tampão de raiz17,18 foram identificados por técnica de microinjeção. Mais surpreendentemente, alguns domínios permitem que as moléculas traçadoras se movam em uma determinada direção. Tome o domínio do tricomas por exemplo, microinjection de uma ponta de prova fluorescente na pilha epidérmica de apoio conduz ao fluxo do Tracer no domínio do tricomas, entretanto, a injeção reversa não segura19verdadeiro. Um relatório recente também encontrou situações semelhantes nos domínios symplastic do embrião de Sedum 20. Assim, todos os casos acima implicam que a troca de locais de carregamento pode levar a novas percepções sobre a comunicação symplastic. Nosso experimento anterior com o objetivo de dissecar a rota de silenciamento móvel root-to-shoot identificou um novo domínio symplastic, ou a zona de HEJ (Hipócotilo-epicotyl Junction), que foi ainda verificada através do CFDA de carregamento de raízes (coletor não canônico) experimento21. Aqui, Nós elaboramos ainda mais o movimento da raiz para disparar CF usando um método simples e recupero um domínio symplastic potencial deslocando os locais de carregamento. Além disso, este procedimento pode ser adaptado para diferenciar origens genéticas que alteraram o transporte de longa distância root-to-shoot.
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Protocol
1. crescimento vertical de Arabidopsis no meio do MS
- O interior do armário do fluxo laminar precisa de ser tratado com a luz UV de 30 minutos e o fluxo de ar de 15 minutos antes do uso. Certifique-se de fechar a porta de vidro quando a luz UV está ligado. Pulverize todas as ferramentas e placas com 70% de etanol antes de colocá-las no armário.
- Prepare o meio Murashige e Skoog (MS) em um prato de Petri padrão de 90 mm de diâmetro um gabinete de fluxo laminar.
Nota: o meio MS contém os seguintes componentes: 20,6 mM NH4no3, 18,8 mm kno3, 1,25 mm KH2po4, 1,5 mM MgSO4· 7h2o, 3 mm CAcl2· 2h2o, 0,1 mm mnso4· H2o, 1, 3 μm na2Moo4· 2h2o, 0,1 mm H3Bo3, 30 μm Znso4· 7h2o, 0,1 μm CuSO4· 5h2o, 0,1 μm cocl2· 6h2o, 1,39 μm Ki, 97 μ M FeSO4 · 7h2O, ácido etilenodiaminotetracético de 114,5 μm (EDTA), ácido nicotínico de 4, 7 μm, HCL do piridoxina de 2,44 μm, HCL do tiamina de 0,15 μm, Glycine de 2,68 milímetros, 555 μm Myo-inositol, sacarose de 87,7 mm e Agar 10 g/L. - Hidratar as pontas ou palitos esterilizados tocando a ponta ou palitos para o meio MS, em seguida, mergulhe as sementes esterilizadas um por um na posição fixa de cada placa de Petri indicada pelo cartão de semeadura.
- Selar o prato de Petri com película de parafina e fita adesiva e colocá-lo verticalmente em um stand claro em uma sala de crescimento (22 ° c, 70% de umidade) com um ciclo de dia de 16 h de luz e 8 h de escuridão (iluminação das 6 am às 10 horas). A planta de Arabidopsis está pronta para o carregamento de CFDA no dia 9-13 após a semeadura.
Nota: o procedimento a seguir é realizado na parte da tarde de 2 PM a 5 PM.
2. carregamento de CFDA com o procedimento de corte da raiz
- Prepare a solução de trabalho CFDA fresca imediatamente antes de usar. Diluir a solução conservada em estoque de 1 milímetro CFDA armazenada no congelador de-20 ° c com água estéril do ultrapura a uma concentração de trabalho de 5 μm.
- Corte a película microporosa da membrana da parafina (veja a tabela de materiais) em partes pequenas de 3 milímetros x 3 milímetros de tamanho.
- Descubra as plantas crescentes no quarto em 22 ° c e limpe o excesso de umidade com uma toalha de papel. Coloc as partes pequenas da película abaixo de cada raiz.
Nota: a partir deste para o passo 2,6, todo o processo deve ser concluída dentro de 15 min. - Levante as plantas na tampa do prato de Petri. Corte as raízes em uma posição de cerca de 5-10 mm abaixo da junção raiz-hipocótilo. Coloque a parte do tiro de volta para o filme no meio.
- Aplique com cuidado 0,25 μL de CFDA na extremidade de corte de cada raiz um microscópio de dissecação. Evite espirrar para outras partes da planta.
- Cubra a placa e deixe as plantas a luz para 2-3 h (22 ° c) na sala de crescimento.
- Enxágüe as plantas manchadas três vezes sequencialmente em três copos separados enchidos com a água destilada, a seguir Observe as plantas um microscópio da estéreo-fluorescência com zumbido de 1.4 x a 3.3 x (veja a tabela de materiais). Para detecção de fluorescência, use um cubo de filtro de alta eficiência (470/20 nm de excitação, 495 nm Split e 525/50 nm de emissão) montado para transmitir o sinal de fluorescência.
