Summary
在这种方法中,我们使用在细菌细胞中的简单、实时的、报告学测定来量化RNA结合蛋白(RBPs)与共和结合位点的结合亲和力。测定基于对报告者基因的抑制。
Abstract
在蛋白质转化的起始步骤中,核糖体与mRNA的起始区域结合。通过将RNA结合蛋白(RBP)与mRNA的起始区域结合,可以阻断翻译启动,从而干扰核糖体结合。在所提出的方法中,我们利用这种阻塞现象来量化限制性商业惯例与其共性和非共性绑定位点的绑定亲和力。为此,我们在报告器 mRNA 的起始区域插入一个测试绑定位点,并诱导测试 RBP 的表达。在RBP-RNA结合的情况下,我们观察到作为RBP浓度函数的对报告者表达的抑制。在绑定站点和 RBP 之间没有亲和力或非常低的亲和力的情况下,没有观察到明显的抑制。该方法在活细菌细胞中进行,不需要昂贵或精密的机械。它可用于量化和比较细菌中功能的不同限制性商业惯例与一组设计结合位点之间的结合亲和力。此方法可能不适合具有高结构复杂性的绑定站点。这是因为在没有RBP的情况下,复杂的mRNA结构可能抑制核糖体启动,这将导致基底报告者基因表达降低,因此对RBP结合的观察量较低。
Introduction
近几十年来,基于RNA结合蛋白(RBP)的转录后调节,特别是RPS和RNA之间相互作用的表征,得到了广泛的研究。在来自限制性商业惯例的细菌中,有许多转化降调节的例子,它们抑制或直接与核糖体结合1、2、3竞争。在合成生物学领域,RBP-RNA相互作用正在成为设计基于转录基因电路4,5的重要工具。因此,在细胞环境中对这种RBP-RNA相互作用的表征需求增加。
研究蛋白质-RNA相互作用的最常见方法是电泳移动移位测定(EMSA)6,仅限于体外设置,以及各种下拉测定7,包括CLIP方法8,9.虽然这些方法能够发现脱新RNA结合位点,但它们存在诸如劳动密集型协议和昂贵的深度测序反应等缺点,并且可能需要一种特定的抗体来进行RBP下拉。由于RNA对其环境的易感性,许多因素会影响RBP-RNA相互作用,强调在细胞环境中对RBP-RNA结合进行探究的重要性。例如,我们和其他人已经证明体内RNA结构与体外RNA结构有显著差异10,11。
根据先前研究12的方法,我们最近演示了10,当为来自噬菌体GA 13、MS2 14、PP715和Q+16的细胞内大黄蜂RBPs放置预先设计的结合位点时,翻译启动区一位记者mRNA,记者的表情被强烈压制。基于这种抑制现象,我们提出了一种相对简单和定量的方法,以测量RBPs与其在体内的相应RNA结合位点之间的亲和力。
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Protocol
1. 系统准备
- 结合位点质粒的设计
- 如图1所示,设计装订位盒。每个微基因包含以下部分(5'至3'):Eagl限制位点,[40基端的kanamycin(Kan)抗性基因,pLac-Ara启动子,核糖体结合位点(RBS),MCherry基因的AUG,一个间隔(+),一个RBP结合位点,5'端的80个碱基mCherry基因和ApaLI限制位。
注:为了提高测定的成功率,为每个装订位点设计三个结合位盒,垫块至少由一个、两个和三个碱基组成。有关进一步指南,请参阅代表性结果部分。
- 如图1所示,设计装订位盒。每个微基因包含以下部分(5'至3'):Eagl限制位点,[40基端的kanamycin(Kan)抗性基因,pLac-Ara启动子,核糖体结合位点(RBS),MCherry基因的AUG,一个间隔(+),一个RBP结合位点,5'端的80个碱基mCherry基因和ApaLI限制位。
- 结合位点质粒的克隆
- 将结合位点盒订购为双链DNA(dsDNA)小基因。每个微型基因长 ±500 bp,并分别包含 Eagl 限制站点和 ApaLI 限制站点,分别位于 5' 和 3' 端(请参阅步骤 1.1.1)。
