Summary
Målet med detta protokoll är att visa hur man laddar CFDA i olika platser i botten delarna av Arabidopsis. Vi presenterar sedan det resulterande distributions mönstret för CF i skotten.
Abstract
Den symplastisk Tracer 5 (6)-carboxyfluorescein diacetat (CFDA) har tillämpats i stor utsträckning i levande växter för att demonstrera den intercellulära anslutning, Phloem transport och vaskulär mönstringen. Detta protokoll visar botten-till-topp carboxyfluorescein (CF) rörelse i Arabidopsis med hjälp av rot-skärning och Hypocotyl-pinching förfarande respektive. Dessa två olika tillvägagångs sätt resulterar i olika effektivitets vinster av CF-rörelse: omkring 91% utseende mässigt av CF i skotten med det Hypocotyl-klämmande tillvägagångs sättet, eftersom endast omkring 70% utseende mässigt av CF med det Rota-klippande tillvägagångs sättet. Den enkla förändringen av lastning platser, vilket resulterar i betydande förändringar i den mobila effektiviteten i denna symplastiska färg ämne, antyder CF rörelse kan vara föremål för symplastiska regleringen, troligen av roten-Hypocotyl korsningen.
Introduction
Många fluorescerande spår ämnen med en rad spektralegenskaper, såsom 5 (6)-carboxyfluorescein (CF) 1,8-hydroxypyren-1, 3, 6-trisulfonsyra2, Lucifer Yellow CH (lych)3, esculin och CTER4, har utvecklats och tillämpas i växter för att övervaka symplastisk rörelse och Phloem aktivitet. I allmänhet är ett symplastiskt färg ämne lastas i en klippa i mål vävnaden och den sekventiella spridningen av reportern i andra delar av anläggningen kommer att demonstrera den intercellulära kommunikationen. Även om mekanismen för färgabsorption inte är helt klarlagd, den underliggande CF-rörelsen i levande celler har allmänt erkänt. Ester formen av CF (CF diacetat, CFDA) är icke-fluorescerande, men membran-permeable. Denna egenskap möjliggör snabb membran diffusion av färg ämnet i cellerna. En gång inuti levande celler, intracellulära esteraser ta bort acetat grupperna vid 3 ' och 6 ' position CFDA, frigöra fluorescerande och membran-impermeable CF (figur 1, alternativt hänvisa Wright et al.2); CF kan sedan flytta genom Plasmodesmata till andra delar av växter.
Ett väletablerat förfarande med CFDA är att det kan lastas i käll blad och används för att övervaka Phloem streaming och Phloem lossning i diskbänk vävnader av många arter, t. ex., som CF lossning i Arabidopsis root5, Phloem lossning under potatis tuberization6, Phloem lossning i Nicotiana sjunka bladen7, och så vidare. Genom liknande lastning metoder, andra studier har antagit detta färg ämne för att demonstrera symplastiska sambandet mellan värd och parasit8,9, eller att avslöja symbiotiska relationer10,11.
Ett annat sätt att använda detta färg ämne är att läsa in den i specifika celler eller en enda cell genom Mikroskop att bestämma dess fördelning mönster. Sådana sofistikerade tekniker har i hög grad underlättat vår djupare förståelse av Plasmodesmata-förmedlad intercellulär kommunikation, särskilt i utvecklingen av konceptet symplastisk domän12,13. Till exempel resulterade mikroinjektionen av CFDA i Auktor celler av Arabidopsis i färg-koppling mönstret i Hypokotyl epidermis men icke-koppling i de underliggande cellerna eller i roten epidermis, därför Hypokotyl epidermis bildar en symplastisk domän14. Liknande områden, såsom stomatala Guard celler15, sieve element-Companion celler16, rot hår celler14 och root Cap17,18 har identifierats genom Mikroskop teknik. Mest överraskande, vissa domäner tillåter spår molekyler att röra sig i en viss riktning. Ta trichome domänen till exempel, Mikroskop av en fluorescerande sond i stödjande epidermal cellen leder till flödet av spårämne i trichome domänen, dock omvänd injektion inte hålla sann19. En färsk rapport har också funnit liknande situationer i symplastiska domäner Sedum embryo20. Således innebär alla ovanstående fall att byte av lastnings platser kan leda till nya insikter i symplastisk kommunikation. Vårt tidigare experiment som syftar till att dissekera rutten av root-to-shoot mobil ljud dämpning identifierat en roman symplastisk domän, eller Hej (Hypocotyl-epicotyl korsning) zon, som ytterligare verifierats genom root-loading (icke-kanoniska Sink-lastning) CFDA experiment21. Här, vi vidareutveckla den root-to-shoot CF rörelse genom att använda en enkel metod och återvinna en potentiell symplastisk domän genom att flytta lastning platser. Dessutom kan detta förfarande anpassas för att särskilja genetiska bakgrunder som har ändrat rot-till-skott långväga transporter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Arabidopsis vertikal tillväxt i MS medium
- Interiören i laminärt flöde skåp måste behandlas med 30 min UV-ljus och 15 min luft flöde före användning. Se till att stänga glas luckan när UV-lampan lyser. Spraya alla verktyg och plattor med 70% etanol innan du placerar dem i skåpet.
