Summary
El objetivo de este protocolo es mostrar cómo cargar el CFDA en diferentes sitios de las partes inferiores de Arabidopsis. A continuación, presentamos el patrón de distribución resultante de CF en los brotes.
Abstract
El marcador simplástica 5 (6)-carboxyfluorescein diacetato (CFDA) se ha aplicado ampliamente en plantas vivas para demostrar la conexión intercelular, el transporte de floema y los patrones vasculares. Este protocolo muestra el movimiento carboxyfluorescein (CF) de abajo a arriba en la Arabidopsis utilizando el procedimiento de corte de la raíz y del hipocotilo-pinching respectivamente. Estos dos procedimientos diferentes resultan en diferentes eficiencias del movimiento CF: alrededor del 91% de aparición de CF en los brotes con el procedimiento hipocotilo-pinching, mientras que sólo alrededor del 70% de la aparición de la CF con el procedimiento de corte de la raíz. El simple cambio de los sitios de carga, lo que resulta en cambios significativos en la eficiencia móvil de este tinte simplástica, sugiere movimiento CF podría estar sujeto a la regulación simplástica, muy probablemente por la Unión raíz-hipocotilo.
Introduction
Muchos trazadores fluorescentes con una gama de propiedades espectrales, tales como 5 (6)-carboxifluoresceina (CF)1, 8-hidroxiypyrene-1, 3, 6-ácido trisulfónico2, Lucifer Yellow CH (lych)3, Esculin y cter4, se han desarrollado y aplica en plantas para monitorear el movimiento simplásico y la actividad del floema. Generalmente, un tinte simplástica se carga en un corte en el tejido objetivo y la dispersión secuencial del reportero en otras partes de la planta demostrará la comunicación intercelular. Aunque el mecanismo de absorción del tinte no se entiende completamente, el principio subyacente del movimiento CF dentro de las células vivas ha sido ampliamente reconocido. La forma de éster de CF (Diacetato de CF, CFDA) es no fluorescente, pero permeable a la membrana. Esta propiedad permite la rápida difusión de la membrana del tinte en las células. Una vez dentro de las células vivas, las esterasas intracelulares eliminan los grupos de acetato en la posición 3 ' y 6 ' de CFDA, liberando el CF fluorescente y impermeable a la membrana (figura 1, alternativamente referir a Wright et al.2); El CF puede entonces desplazarse a través de los plasmodesmata a otras partes de las plantas.
Un procedimiento bien establecido con CFDA es que se puede cargar en hojas de origen y se utiliza para monitorear la transmisión de floema y la descarga de floema en los tejidos de fregadero de muchas especies, por ejemplo, como descarga de CF en la raíz de Arabidopsis 5, floema descarga durante la tuberización de patata6, descarga de floema en el fregadero Nicotiana hojas7, y así sucesivamente. Mediante enfoques de carga similares, otros estudios han adoptado este tinte para demostrar la conexión simplástica entre el huésped y el parásito8,9, o para revelar las relaciones simbióticas10,11.
Otra forma de hacer uso de este tinte es cargarlo en celdas específicas o una sola célula por microinyección para determinar su patrón de distribución. Estas técnicas sofisticadas han facilitado en gran medida nuestra comprensión más profunda de la comunicación intercelular mediada por plasmodesmata, particularmente en el desarrollo del concepto de dominio simplástica12,13. Por ejemplo, la microinyección de CFDA en células de cotiledón de Arabidopsis dio como resultado el patrón de acoplamiento de tinte en la epidermis de hipocotilo pero no acoplamiento en las células subyacentes o en la epidermis de la raíz, por lo tanto, la epidermis hipocotilo forma un dominio simplástica14. Dominios similares, tales como las células de la Guardia estomas15, elemento de tamiz-células acompañantes16, células de pelo raíz14 y casquillo de raíz17,18 han sido identificados por la técnica de microinyección. Sorprendentemente, algunos dominios permiten que las moléculas trazadoras se muevan en una dirección determinada. Por ejemplo, tomar el dominio de tricomas, la microinyección de una sonda fluorescente en la célula epidérmica de soporte conduce al flujo de trazador en el dominio de tripeme, sin embargo, la inyección inversa no es verdadera19. Un informe reciente también ha encontrado situaciones similares en los dominios symplásicos del embrión20de Sedum . Por lo tanto, todos los casos anteriores implican que el intercambio de sitios de carga puede conducir a nuevas perspectivas en la comunicación simplástica. Nuestro experimento anterior con el objetivo de diseccionar la ruta del silenciamiento móvil de raíz a disparo identificó un nuevo dominio simplástica, o la zona Hej (Unión hipocotil-epicotilo), que se verificó aún más a través de la carga de la raíz (carga de sumidero no canónico) CFDA experimento21. Aquí, elaboramos aún más el movimiento CF de raíz a disparo usando un método simple y recuperando un potencial dominio simplástica desplazando los sitios de carga. Además, este procedimiento puede ser adaptado para diferenciar los antecedentes genéticos que han alterado el transporte de larga distancia de raíz a brote.