注:在这个实验中,对一半卡那霉素基因的微型基因进行了排序,以方便对阳性菌落进行筛查。然而,吉布森组装17也适合在这里,在这种情况下,结合位点可以订购为两个较短的互补单链DNA寡聚物。 - 通过限制协议18,双消化微基因和目标载体,用Eagl-HF和ApaLI,柱纯化19。
- 利盖特消化的微型基因到结合位位主干,包含其余的mCherry报告基因,终结者,和卡纳霉素抗性基因20。
- 将结扎溶液转化为大肠杆菌TOP10细胞21。
- 通过桑格测序识别阳性转化剂。
- 在感兴趣的区域上游设计引基 100 基(有关引信序列,请参阅表1)。
- 迷你准备几个细菌菌落22。
- 在80纳克/μL浓度下制备5 mM的引液溶液和10μL的DNA。
- 将两个解决方案发送到一个方便的设施,为桑格测序23。
- 储存纯化质粒在-20°C,细菌菌株作为甘油库存24,均以96井格式。然后,DNA将用于转化为含有四个融合-RBP质粒之一的大肠杆菌TOP10细胞(参见步骤1.3.5)。
- 将结合位点盒订购为双链DNA(dsDNA)小基因。每个微型基因长 ±500 bp,并分别包含 Eagl 限制站点和 ApaLI 限制站点,分别位于 5' 和 3' 端(请参阅步骤 1.1.1)。
- RBP质粒的设计与建造
注:本研究中使用的涂层蛋白的氨基酸和核苷酸序列列在表2中。- 订购所需的RBP序列,缺少停止科顿作为一个自定义的dsDNA微型基因缺乏一个停止科顿与限制位点在末端(图1)。
- 克隆测试的RBP缺乏一个停止的康顿,立即下游的诱导启动子和荧光蛋白的上游缺乏启动科顿(图1),类似于步骤1.2.2-1.2.4。确保RBP质粒含有不同于结合位点质粒的抗生素耐药性基因。
- 通过 Sanger 测序识别正转化剂,类似于步骤 1.2.5(有关引物序列,请参见表1)。
- 选择一个正转化剂,使其具有化学能力25。在-20°C储存为甘油纯化质粒,在96孔板中储存细菌菌株24的甘油库存在-80°C。
- 将储存在96孔板中的结合位位质粒(从步骤1.2.6)转化为具有化学能力的细菌细胞,这些细胞已经含有RBP-mCerulean质粒21。为了节省时间,而不是在培养皿上电镀细胞,在含有Luria-Bertani(LB)26琼脂(Kan和Amp)的8通道板上用8通道移管器进行板。殖民地应在16小时出现。
- 为每个双转化剂选择一个菌群,并在LB介质中使用相关抗生素(Kan和Amp)一夜生长,并在96孔板中储存为甘油库存24,温度为-80°C。
2. 实验设置
注:这里提出的协议是使用液体处理机器人系统与孵化器和板读取器相结合。每次测量对24个诱导剂浓度进行,每个菌株和诱导剂组合有两个重复。利用这个机器人系统,收集了每天16个菌株的数据,其中24个诱导剂浓度。但是,如果此类设备不可用,或者需要较少的实验,则可以轻松地使用 8 通道多移液器手动完成这些实验,并相应地调整协议。例如,以这种方法获得每天4个菌株的初步结果,其中12个诱导剂浓度和4个时间点。
- 通过混合 0.5 克试金石、0.3 mL、5.8 g NaCl、50 mL 1 M MgSO 4、1m L 10x 磷酸盐缓冲盐 (PBS) 缓冲液 pH 7.4 和 950 mL 双蒸馏水 (DDW), 提前制备 1 L 生物测定缓冲液 (BA)。高压灭菌或无菌过滤BA缓冲液。
- 在48孔板中,在48孔板中,在18孔板(过夜)内,用适当的抗生素(最终浓度为25微克/mL的卡那霉素和最终浓度为100微克/mL的甘霉素),在37°C和250rpm下在1.5 mL LB下生长双转化菌株。
-
早上,做以下准备。
- 诱导板。在干净的 96 孔板中,在 37°C 的培养箱中制备半差介质 (SPM) 的井,在培养箱中包括 95% BA 和 5% LB26。井数对应于所需的诱导剂浓度数。将 C4-HSL 添加到诱导板中的孔中,该孔将含有最高的诱导剂浓度 (218 nM)。