- Förbered Murashige och Skoog (MS) medium i en standard 90 mm-diameter petriskål under ett laminärt flöde skåp.
Anmärkning: MS-mediet innehåller följande komponenter: 20,6 mM NH4nr3, 18,8 mm kno3, 1,25 mm KH2Po4, 1,5 mm MgSO4· 7h2o, 3 mm CaCl2· 2H2o, 0,1 mm mnso4· H2o, 1,03 μm na2Moo4· 2H2o, 0,1 mm H3bo3, 30 μm Znso4· 7h2o, 0,1 μm CuSO4· 5H2o, 0,1 μm cocl2· 6H2o, 1,39 μm KI, 97 μ M FeSO4 · 7H2O, 114,5 μm etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 4,07 μm nikotin syra, 2,44 μm pyridoxin hcl, 0,15 μm tiamin hcl, 2,68 mm glycin, 555 μm Myo-inositol, 87,7 mm sackaros och 10 g/L agar. - Återfukta steriliserade tips eller tandpetare genom att röra spetsen eller tandpetare till MS mediet, sedan doppa steriliserade frön en efter en på den fasta positionen för varje petriskål anges av seedkortet.
- Täta petriskål med paraffin film och tejp och placera den vertikalt på en tydlig monter i ett tillväxt rum (22 ° c, 70% fukt) med en dag cykel av 16 h av ljus och 8 h mörker (belysning från 6 till 10 PM). Den Arabidopsis anläggningen är redo för CFDA lastning på dag 9-13 efter sådd.
Anmärkning: följande procedur utförs på eftermiddagen från 2 PM till 5 PM.
2. CFDA lastning med roten styckning förfarande
- Förbered färsk CFDA arbets lösning omedelbart före användning. Späd den 1 mM CFDA-lagerlösning som förvaras i-20 ° c frys med Sterilt ultrarent vatten till en arbets koncentration på 5 μM.
- Skär den mikro-porösa paraffin membran film (se tabell över material) i små bitar av 3 mm x 3 mm storlek.
- Avslöja de växande växterna i rummet vid 22 ° c och rensa överflödig fukt med en pappers hand duk. Placera de små film bitarna under varje rot.
Obs: från denna till steg 2,6, hela processen bör slutföras inom 15 min. - Lyft plantorna på Petriskållocket. Skär rötterna i en position ca 5-10 mm under roten-Hypocotyl korsningen. Placera shoot del tillbaka på filmen på mediet.
- Applicera försiktigt 0,25 μL CFDA på den skärande änden av varje rot under ett dissekera Mikroskop. Undvik stänk i andra delar av växten.
- Täck plattan och lämna växterna under ljus för 2-3 h (22 ° c) i tillväxt rummet.
- Skölj de färgade växterna tre gånger i följd i tre separata bägare fyllda med destillerat vatten, följ sedan växterna under ett stereo-fluorescensmikroskop med zoom från 1,4 x till 3,3 x (se material tabellen). För fluorescensdetektering, Använd en högeffektiv filterkub (470/20 nm excitation, 495 nm Split och 525/50 nm emission) monterad för att överföra fluorescenssignalen.
3. CFDA lastning med Hypocotyl-pinching förfarande
- Förbered färsk CFDA arbets lösning omedelbart före användning. Späd den 1 mM CFDA-lagerlösning som förvaras i-20 ° c frys med Sterilt ultrarent vatten (se material tabell) till en arbets koncentration på 5 μM.
- Skär den mikro-porösa paraffin membran film (se tabell över material) i små bitar av 3 mm x 3 mm storlek.
- Avslöja de växande växterna i rummet vid 22 ° c och rensa överflödig fukt med en pappers hand duk.
Obs: från denna till steg 3,7, hela processen bör slutföras inom 15 min. - Lägg en liten bit av film under roten-Hypocotyl korsningen av varje planta.
- Använd pincett för att försiktigt nypa Hypokotyl nära roten-Hypokotyl korsning under en dissekera Mikroskop.
- Applicera försiktigt 0,1 μL CFDA på sår platsen under ett dissekera Mikroskop. Undvik stänk i andra delar av växten.
- Täck plattan och lämna växterna under ljus (22 ° c) för 2-3 h.