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Protocol
1. crecimiento vertical de Arabidopsis en media MS
- El interior del gabinete de flujo laminar debe tratarse con 30 min de luz UV y 15 minutos de flujo de aire antes de su uso. Asegúrese de cerrar la puerta de cristal cuando la luz UV esté encendida. Pulverizar todas las herramientas y placas con etanol al 70% antes de colocarlas en el gabinete.
- Prepare el medio Murashige y Skoog (MS) en una placa de Petri estándar de 90 mm de diámetro bajo un gabinete de flujo laminar.
Nota: el MS Medium contiene los siguientes componentes: 20,6 mM NH4no3, 18,8 mm kno3, 1,25 mm KH2po4, 1,5 mm MgSO4· 7H2o, 3 mm CaCl2· 2H2o, 0,1 mm MnSO4· H2o, 1,03 μm na2Moo4· 2H2o, 0,1 mm H3Bo3, 30 ΜM ZnSO4· 7H2o, 0,1 μm CUSO4· 5h2O, 0,1 μm CoCl2· 6H2o, 1,39 μm Ki, 97 μ M FeSO4 · 7H2O, 114,5 μm ácido ethylenediaminetetraacético (EDTA), 4,07 μm ácido nicotínico, 2,44 μm piridoxina hcl, 0,15 μm tiamina hcl, 2,68 mm glicina, 555 μm myo-inositol, 87,7 mm sacarosa y 10 g/L agar. - Hidratar las puntas esterilizadas o palillos de dientes tocando la punta o palillos de dientes al medio MS, luego sumergir las semillas esterilizadas una por una en la posición fija de cada placa de Petri indicada por la tarjeta de siembra.
- Selle la placa de Petri con película de parafina y cinta adhesiva y colóquelo verticalmente sobre un soporte transparente en una sala de crecimiento (22 ° c, 70% de humedad) con un ciclo de día de 16 h de luz y 8 h de oscuridad (iluminación de 6 AM a 10 PM). La planta de Arabidopsis está preparada para la carga de CFDA el día 9-13 después de la siembra.
Nota: el siguiente procedimiento se realiza por la tarde de 2 pm a 5 pm.
2. la carga de CFDA con el procedimiento de corte de raíz
- Prepare una nueva solución de trabajo de CFDA inmediatamente antes de su uso. Diluir la solución de stock de 1 mM de CFDA almacenada en un congelador de-20 ° c con agua ultrapura estéril a una concentración de trabajo de 5 μM.
- Cortar la película de membrana de parafina microporosa (ver tabla de materiales) en pequeñas piezas de 3 mm x 3 mm de tamaño.
- Descubra las plantas en crecimiento en la habitación a 22 ° c y borre el exceso de humedad con una toalla de papel. Coloque las pequeñas piezas de película debajo de cada raíz.
Nota: de esto al paso 2,6, todo el proceso debe completarse dentro de 15 min. - Levante las plantas en la tapa del plato de Petri. Cortar las raíces en una posición de unos 5-10 mm por debajo de la Unión de la raíz-hipocotilo. Vuelva a colocar la parte de rodaje en la película en el medio.
- Aplicar cuidadosamente 0,25 μL de CFDA en el extremo de corte de cada raíz bajo un microscopio de disección. Evite salpicar a otras partes de la planta.
- Cubra la placa y deje las plantas bajo luz durante 2-3 h (22 ° c) en la sala de crecimiento.
- Enjuague las plantas teñidas tres veces secuencialmente en tres vasos de precipitados separados llenos de agua destilada, luego Observe las plantas bajo un microscopio de fluorescencia estéreo con zoom de 1.4 x a 3.3 x (consulte la tabla de materiales). Para la detección de fluorescencia, utilice un cubo de filtro de alta eficiencia (excitación de 470/20 nm, División de 495 nm y emisión de 525/50 nm) montado para transmitir la señal de fluorescencia.
3. CFDA carga con procedimiento de hipocotilo-pinching
- Prepare una nueva solución de trabajo de CFDA inmediatamente antes de su uso. Diluir la solución de stock de 1 mM de CFDA almacenada en un congelador de-20 ° c con agua ultrapura estéril (consulte la tabla de materiales) a una concentración de trabajo de 5 μm.
- Cortar la película de membrana de parafina microporosa (ver tabla de materiales) en pequeñas piezas de 3 mm x 3 mm de tamaño.