- 将机器人从每个浓度最高的井中连续稀释到 23 个浓度从 0 到 218 nM 的低浓度。每个诱导剂稀释的体积应足以满足所有菌株(包括重复菌株)。
- 在制备诱导稀释剂时,在37°C的培养箱中,在96孔板中加热180μL的SPM。
- 通过连续稀释将步骤 2.2 的隔夜菌株稀释 100 倍:首先将 100 μL 的细菌与 900 μL 的 SPM 混合在 48 孔板中,再稀释 10 倍,从稀释溶液中加入 20 μL180 μL 的预加热SPM,适用于96孔板,适用于荧光测量。
- 将稀释的诱导剂从诱导板添加到96孔板中,并根据最终浓度将稀释菌株加入。
- 在 37°C 下摇动 96 孔板 6 小时,同时每 30 分钟通过板读取器测量 595 nm (OD 595)、mCherry (560 nm/612 nm) 和 mCerulean (460 nm/510 nm) 荧光。出于规范化目的,测量 SMP 的生长,不添加任何单元格。
3. 初步结果分析
- 对于每天的实验,根据测量的生长曲线,在线性生长阶段和静止(T 0,T最终)之间选择对数增长的时间间隔。以大约 6⁄8 个时间点为例,同时放弃第一个和最后一个测量值,以避免因指数增长检测不准确而产生的错误(参见图 2A,顶部面板)。
注:丢弃显示异常生长曲线或菌株的菌株,其中无法检测到对数生长阶段,并重复实验。 -
根据每种诱导剂浓度的mCerulean和mCherry荧光的原始数据计算mCerulean的平均正定荧光和mCherry的产生率(图2A)。
- 计算规范化的 mCerulean,如下所示:
其中空白(mCerulean)是仅介质的mCerulean水平[a.u.],空白(OD)是介质的光学密度,mCerulean和OD分别是mCerulean荧光和光密度值。 - 不同时间点的平均 mCerulean(图 2B,前两个面板),如下所示:
其中#Time点是考虑的数据时间点数,T0是指数增长阶段开始的时间,T最终点是指数增长阶段结束的时间。 - 计算 mCherry 的生产率(图 2B,底部两个面板),如下所示:
其中 mCherry(t) 是时间 t 的 mCherry 级别 [a.u.],OD 是光学密度值,T0是指数增长阶段开始的时间,T最终是指数增长阶段结束的时间。
- 计算规范化的 mCerulean,如下所示:
- 最后,将mCherry的产生速率绘制为mCerulean的函数,创建剂量反应曲线作为RBP-mCerulean融合荧光的函数(图2C)。这些图表示报告基因的产生,作为细胞中RBP存在的函数。
4. 剂量响应功能拟合例程和 KRBP提取
- 假设具有 RBP 绑定的核糖体转换速率是恒定的,则对 mCherry 生产速率进行如下建模(参见图 2D,绿线):
其中[x]是根据Eq.2计算的标准化平均mCerulean荧光,mCherry生产速率是根据Eq.3计算的值,KRBP是相对结合的亲和力[a.u.],K未绑定是核糖体速率与RBP的转换未绑定,n是协同系数,C是基荧光[a.u.]。通过将 mCherry 生产速率数据拟合到模型中(Eq. 4),可以找到 C、n、K未绑定和 KRBP。 - 使用数据分析软件,对将 mCherry 生产率描述为平均 mCerulean 函数的绘图执行拟合过程(步骤 3.3),并根据 Eq. 4 中的公式提取拟合参数。
注:只考虑具有 R2 > 0.6 的拟合结果。对于这些拟合,KRBP误差主要在 KRBP值的 0.5% 到 20% 的范围内,为 0.67 置信区间,而 KRBP误差较高的误差也可以通过眼睛进行验证。 - 按每个剂量反应函数的平均值 mCerulean 的相应最大值对 KRBP值进行标准化。
其中 KRBP在 [a.u.] 是从 Eq. 4 中的拟合过程中提取的值,最大值(平均 mCeran)是为当前应变观测到的最大平均 mCeran 信号 [a.u]。
注:规范化通过消除对特定最大 RBP 表达水平的依赖,促进不同菌株调节效果的正确比较。