3. carregamento de CFDA com procedimento do hypocotyl-beliscar
- Prepare a solução de trabalho CFDA fresca imediatamente antes de usar. Diluir a solução conservada em estoque de 1 milímetro CFDA armazenada no congelador de-20 ° c com água estéril do ultrapura (veja a tabela de materiais) a uma concentração de trabalho de 5 μm.
- Corte a película microporosa da membrana da parafina (veja a tabela de materiais) em partes pequenas de 3 milímetros x 3 milímetros de tamanho.
- Descubra as plantas crescentes no quarto em 22 ° c e limpe o excesso de umidade com uma toalha de papel.
Nota: a partir deste para o passo 3,7, todo o processo deve ser concluída dentro de 15 min. - Coloque um pequeno pedaço de filme a junção raiz-hipocótilo de cada planta.
- Use o fórceps para beliscar delicadamente o hipocótilo próximo à junção da raiz-hipocótilo um microscópio de dissecação.
- Aplique com cuidado 0,1 μL de CFDA no local da ferida um microscópio de dissecação. Evite espirrar para outras partes da planta.
- Cubra a placa, e deixe as plantas a luz (° c 22) para 2-3 h.
- Enxágüe as plantas manchadas três vezes sequencialmente em três copos separados enchidos com a água destilada, a seguir Observe as plantas um microscópio da estéreo-fluorescência com zumbido de 1.4 x a 3.3 x (veja a tabela de materiais). Para a detecção de fluorescência, montar um cubo de filtro de alta eficiência (470/20 nm de excitação, 495 nm Split e 525/50 nm de emissão) para transmitir o sinal de fluorescência.
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Representative Results
O movimento symplastic é frequentemente sujeito às flutuações ambientais. A perturbação do estado vegetante, e até mesmo o processo de preparo tecidual afetarão o limite de exclusão de tamanho de Plasmodesmata, afetando assim o transporte symplastic22. Para melhorar a eficiência de coloração, nós confinamos nossa operação na sala de crescimento, onde a temperatura ea umidade é firmemente controlada, e também executar todo o procedimento o mais rapidamente possível (idealmente dentro de 10-15 min depois de levantar a tampa do prato de Petri). Estas precauções durante um experimento podem efetivamente reduzir as taxas de coloração de tiro sem sucesso.
Nós descrevemos dois procedimentos ligeiramente diferentes para demonstrar o movimento da disparar-ala dos CF. Normalmente, ambos os procedimentos podem levar à coloração da FC nos brotos cerca de 2 h após a alimentação (Figura 2). No entanto, os dois procedimentos produzem diferentes eficiências de coloração. O procedimento de hipocótilo-beliscar resulta em 91% de eficiência de coloração, enquanto o procedimento de corte radicular produz 70% (teste tde Welch, p < 0, 1) (Figura 3). Nós igualmente tentamos carregar a tintura por um método da raiz-pinching e encontramos uma eficiência de mancha mesmo mais baixa comparada com o método da raiz-corte, sugerindo que a aproximação para carregar a tintura na raiz não conta para a diferença de mancha entre a raiz e o hipocótilo locais de carregamento (Figura 3). O sinal CF é encontrado principalmente na vasculatura, mas apenas poucas plantas mostram o padrão de meia folha (Figura 2) como observado em outros padrões de movimento da macromolécula21. Uma vez que o sinal CF é espalhado para o tiro, ele pode ser mantido por mais de 72 h e o sinal não pode descarregar mais para outros tipos de células; Isto é consistente com os resultados previamente publicados17.
Figura 1 : Uma ilustração esquemática para a captação de CFDA e o movimento dos CF nas pilhas da planta. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Sinal CF nos brotos de 9, 11 e 13 dias após a semeadura (das) Arabidopsis plantas. O sinal CF pode ser detectado tanto em cotilédonas como em folhas verdadeiras (A, B, C). Na maioria das plantas, observa-se o sinal CF na vasculatura após 2-3 horas de carga com o método de corte radicular ou hipocótilo-pinching. Somente em casos muito raros (menos de 0,5%), o método de hipocótilo-beliscar pode gerar um padrão de coloração parcial no cotilédone de 7 DAS Arabidopsis (D). Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : As eficiências de coloração com o método da raiz-carga (raiz-corte e raiz-beliscando) e o método hypocotyl-beliscando. A eficiência de coloração em 9 DAS plantas foi determinada em três experimentos independentes (n = 26 no experimento raiz-pinching; n = 335 no experimento de corte radicular; n = 522 no método de hipocótilo-beliscar). Barra de erro indica erro padrão. indica p < 0, 1. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Estudos emergentes demonstraram que as plantas podem responder rapidamente aos estímulos externos23, incluindo a manipulação introduzida nos procedimentos experimentais22. Em nosso experimento inicial, nossa supervisão desse conhecimento muitas vezes leva a uma falha de coloração. Com estas lições, nós sugerimos que as seguintes precauções devam ser mantidas na mente ao executar esta experiência: (1) as sementes após a colheita devem ser mantidas em um armário de armazenamento ajustado a uma baixa temperatura e à baixa umidade; (2) a manipulação das plantas, particularmente a exposição ao ar no armário, deve ser mantida a um tempo mínimo; (3) as condições experimentais devem ser mantidas constantes, por exemplo, todos os procedimentos devem ser realizados em uma sala de crescimento.
