Summary
I denne metode kvantificerer vi binding affiniteten af RNA bindende proteiner (RBPs) til at cognate og ikke-cognate bindingssteder ved hjælp af en simpel, levende, reporter assay i bakterieceller. Analysen er baseret på undertrykkelse af et reporter-gen.
Abstract
I indledningen af protein oversættelsen binder ribosom sig til Initierings området for mRNA. Initiering af oversættelse kan blokeres ved binding af et RNA-bindingsprotein (RBP) til Initierings området for mRNA, som forstyrrer ribosom-binding. I den præsenterede metode udnytter vi dette blokerende fænomen til at kvantificere den bindende affinitet af RBPs til deres cognate og ikke-cognate bindingssteder. For at gøre dette indsætter vi et test bindingssted i Initierings området for en reporter mRNA og inducerer ekspression af testen RBP. I tilfælde af RBP-RNA-binding observerede vi en sigmoidal undertrykkelse af journalistens udtryk som en funktion af RBP-koncentrationen. I tilfælde af manglende affinitet eller meget lav affinitet mellem bindingssted og RBP blev der ikke observeret nogen signifikant undertrykkelse. Metoden udføres i levende bakterieceller og kræver ikke dyre eller sofistikerede maskiner. Det er nyttigt til at kvantificere og sammenligne mellem de bindende tilhørsforhold af forskellige RBPs, der er funktionelle i bakterier til et sæt af designede bindingssteder. Denne metode kan være uhensigtsmæssig for bindingssteder med høj strukturel kompleksitet. Dette skyldes muligheden for undertrykkelse af ribosomale initiering ved kompleks mRNA struktur i fravær af RBP, hvilket ville resultere i lavere basal reporter genekspression, og dermed mindre observerbare reporter undertrykkelse ved RBP binding.
Introduction
RNA binding protein (RBP)-baseret post-transkriptional regulering, specifikt karakterisering af samspillet mellem RBPs og RNA, er blevet undersøgt udførligt i de seneste årtier. Der er flere eksempler på translationel Nedregulering i bakterier, som stammer fra rbps-hæmmende eller direkte konkurrerer med ribosom-bindingen1,2,3. Inden for syntetisk biologi er der opstået RBP-RNA-interaktioner som et vigtigt redskab til design af transkriptionsbaserede genetiske kredsløb4,5. Derfor er der en stigning i efterspørgslen efter karakterisering af sådanne RBP-RNA interaktioner i en cellulær sammenhæng.
De mest almindeligt forekommende metoder til undersøgelse af protein-RNA-interaktioner er elektroforetic Mobility Shift assay (EMSA)6, som er begrænset til in vitro-indstillinger, og forskellige pull-down assays7, herunder Clip-metoden8,9 . Selv om sådanne metoder muliggør opdagelsen af de Novo RNA-bindingssteder, lider de af ulemper såsom arbejdsintensive protokoller og dyre dybe sekvensering reaktioner og kan kræve et specifikt antistof for RBP pull-down. På grund af den modtagelige karakter af RNA til sit miljø, mange faktorer kan påvirke RBP-RNA interaktioner, understreger vigtigheden af at forhør RBP-RNA binding i cellulære kontekst. For eksempel har vi og andre vist signifikante forskelle mellem RNA-strukturer in vivo og in vitro10,11.
Baseret på tilgangen i en tidligere undersøgelse12, vi for nylig demonstreret10 , at når du placerer pre-designede bindingssteder for kapsid rbps fra Bakteriofager GA13, MS214, PP715, og qβ16 i oversættelses Initierings området for en reporter mRNA, reporter Expression er stærkt undertrykt. Vi præsenterer en forholdsvis enkel og kvantitativ metode, der er baseret på dette undertrykkelses fænomen, til at måle affiniteten mellem RBPs og deres tilsvarende RNA-bindingssted in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargøring af systemet
- Design af binding-site plasmider
- Design den indbindingsside kassette, som er afbildet i figur 1. Hvert mini gen indeholder følgende dele (5 ' til 3 '): eagl restriktion site, ∼ 40 baser af 5 ' enden af kanamycin (kan) modstands genet, pLac-Ara Promoter, ribosom bindingssted (RBS), aug af mcherry genet, et spacer (δ), en RBP binding site, 80 baser af 5 ' ende af mCherry-genet og et ApaLI-begrænsnings sted.