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Representative Results
所提出的方法利用RBP和核糖体之间的竞争,与mRNA分子结合(图1)。这种竞争反映在由于诱导剂浓度增加而降低mCherry水平,作为RBP-mCeran产量增加的函数。在增加mCerulean荧光的情况下,mCherry没有显著变化,可以推断出缺乏RBP结合。图 2描述了正应变和负应变的代表性结果。在图 2A中,OD、mCherry 和 mCerulean 通道在四个小时内作为时间和诱导器的函数呈现,T0 = 1 h,T最终= 3.5 小时。在图2B中,对于两个示例菌株,平均mCerulean荧光(顶部)和mCherry的产生率(底部)作为诱导剂浓度的函数。可以看出,正应变的结果在 mCherry 生产率(图 2B,C)中显示出明显的向下调节效应(图2B,C),这转化为 KRBP的重要非零值(图 2D)。对于正应变,拟合过程产生以下值:KRBP = 394.6 a.u.,K未绑定= 275.6,n = 2.1,C = 11.2 a.u.,R2 = 0.93。在最大mCerulean荧光正常化后,KRBP值为0.24。对于负应变,观察到缺乏明显的响应(图2C),并且没有提取KRBP值(图2D)。
在图3中,我们在mCherry mRNA的起始区域的不同位置,在几个突变结合位点上,对两个噬菌体RRBPs(PP7和MS2)的测定结果进行了展示。结果大致分为三种反应(图3A):在低mCerulean水平上表现出向下调节效应的菌株,反映低KRBP值(高结合亲和力);在中度或高mCerulean水平上表现出低调节效果的菌株,反映高KRBP值(中度或低亲和力);和菌株表现出对mCerulean水平上升无明显反应,反映KRBP值高于细胞中最大RBP浓度(无可检测到的结合亲和力)。图 3B显示了基于两个 RBP 和 10 个不同位置的 10 个绑定位点的所有组合,为每个 RBP 绑定站点组合计算的最小 KRBP值。结合位点包括负对照(无结合位点)、不匹配结合位点和正对照 -每个RBP的原生结合位点(PP7涂层蛋白[PCP]的PP7-wt,MS2-wt的MS2涂层蛋白[MCP])。结果与预测相匹配,因为两个 RP 都对其正控件具有很高的亲和力,对负控件具有不可检测的绑定相关性。此外,以前使用这两种限制性商业惯例27、28的研究已经观察到它们是正交的,这在热图中清楚地传达:MCP和PCP不绑定另一个RBP的原址。此外,突变的绑定站点呈现不同的结果,其中某些绑定站点表现出与本机站点类似的关联级别,例如 PP7-mut-1、PP7-mut-2 和 MS2-mut-3,而其他绑定站点的亲和力显著较低,例如PP7-mut-3 和 MS2-mut-2。因此,该测定结果对限制性商业惯例的结合亲和力进行了定量的体内测量,结果与过去使用这些限制性商业惯例的实验的结果相当。
由于测定基于mCherry基因的抑制,因此需要一个可行的mCherry信号。因此,在设计绑定网站盒时,需要牢记两个设计规则。首先,应保留 mCherry 的开放读取框 (ORF)。由于结合位点长度可能不同,将其插入基因可能导致一个或两个碱基从原来的mCherry ORF移动。因此,如果需要(图4A),将一个或两个基直接插入到绑定站点的下游。例如,一个20基长的结合位点,具有两个碱基的β,将产生22个碱基到mCherry基因。为了保持ORF,我们需要增加两个基地,总共24个基地。第二个设计规则是避免将停止科顿插入 mCherry ORF。某些绑定位点(如 MS2-mut-2(图 4Binset)在三个可能的 ORF 中的一个或多个位置中定位时包含停止通子。图4A中说明了这样一个例子,其中绑定站点包含一个停止号子,该基顿仅在未添加基时与 mCherry ORF 处于框架中。从该位置的剂量-响应曲线(图4B)可以看出,mCherry的产生率是检测不到的,因此无法测量结合亲和力。