- Descubra las plantas en crecimiento en la habitación a 22 ° c y borre el exceso de humedad con una toalla de papel.
Nota: de esto al paso 3,7, todo el proceso debe completarse dentro de 15 min. - Coloque una pequeña pieza de película bajo el cruce de la raíz-hipocotilo de cada planta.
- Utilice fórceps para pellizcar suavemente el hipocotilo cerca de la Unión raíz-hipocotilo bajo un microscopio diseccionante.
- Aplicar cuidadosamente 0,1 μL de CFDA en el sitio de la herida bajo un microscopio de disección. Evite salpicar a otras partes de la planta.
- Cubrir la placa, y dejar las plantas bajo la luz (22 ° c) para 2-3 h.
- Enjuague las plantas teñidas tres veces secuencialmente en tres vasos de precipitados separados llenos de agua destilada, luego Observe las plantas bajo un microscopio de fluorescencia estéreo con zoom de 1.4 x a 3.3 x (consulte la tabla de materiales). Para la detección de fluorescencia, Monte un cubo de filtro de alta eficiencia (excitación de 470/20 nm, División de 495 nm y emisión de 525/50 nm) para transmitir la señal de fluorescencia.
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Representative Results
El movimiento symplastic a menudo está sujeto a fluctuaciones ambientales. La perturbación del estado de cultivo de la planta, e incluso el proceso de preparación de tejido afectará el límite de exclusión de tamaño de plasmodesmata, afectando así el transporte simplástica22. Para mejorar la eficiencia de la tinción, limitamos nuestra operación en la sala de crecimiento, donde la temperatura y la humedad están estrechamente controladas, y también realizar todo el procedimiento lo más rápido posible (idealmente dentro de 10-15 min después de levantar la tapa de la placa de Petri). Estas precauciones durante un experimento pueden reducir eficazmente las tasas de tinción de brote sin éxito.
Describimos dos procedimientos ligeramente diferentes para demostrar el movimiento CF Shoot-Ward. Normalmente, ambos procedimientos pueden producir manchas de CF en los brotes aproximadamente a las 2 h después de la alimentación (figura 2). Sin embargo, los dos procedimientos producen diferentes eficiencias de tinción. El procedimiento de pellizco hipocotilo da como resultado un 91% de eficiencia de tinción, mientras que el procedimiento de corte radicular produce 70% (prueba tde Welch, p < 0,001) (figura 3). También intentamos cargar el tinte mediante un método de pinchado de raíz y encontramos una eficiencia de tinción aún menor en comparación con el método de corte de raíz, sugiriendo que el enfoque para cargar el tinte en la raíz no tiene en cuenta la diferencia de tinción entre la raíz y el hipocotilo sitios de carga (figura 3). La señal CF se encuentra principalmente en la vasculatura, pero sólo pocas plantas muestran el patrón de la mitad de la hoja (figura 2) como se ve en otros patrones de movimiento de macromoléculas21. Una vez que la señal CF se propaga a la toma, se puede mantener por más de 72 h y la señal no se puede descargar aún más a otros tipos de células; Esto es consistente con los resultados publicados anteriormente17.
Figura 1 : Ilustración esquemática para la captación de CFDA y movimiento del CF en las células de la planta. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : CF señal en los brotes de 9, 11 y 13 días después de la siembra (DAS) Arabidopsis plantas. La señal CF puede detectarse tanto en los cotiledones como en las hojas verdaderas (A, B, C). En la mayoría de las plantas, la señal CF se observa en la vasculatura después de 2-3 horas de carga con el método de corte de raíz o hipocotil-pinching. Sólo en casos muy raros (menos del 0,5%), el método de pinchado hipocotilo puede generar un patrón de tinción parcial en el cotiledón de 7 das Arabidopsis (D). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Las eficiencias de tinción con el método de carga de la raíz (corte de raíz y pinching de raíz) y el método de pinching hipocotil. La eficiencia de tinción en 9 DAS plantas se determinó en tres experimentos independientes (n = 26 en el experimento de pinchado de raíz; n = 335 en el experimento de corte de raíz; n = 522 en el método de hipocotilo-pinching). La barra de error indica un error estándar. indica p < 0,001. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los estudios emergentes han demostrado que las plantas pueden responder rápidamente a los estímulos externos23, incluida la manipulación introducida en los procedimientos experimentales22. En nuestro experimento inicial, nuestra supervisión de este conocimiento a menudo conduce a la falta de manchas. Con estas lecciones, sugerimos que se tengan en cuenta las siguientes precauciones al realizar este experimento: (1) las semillas después de la cosecha deben mantenerse en un gabinete de almacenamiento establecido a una temperatura baja y baja humedad; 2) la manipulación de las plantas, en particular la exposición al aire en el gabinete, debe mantenerse en un tiempo mínimo; (3) las condiciones experimentales deben mantenerse constantes, por ejemplo, todos los procedimientos deben realizarse en una sala de crecimiento.