Bemærk: For at øge succesraten for analysen, designe tre binding-site kassetter for hver bindingssted, med Spacers bestående af mindst en, to, og tre baser. Se afsnittet om repræsentative resultater for yderligere retningslinjer.
- Design den indbindingsside kassette, som er afbildet i figur 1. Hvert mini gen indeholder følgende dele (5 ' til 3 '): eagl restriktion site, ∼ 40 baser af 5 ' enden af kanamycin (kan) modstands genet, pLac-Ara Promoter, ribosom bindingssted (RBS), aug af mcherry genet, et spacer (δ), en RBP binding site, 80 baser af 5 ' ende af mCherry-genet og et ApaLI-begrænsnings sted.
- Kloning af bindende site plasmid'er
- Bestil bind-site kassetterne som dobbeltstrenget DNA (dsDNA) mini Genes. Hvert mini-gen er ∼ 500 BP lang og indeholder et område med Eagl-begrænsning og et ApaLI-begrænsnings sted ved henholdsvis 5 ' og 3 '-enderne (Se trin 1.1.1).
Bemærk: I dette eksperiment blev mini-gener med halvdelen af kanamycin-genet beordret til at lette screening for positive kolonier. Men Gibson assembly17 er også velegnet her, og i så fald kan bindingsstedet bestilles som to kortere supplerende enkeltstrenget DNA-oligoer. - Dobbelt-fordøje både mini-gener og målet vektor med eagl-HF og apali af restriktions protokol18, og kolonne rense19.
- Ligate de Ford øjede mini gener til bindingen-site backbone, der indeholder resten af mCherry reporter genet, Terminator, og en kanamycin resistens gen20.
- Omdanne ligations opløsningen til Escherichia coli top10 celler21.
- Identificer positive transformanter via sanger sekvensering.
- Design en primer 100 baser opstrøms til regionen af interesse (Se tabel 1 for primer sekvenser).
- Miniprep et par bakterielle kolonier22.
- Der fremstilles 5 μL af en 5 mM opløsning af primer og 10 μL af DNA ved 80 ng/μL koncentration.
- Send de to løsninger til en bekvem facilitet for sanger sekvensering23.
- Opbevar rensede plasmider ved-20 °c, og bakteriestammer som glycerol bestande24, både i 96-Well format. DNA vil derefter blive brugt til omdannelse til E. coli top10 celler, der indeholder en af fire fusion-RBP plasmider (Se trin 1.3.5).
- Bestil bind-site kassetterne som dobbeltstrenget DNA (dsDNA) mini Genes. Hvert mini-gen er ∼ 500 BP lang og indeholder et område med Eagl-begrænsning og et ApaLI-begrænsnings sted ved henholdsvis 5 ' og 3 '-enderne (Se trin 1.1.1).
- Design og konstruktion af RBP plasmid
Bemærk: Amino syrer og nukleotidsekvenser af de pels proteiner, der anvendes i dette studie, er opført i tabel 2.- Bestil den påkrævede RBP sekvens, der mangler et stop codon som en Custom-bestilt dsDNA mini gene mangler et stop codon med restriktionssteder i enderne (figur 1).
- Klon den testede RBP mangler et stop codon umiddelbart nedstrøms for en inducerbar promotor og opstrøms for et fluorescerende protein mangler en start codon (figur 1), svarende til trin 1.2.2-1.2.4. Sørg for, at RBP plasmid indeholder et andet antibiotikaresistens-gen end bindingsstedet plasmid.
- Identificer positive transformanter via sanger sekvensering, svarende til trin 1.2.5 (Se tabel 1 for primer-sekvenser).
- Vælg en positiv transformant, og gør den kemisk kompetent25. Opbevares som glycerol rensede plasmider ved-20 °c og glycerol lagre af bakteriestammer24 ved-80 °c i 96-brønd plader.