仔细查看图4B可以说明间距对 mCherry 生产的影响。例如,对于 α = 4,基础生产速率比 α = 5 的系数高出 6 倍,从而确保更高的褶皱抑制效果。然而,对于 α = 14,基础生产水平太低,无法观察到下降调节效果。
图 1:系统设计和克隆步骤概述。结合位点质粒(左)和RBP-mCerulean质粒(右)的盒式设计说明。下一步是将两个质粒连续转化为合格的大肠杆菌细胞,首先将RBP质粒转化为合格的大肠杆菌细胞。然后测试双转化剂在增加诱导剂浓度时其mCherry表达水平;如果 RBP 绑定到绑定位点,mCherry 水平会随着 mCerulean(灰色气泡)的函数而下降。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:分析方案。(A) 三维 (3D) 绘图,将原始 OD 水平(顶部)、mCerulean 荧光(中)和 mCherry 荧光(底部)描述为时间和诱导剂浓度的函数,用于正应变。(B) 顶部:通过将每个荧光水平除以各自的光量,并平均计算两个正(左)的 2-3 h 指数增长时间窗口中的所有值,计算出每个诱导浓度的 mCerule 一个稳态表达水平和负(右)菌株。底部:根据 Eq. 3 计算的 mCherry 生产速率,用于感应后 2⁄3 小时的时间点。(C) mCherry 的产生速率绘制为均 mCerulean 荧光的函数,平均两个菌株的生物重复数为两个。误差条是从至少两个复制获得的平均 mCherry 生产速率和平均 mCerulean 荧光的标准偏差。(D)适合使用 Eq. 4 中所示的正应变(左)中的拟合公式,表现出特定的结合反应。对于负应变(右),未提取 KRBP值。数据以重复显示。这个数字已经根据Katz等人10号的许可进行了修改。版权所有 2018 美国化学学会。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:具有代表性的最终结果。(A) 基于两个限制性商业惯例和十个不同位置的十个结合位点,对三十种不同的菌株的标准化剂量反应曲线。观察到三种类型的响应:高亲和力、低亲和力和无亲和力。(B) 两个限制性商业惯例(MCP和PCP)的定量KRBP结果,有五个不同的装订位盒(列出)。所有RBP结合位点菌株均重复测量。这个数字已经根据Katz等人10号的许可进行了修改。版权所有 2018 美国化学学会。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:具有突变绑定位点的 MCP 的示例设计和结果。(A) 在四个不同地点设计装订现场盒的插图。盒式包括核糖体结合位点,mCherry的起始科顿,β间隔碱,被测试的结合位点,维持ORF的一个或两个碱基,以及mCherry基因的其余部分。红星表示停止科顿。(B) 在四个不同位置具有突变结合位点的 MCP 的剂量-响应曲线。内分:测试的突变绑定位点的顺序。提供的结果是每个菌株的重复。请点击此处查看此图的较大版本。
| 名字 | Binidng 站点位置,A 在 AUG = 1 | 绑定站点序列(用于控件的 RBS) | 站点: ATG 到第二 mCherry 科顿 GTG 控件:RBS 到第二 mCherry 科顿 GTG |
源 |
| MS2_wt_d5 | 5 | 阿卡特加加特加特 | 阿加特加加特加特格格 | Gen9公司 |
| MS2_wt_d6 | 6 | 阿卡特加加特加特 | 阿格卡加特加特格特格 | Gen9公司 |
| MS2_wt_d8 | 8 | 阿卡特加加特加特 | 阿格加加特加特 cgtg |
Gen9公司 |
| MS2_wt_d9 | 9 | 阿卡特加加特加特 | 阿格切卡加加加茨加茨 特格特格 |
Gen9公司 |
| MS2_U(-5)C_d8 | 8 | 阿卡特加加特卡特 | 阿格加加特加特格格 Tg |