- Skölj de färgade växterna tre gånger i följd i tre separata bägare fyllda med destillerat vatten, följ sedan växterna under ett stereo-fluorescensmikroskop med zoom från 1,4 x till 3,3 x (se material tabellen). För fluorescensdetektering, montera en högeffektiv filterkub (470/20 nm excitation, 495 nm Split och 525/50 nm emission) för att överföra fluorescenssignalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Symplastisk rörelse är ofta föremål för miljö variationer. Störning av växternas odlings tillstånd, och även processen för vävnads beredning kommer att påverka storleken uteslutnings gränsen för Plasmodesmata, vilket påverkar symplastisk transport22. För att förbättra infärgnings effektiviteten, begränsar vi vår verksamhet i tillväxt rummet, där temperaturen och fukten är tätt kontrollerad, och även utföra hela proceduren så snabbt som möjligt (helst inom 10-15 min efter att lyfta locket på petriskål). Dessa försiktighets åtgärder under ett experiment kan effektivt minska frekvensen av misslyckade skjuta färgning.
Vi beskrev två något olika förfaranden för att demonstrera CF shoot-Ward rörelse. Normalt kan båda procedurerna leda till CF-färgning i skotten ca 2 h efter utfodring (figur 2). Ändå, de två förfarandena ger olika färgning effektivitets vinster. Hypocotyl-pinching förfarandet resulterar i 91% färgning effektivitet, medan den rot-skärning förfarande producerar 70% (Welch s t-test, p < 0,001) (figur 3). Vi försökte också ladda färg ämnet med en rot-klämmande metod och fann en ännu lägre färgning effektivitet jämfört med root-skärande metod, vilket tyder på att metoden för att ladda färg ämnet i roten inte står för infärgning skillnaden mellan roten och Hypokotyl lastnings platser (figur 3). CF-signalen finns främst i kärl mönstret, men endast ett fåtal plantor visar halv blads mönster (figur 2), vilket kan ses i andra makro molekyl rörelse mönster21. När CF-signalen sprids till fotograferingen kan den upprätthållas i mer än 72 h och signalen kan inte lossna ytterligare till andra cell typer; Detta stämmer överens med tidigare publicerade resultat17.
Figur 1 : En schematisk illustration för CFDA upptag och CF-rörelse i växternas celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : CF-signal i skotten 9, 11 och 13 dagar efter sådd (Das) Arabidopsis växter. CF-signal kan detekteras i både hjärt bladen och sanna blad (a, B, C). I de flesta växter, CF-signalen observeras i kärl efter 2-3 timmar lastning med antingen root-skärning eller Hypocotyl-pinching metod. Endast i mycket sällsynta fall (mindre än 0,5%) kan Hypocotyl-pinching-metoden generera ett partiellt Färgnings mönster i Auktor på 7 Das Arabidopsis (D). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Den infärgning effektivitets vinster med root-loading metod (rot-skärning och root-nypa) och Hypocotyl-pinching metod. Infärgnings effektiviteten i 9 DAS-plantor bestämdes i tre oberoende experiment (n = 26 i rot-pinching-experimentet; n = 335 i det rot-skärande experimentet; n = 522 i Hypocotyl-pinching-metoden). Fel fältet anger standard fel. indikerar p < 0,001. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nya studier har visat att växter snabbt kan reagera på yttre stimuli23, inklusive manipulation som införts i experimentella förfaranden22. I vårt första experiment leder vår övervakning av denna kunskap ofta till infärgnings fel. Med dessa lektioner, föreslår vi att följande försiktighets åtgärder bör hållas i åtanke när du utför detta experiment: (1) fröna efter skörd bör förvaras i ett förvarings skåp inställd på en låg temperatur och låg fuktighet; (2) manipulering av växter, särskilt exponeringen för luft i skåpet, bör hållas på en minimal tid. (3) försöks betingelserna bör hållas konstanta, t. ex. bör alla förfaranden utföras i ett tillväxt rum.
En annan aspekt i detta experiment som måste påpekas är att last volymen av CFDA bör hållas så liten som möjligt. Överflödig lösning leder ofta till artefakter där överskottet CFDA lösning kan sprida sig till skott genom kapillär åtgärder, vilket tonande trichomes av unga sjunka löv. Även om en tvätt steg innan avbildning kan minska denna artefakt, är det bästa sättet att ladda ett minimum för att undvika komplikationer som orsakas av överflödig lösning.
Med dessa tekniska försiktighets åtgärder lösas, den root-to-shoot förflyttning av CFDA kan stabilt observeras som visas i figur 2. När växter blir äldre, säger över 24 dagar, den Arabidopsis växter verkar förlora förmågan att överföra CF till shoot, som vi ännu inte har hittat en exakt förklaring. En möjlig ledtråd kommer från dess intracellulära ackumulering. Enligt rapporter från Wright et al.2, CF är skyldig att vara konfiskerade av vakuoler, därför, den intracellulära fria CF under loppet av translokationen minskar gradvis till bindning i de större vakuoler av åldrande växter.