Otro aspecto de este experimento que hay que señalar es que el volumen de carga de CFDA debe mantenerse lo más pequeño posible. El exceso de solución a menudo conduce a artefactos en los que el exceso de la solución de CFDA puede difundir hasta el brote a través de la acción capilar, por lo tanto tintado los tricomas de las hojas de fregadero jóvenes. Aunque un paso de lavado antes de la imagen puede disminuir este artefacto, el mejor enfoque es cargar una cantidad mínima para evitar complicaciones causadas por el exceso de solución.
Con estas precauciones técnicas resueltas, el movimiento de raíz a brote de CFDA se puede observar de manera estable como se muestra en la figura 2. Cuando las plantas envejecen, digamos que más de 24 días, las plantas de Arabidopsis parecen perder la capacidad de transmitir el CF al brote, para lo cual aún no hemos encontrado una explicación exacta. Una posible pista proviene de su acumulación intracelular. Según los informes de Wright et al.2, CF es susceptible de ser secuestrado por vacuolas, por lo tanto, el CF libre intracelular en el transcurso de la translocación reduce gradualmente a la secuestración en las vacuolas más grandes de las plantas de envejecimiento.
Una característica obvia de este procedimiento es el patrón de distribución de CF en el rodaje. Este patrón vascular es una reminiscencia de los que cargan el tinte en la hoja fuente1,24,25, lo que conduce a una ilusión de que el tinte también se mueve a través del phloem. De hecho, la translocación de abajo a arriba del CF no puede lograrse a través del floema dado el hecho de que la raíz es un tejido de fregadero fuerte y el movimiento de shootward de CFDA va contra el flujo de floema. Más bien, este proceso puede ser facilitado por el transporte xilema como se muestra en Botha et al.25. Brevemente, CFDA puede ser tomado a través de vasos xilem, procesados en células de parénquima y más translocalizados al elemento tamiz del flujo de floema25. Por lo tanto, el experimento de carga de esta manera puede no reflejar la actividad de phloem, pero el movimiento simplástica de CF debe ocurrir como la fluorescencia fuerte puede ser detectada. En otras palabras, este movimiento del CF de abajo a arriba puede resultar del transporte combinado de xilema y el transporte simplástica a través de las células del parénquima.
El transporte simplástica es a menudo sujeto a la formación de dominio simplástica13, y en ciertas circunstancias muestra el transporte unidireccional19,20. Una forma de realizar una comprobación rápida es cambiar la carga de los sitios. De hecho, cuando elaboramos este proceso usando el mismo método, encontramos el simple cambio de sitio de carga, desde el lado de la raíz hasta el lado hipocotilo proximal a la Unión de la raíz-hipocotilo, daría lugar a un cambio significativo de la eficiencia móvil de CFDA (figura 3). La diferenciación móvil CF debido a los distintos sitios de carga sugeriría que la Unión raíz-hipocotilo es otro dominio simplástica, donde se forma la barrera simplástica para las señales de shootward derivadas de la raíz. Se necesita más diseño experimental con otras moléculas para explorar esta posibilidad.
Hasta ahora, este sencillo método puede proporcionar un movimiento de la CFDA estable. Esta característica se puede explorar aún más para distinguir las plantas con movimiento de raíz a brote comprometido o mejorado que rara vez se ha estudiado.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta obra fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31671257) y el centro de innovación colaborativa de Hubei para la industria del grano (LXT-16-18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KNO3 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017218 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | |
| MgSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013018 | |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 20011160 | |
| MnSO4·H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013418 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10019818 | |
| Boric Acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10024018 | |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10008218 | |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10007216 | |
| KI | Sinopharm Chemical Reagent | 10017160 | |
| FeSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10012118 | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent | 10009717 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| KOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10017018 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent | 10021418 | |
| Myo-inositol | MACKLIN | I811835 | |
| Nicotinic Acid | MACKLIN | N814565 | |
| Pyridoxine HCl | MACKLIN | V820447 | |
| Thiamine HCl | MACKLIN | T818865 | |
| Glycine | MACKLIN | G800880 | |
| Agar powder | Novon | ZZ14022 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Zoom V16 | |
| Dissecting microscope | SDPTOP | SRE-1030 | |
| 200μl pipette | Dragon Laboratory Instruments | 713111110000-20-200ul | |
| 2.5μl pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Fine forceps | TWEEZERS | ST-15 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM-996 | |
| Stainless steel double-sided blade | Gillette | Platinum-Plus Double-Edge Blade |
References
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