Gen9公司 |
| MS2_U(-5)C_d9 | 9 | 阿卡特加加特卡特 | 阿格加加特加特格 Tg |
Gen9公司 |
| MS2_U(-5)C_d8 | 8 | 阿卡特加加特 | 阿格加加特加特格格 Tg |
Gen9公司 |
| MS2_U(-5)G_d9 | 9 | 阿卡特加加特 | 阿格加加特加特格 Tg |
Gen9公司 |
| MS2_结构_d9 | 9 | 卡卡加格特特加特 | 阿格恰卡加加特特塔特格 Tg |
Gen9公司 |
| MS2_结构_d8 | 8 | 卡卡加格特特加特 | 阿切尔卡阿卡加加特特加特格格 Tg |
Gen9公司 |
| PP7wt_d5' | 5 | 塔加格塔塔塔加阿肯塔 | 阿格塔加加特塔加阿奇 克塔克特格 |
Gen9公司 |
| PP7wt_d6' | 6 | 塔加格塔塔塔加阿肯塔 | 阿加塔加加加特塔加亚克 ccttagtg |
扭曲生物科学 |
| PP7wt_d8' | 8 | 塔加格塔塔塔加阿肯塔 | 阿加卡塔塔加 阿克塔克塔格特格 |
扭曲生物科学 |
| PP7wt_d9' | 9 | 塔加格塔塔塔加阿肯塔 | 阿卡塔塔加 阿克拉特加特格 |
扭曲生物科学 |
| PP7_USLSBm_d6 | 6 | 塔奇格塔塔塔加阿格格塔 | 阿格塔切塔塔塔加阿格 格塔格特格 |
Gen9公司 |
| PP7_USLSBm_d15 | 15 | 塔奇格塔塔塔加阿格格塔 | 阿格格格格格格塔切塔 塔格加格格特加格特格 |
Gen9公司 |
| PP7_nB_d5 | 5 | 塔格格塔塔塔加阿肯塔 | 阿格塔格特塔塔塔加阿阿格 塔格格特格 |
Gen9公司 |
| PP7_nB_d6 | 6 | 塔格格塔塔塔加阿肯塔 | 阿格塔格特塔塔加阿奇 cttatgtg |
Gen9公司 |
| PP7_US_d5 | 5 | 塔加格塔塔加卡肯塔 | 阿格塔加加特加特加克 塔格特格 |
Gen9公司 |
| PP7_US_d6 | 6 | 塔加格塔塔加卡肯塔 | 阿格塔加加塔塔加格格克 塔格格特格 |
Gen9公司 |
| 否_BS_d1 | - | - | 塔亚加加加加格加特卡特格 Tg |
Gen9公司 |
| 否_BS_d4 | - | - | 塔亚加加加加格加特卡特格 格格特格 |
Gen9公司 |
| 否_BS_d10 | - | - | 塔亚加加加加格加特卡特格 gcgccgggg |
Gen9公司 |
| 用于装订位盒的测序引种 | gcatttt卡塔加塔加塔格格 | IDT | ||
| RBP 盒的测序引基 | 格格格格格格特塔塔塔塔 | IDT | ||
表1:绑定位点和排序引填器。本研究中使用的结合位点和结合位点盒的序列,以及协议中详细介绍的测序反应的引注(步骤1.2.5.1和1.3.3)。
| 此作品中的 RBP 名称 | 源生物名称, 蛋白质 | 源生物基因 | 源生物参考 | wt aa seq | wt(和引用)的更改 | 本工作中使用的 aa seq | 本工作中使用的 nt seq |
| Mcp | 埃舍里西亚病毒MS2 | Cp | NC_001417.2 | 马斯纳夫特·卡夫夫 DNGGTDVTV APSNFANGVA EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI KVEVPKVATQT VGGVELPVA AWRSYLNMEL 蒂普法特 CELIVKAMQG LLKDGNPIPS AIAANSGIY |
德尔F-G[1] V29I [1] 取自添加基因质粒 27121 |
马斯纳夫特·卡夫夫 DNGGTDVTV APSNFANGIA EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI KVEVPKG AWRSYLNMEL 蒂普法特 CELIVKAMQG LLKDGNPIPS AIAANSGIY |