Ett uppenbart inslag i detta förfarande är fördelningen mönstret för CF i fotograferingen. Detta vaskulära mönster påminner om dem genom att fylla på färg ämnet i käll bladet1,24,25, vilket leder till en illusion att färgen också rör sig genom Phloem. I själva verket, botten-till-Top flyttning av CF kan inte uppnås genom Phloem med tanke på att roten är en stark diskbänk vävnad och shootward rörelsen av CFDA går mot Phloem streaming. Snarare, denna process kan under lättas av Xylem transport som visas av Botha et al.25. Kortfattat kan CFDA tas upp genom xylem fartyg, bearbetas i lungparenkym celler och ytterligare translokeras till sikten elementet av Phloem ström25. Därför, lastning experiment på detta sätt kanske inte återspeglar aktiviteten av Phloem, men symplastiska rörelsen av CF måste inträffa som den starka fluorescens kan upptäckas. Med andra ord, denna bottom-to-Top CF rörelse kan resultera från den kombinerade Xylem transport och symplastisk transport genom lungparenkym celler.
Symplastisk transport är ofta föremål för symplastisk domän formation13, och i vissa fall visar den enkelriktad transport19,20. Ett sätt för en snabb kontroll är att flytta lastnings platser. Faktum är att när vi utarbetade denna process med samma metod, Vi hittade den enkla förändringen av lastning plats, från rotsidan till Hypokotyl sidan proximalt till root-Hypokotyl korsning, skulle resultera i betydande förändring av CFDA mobil effektivitet (figur 3). CF mobil differentiering på grund av de distinkta lastning platser skulle tyda på att roten-Hypocotyl korsningen är en annan symplastisk domän, där symplastiska barriären bildas för roten-härledda shootward signaler. Ytterligare experimentell design med andra molekyler behövs för att utforska denna möjlighet.
Hittills kan denna enkla metod ge stabila shootward rörelse CFDA. Denna funktion kan utforskas ytterligare för att särskilja växter med nedsatt eller förstärkt root-to-shoot rörelse som sällan har studerats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Natural Science Foundation i Kina (31671257) och Hubei Collaborative innovation Center för spannmåls industrin (LXT-16-18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KNO3 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017218 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | |
| MgSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013018 | |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 20011160 | |
| MnSO4·H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10013418 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10019818 | |
| Boric Acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10024018 | |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10008218 | |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10007216 | |
| KI | Sinopharm Chemical Reagent | 10017160 | |
| FeSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent | 10012118 | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent | 10009717 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| KOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10017018 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent | 10021418 | |
| Myo-inositol | MACKLIN | I811835 | |
| Nicotinic Acid | MACKLIN | N814565 | |
| Pyridoxine HCl | MACKLIN | V820447 | |
| Thiamine HCl | MACKLIN | T818865 | |
| Glycine | MACKLIN | G800880 | |
| Agar powder | Novon | ZZ14022 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Zoom V16 | |
| Dissecting microscope | SDPTOP | SRE-1030 | |
| 200μl pipette | Dragon Laboratory Instruments | 713111110000-20-200ul | |
| 2.5μl pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Fine forceps | TWEEZERS | ST-15 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM-996 | |
| Stainless steel double-sided blade | Gillette | Platinum-Plus Double-Edge Blade |
References
- Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. 6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation. American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).
- Wright, K. M., Oparka, K. J. The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy. Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport. Planta. 176 (4), 533-540 (1988).
- Knoblauch, M., et al. Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications. Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).
- Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis. The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).
- Viola, R., et al. Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading. The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).
- Roberts, A. G., et al. Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus. The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).
- Péron, T., et al. New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel). Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).
- Spallek, T., et al. Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).
- Complainville, A., et al. Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species. The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).
- Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules. Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).
- Robards, A. W., Lucas, W. J. Plasmodesmata. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).
- Roberts, A. G., Oparka, K. J. Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).
- Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).
- Palevitz, B. A., Hepler, P. K. Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow. Planta. 164 (4), 473-479 (1985).
- van Bel, A. J. E., Kempers, R. Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems. Planta. 183 (1), 69-76 (1991).
- Erwee, M. G., Goodwin, P. B. Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch. Planta. 163 (1), 9-19 (1985).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).
- Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata. Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).
- Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae). Planta. 245 (3), 491-505 (2017).
- Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement. Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).
- Radford, J. E., White, R. G. Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits. Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).
- Kollist, H., et al. Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network. Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).
- Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley. Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).
- Botha, C. E. J., et al. A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis? Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).