Outro aspecto neste experimento que precisa ser apontado é que o volume de carga do CFDA deve ser mantido o mais pequeno possível. Solução em excesso, muitas vezes leva a artefatos em que o excesso de solução CFDA pode difundir até o tiro através da ação capilar, tingindo assim os tricomas de folhas de pia jovens. Embora um passo de lavagem antes da imagem possa diminuir este artefato, a melhor abordagem é carregar uma quantidade mínima para evitar complicações causadas por excesso de solução.
Com estas precauções técnicas resolvidas, o movimento root-to-shoot de CFDA pode ser observado estàvel como mostrado na Figura 2. Quando as plantas envelhecem, dizem que mais de 24 dias, as plantas Arabidopsis parecem perder a capacidade de transmitir CF para o tiro, para o qual ainda não encontramos uma explicação exata. Uma pista possível vem do seu acúmulo intracelular. De acordo com os relatos de Wright et al.2, CF é susceptível de ser sequestrado por vacúolos, portanto, o CF livre intracelular ao longo da translocação reduz gradualmente ao sequestro nos vacúolos maiores das plantas envelhecendo.
Uma característica óbvia deste procedimento é o padrão de distribuição de CF na filmagem. Este padrão vascular é uma reminiscência daqueles carregando o corante na folha de origem1,24,25, levando assim a uma ilusão de que o corante também se move através do floema. Na verdade, a translocação de baixo para cima de CF não pode ser alcançada através do floema dado o fato de que a raiz é um tecido de pia forte e o movimento shootward de CFDA vai contra o streaming de floema. Em vez disso, esse processo pode ser facilitado pelo transporte de xilema, como mostra Botha et al.25. Resumidamente, o CFDA pode ser tomado através de vasos de xilema, processados em células de parênquima e posteriormente translocated para o elemento peneira do fluxo de floema25. Portanto, o experimento de carga desta forma pode não refletir a atividade do floema, mas o movimento symplastic da FC deve ocorrer à medida que a fluorescência forte pode ser detectada. Em outras palavras, este movimento de CF de baixo para cima pode resultar do transporte combinado de xilema e do transporte symplastic através de células parenquimáticas.
O transporte Symplastic é frequentemente sujeito à formação Symplastic13do domínio, e em determinadas circunstâncias indica o transporte unidirecional19,20. Uma maneira para uma verificação rápida é deslocar os locais de carregamento. Na verdade, quando elaboramos esse processo utilizando o mesmo método, encontramos a simples mudança do local de carregamento, do lado radicular ao lado do hipocótilo proximal à junção raiz-hipocótilo, resultaria em mudança significativa da eficiência móvel do CFDA (Figura 3). A diferenciação móvel do CF devido aos locais de carregamento distintos sugeriria que a junção da raiz-hypocotyl fosse um outro domínio symplastic, onde a barreira symplastic fosse dada forma para os sinais de shootward raiz-derivados. Um projeto experimental mais adicional com outras moléculas é necessário explorar esta possibilidade.
Até agora, este método simples pode fornecer movimento shootward estável de CFDA. Esta característica pode mais ser explorada para distinguir plantas com o movimento root-to-shoot comprometido ou aumentado que foi estudado raramente.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de ciência natural da China (31671257) e Hubei centro de inovação colaborativa para a indústria de grãos (LXT-16-18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KNO3 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017218 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | |
| MgSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013018 | |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 20011160 | |
| MnSO4·H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013418 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10019818 | |
| Boric Acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10024018 | |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10008218 | |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10007216 | |
| KI | Sinopharm Chemical Reagent | 10017160 | |
| FeSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10012118 | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent | 10009717 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| KOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10017018 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent | 10021418 | |
| Myo-inositol | MACKLIN | I811835 | |
| Nicotinic Acid | MACKLIN | N814565 | |
| Pyridoxine HCl | MACKLIN | V820447 | |
| Thiamine HCl | MACKLIN | T818865 | |
| Glycine | MACKLIN | G800880 | |
| Agar powder | Novon | ZZ14022 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Zoom V16 | |
| Dissecting microscope | SDPTOP | SRE-1030 | |
| 200μl pipette | Dragon Laboratory Instruments | 713111110000-20-200ul | |
| 2.5μl pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Fine forceps | TWEEZERS | ST-15 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM-996 | |
| Stainless steel double-sided blade | Gillette | Platinum-Plus Double-Edge Blade |
References
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