ATGGCTTCTA 阿泰塔塔克塔 GTTCGTTCTC 格格格卡卡阿加特 GCGGAACTGG CGACGTGACT 格格格CCCCAA GCAACTTCGC TAAGGGGATC GCTGAATGGA TAGCTCTA CTCGCGTTCA 中国 AAGTAACCG 塔格格特TCGT 卡加格克特格 CGCAGAATCG 中国民航总局 ATCAAGT 阿格格海格塔 AGGCGCCTGG CGTTCGTACT 塔阿塔塔格 ACTAACCATT CCAtTTTCG 中航协 CGACTGCGAG 卡塔特格塔 AGGCAATGCA AGGTCTCA AAAGATGGA ACCCGATTCC CTCAGCAATC GCAGCAAACT CCGGCATTac |
| 五 氯 酚 | 伪多面噬菌体 PP7 | Cp | NC_001628.1 | MSKTIVLSVGEA TRTLTEIQST ADRQIFEEKV GPLVGRLRLT 阿斯尔克恩塔克 艾尔维NLKLDQ ADVVDCSTSVC GELPKVRYTQ VWSHDVTIVA NSTEASRKSL YDLTKSLVAT SQVEDLVVNL VPLGR |
德尔F-G [2] 取自添加基因质粒 40650 |
姆拉斯克蒂夫列夫夫夫 伊特蒂克 斯塔德基菲 克克GPLVGRLR LTASLRQNGA KTAYRVNLKL DQADVVDSG LPKVRYTQVW 什德维万斯 蒂茨克斯利德 LTKSLVATSQ VEDLVVNLVP LGR |
ATGCTAGCCTC CAAAACCATC 格特特茨克GG TCGGCGAGGC TACTCCACT CTGACTGAGA TCCAGTCC CGCAGACCGT CAGATCTTCG 阿加格格GT CGGGCCTCTG GTGGGTCGGC TGCGCCTCAC GGCTTCGCTC CGTCAAAACG GAGCCAAGAC CGCGTATCGC 格格卡卡塔亚 阿ACTGGATCA GGCGGTC GTTGATTCCG GACTTCCGAA AGTGCTAC ACTCAGGAT GGTCGCACGA CGTGACAATC GTTGCATA GCACCGAGGC 中国石油天然气总公司 TCGTGTACG ATTTGACCAA GTCCCTCGTC 全球气候大会CCTCGC AGGTCGAAGA 特格特格格茨特 AACCTTGTGC CGCTGGGCCGT |
| 引用： | |||||||
| 1.皮博迪,D.S.,Ely,K.R.通过蛋白质-蛋白质相互作用控制转化抑制。核酸研究。20 (7), 1649–1655 (1992)。 | |||||||
| 2. 赵,J.A.,Patskovsky,Y.,阿尔莫,S.C.,歌手,R.H.病毒RNA-蛋白质复合物共同进化的结构基础。自然结构与分子生物学。15 (1), 103–105, doi: 10.1038/nsmb1327 (2008) | |||||||
表 2:RBP 序列。本研究中使用的涂层蛋白的氨基酸和核苷酸序列。
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Discussion
本文描述的方法有助于对大肠杆菌细胞中的RBP-RNA结合亲和力进行定量的体内测量。该协议相对简单,无需使用精密机械即可进行,数据分析也非常简单。此外,结果会立即产生,没有与下一代测序 (NGS) 结果相关的相对长的等待时间。
这种方法的一个限制是,它只在细菌细胞中工作。然而,先前的研究12已经证明在哺乳动物细胞中使用类似的方法对L7AE RBP具有抑制作用。该方法的另一个限制是,在 mCherry 起始区域中插入绑定位点可能会抑制基础 mCherry 水平。即使在没有RBP的情况下,结合位点的结构复杂性或高稳定性也会干扰核糖体启动,从而导致mCherry基础水平降低。如果基础水平过低,RBP浓度的增加带来的额外抑制将难以观察到。在这种情况下,最好设计装订位盒,结合位点仍在起始区域,但处于从起始区域到伸长区域过渡的边缘(*在 12-15 bp10、29) 的范围内。我们已经表明,对于这种值,仍然可以观察到抑制效应。为了增加检测工作的机会,无论结构复杂程度如何,我们建议对给定绑定位点至少三个不同的位置执行测定。
与EMSA等体外方法相比,该方法的主要缺点是RBP-RNA结合亲和力不是以RBP浓度的绝对单位来衡量的,而是以融合-RBP荧光来衡量的。这种劣势是体内环境的直接结果,这限制了我们读取 RBP 实际浓度的能力。这种缺点被体内环境中测量的好处所抵消。例如,在将体内测定结果与以前的体外和原位测定进行比较时,我们发现结合亲和力存在差异。这些差异可能源于体内mRNA分子结构的差异,这些分子产生于细胞10、11、30、31。这种结构差异可能导致体内折叠状态的稳定性发生变化,进而稳定或消除 RBP 结合。
由于该方法相对简单且成本低廉,我们建议在实际实验的同时运行多个控件。运行负对照,即与 RBP 没有亲和力但具有类似结构特征的序列,可以帮助避免由与 mRNA 的非特定相互作用引起的误报。在显示的代表性结果中,两个阴性对照是mCherry基因(无结合位点)和其他RBP的原生结合位点(即MCP的PP7-wt和PCP的MS2-wt)。此外,我们建议合并正控制(如 RBP 及其本机绑定站点)。这种控制将有助于通过提出参考点来量化约束亲和力,并避免低折叠抑制产生的假负。
最后,对于那些希望获得RBP-RNA结合的结构观点的人,我们建议进行一种选择性的2+羟基环化,通过引物扩展测序(SHAPE-Seq)11、32、33进行分析。实验。SHAPE-Seq 是一种 NGS 方法,结合 RNA 的化学探测,可用于估计 RNA 的二次结构以及 RNA 与其他分子(如蛋白质)的相互作用。在我们以前的工作中,我们进行了SHAPE-Seq实验,在体内条件34和体外与纯化重组蛋白10,35的代表性菌株。在我们的案例中,结果显示RBP结合影响RNA的片段比之前报告的这些RNA在体外36的片段要广泛得多。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目得到了规划和预算委员会和以色列科学基金会(第152/11号赠款)的I-CORE方案的资助,玛丽·居里重返社会赠款号为第152/11号赠款。PCIG11-GA- 2012-321675,以及欧盟地平线2020年研究与创新计划,根据授权协议664918 - MRG-Grammar。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8-lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| Glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| Incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| Ligase | NEB | B0202S | |
| Liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| Multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| Platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| Sodium Chloride (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
References
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