- Transformér bindings stedets plasmider (fra trin 1.2.6) lagret i 96-brønd plader til kemisk kompetente bakterieceller, der allerede indeholder en RBP-mCerulean plasmid21. For at spare tid, i stedet for plating cellerne på Petri skåle, plade dem ved hjælp af en 8-kanals pipette på 8-Lane plader, der indeholder Luria-bertani (lb)26 agar med relevante antibiotika (kan og amp). Kolonierne skal vises i 16 timer.
- Vælg en enkelt koloni for hver dobbelt transformant og vokse natten over i LB medium med de relevante antibiotika (kan og amp) og gemme som glycerol bestande24 ved-80 °c i 96-brønd plader.
2. opsætning af eksperiment
Bemærk: Den protokol, der præsenteres her, blev udført ved hjælp af et robot system til Væskehåndtering i kombination med en inkubator og en plade læser. Hver måling blev udført for 24 induktor koncentrationer, med to duplikater for hver stamme + induktor kombination. Ved hjælp af dette robot system blev data for 16 stammer pr. dag med 24 induktor-koncentrationer indsamlet. Men hvis en sådan anordning ikke er tilgængelig, eller hvis færre eksperimenter er nødvendige, kan disse nemt gøres ved hånden ved hjælp af en 8-kanals multi-pipette og tilpasning af protokollen i overensstemmelse hermed. For eksempel blev der opnået foreløbige resultater for fire stammer pr. dag med 12 induktor-koncentrationer og fire tidspunkter på denne måde.
- Forbered, på forhånd, 1 L bioassay buffer (BA) ved at blande 0,5 g tryptone, 0,3 mL glycerol, 5,8 g NaCl, 50 mL af 1 M MgSO4, 1 ml 10x fosfat-Buffered saltvand (PBS) buffer pH 7,4, og 950 ml af dobbeltdestilleret vandet (DDW). Autoklave eller sterile filter BA-bufferen.
- Vokse de dobbelt transformerende stammer ved 37 °C og 250 rpm omrystning i 1,5 mL LB med passende antibiotika (kanamycin i en endelig koncentration på 25 μg/mL og ampicillin i en endelig koncentration på 100 μg/mL), i 48-brønd plader, over en periode på 18 h (overnight).
-
I morgen, gøre følgende forberedelser.
- Inducer plade. I en ren 96-brønd plade forberedes brønde med halvdårlig medium (SPM) bestående af 95% BA og 5% LB26 i inkubator ved 37 °c. Antallet af brønde svarer til det ønskede antal induktor koncentrationer. Der tilsættes C4-HSL til brøndene i induktor pladen, som vil indeholde den højeste induktor koncentration (218 nm).
- Program mere robotten til serielt fortyndet medium fra hver af de højeste koncentrations brønde til 23 lavere koncentrationer, som spænder fra 0 til 218 nM. Mængden af hver induktor fortynding bør være tilstrækkelig for alle stammer (herunder duplikater).
- Mens induktor fortyndinger forberedes, varm 180 μl Spm i inkubator ved 37 °c, i 96-brønd plader.
- De overnight stammer fra trin 2,2 fortyndes med en faktor på 100 ved serielle fortyndinger: først fortyndes med en faktor 10 ved at blande 100 μL bakterier med 900 μL SPM i 48-brønd plader, og derefter fortyndes igen med en faktor 10 ved at tage 20 μL fra den fortyndede opløsning til 180 μL forvarmet SPM, i 96-brønd plader egnet til fluorescerende målinger.
- Tilsæt den fortyndede induktor fra induktor pladen til 96-brønd pladerne med de fortyndede stammer i henhold til de endelige koncentrationer.
- Ryst 96-brønd pladerne ved 37 °C i 6 timer, mens der tages målinger af optisk densitet ved 595 nm (OD595), mcherry (560 nm/612 nm) og mCerulean (460 nm/510 nm) Fluorescens via en plade læser hver 30 min. For normaliserings formål måles væksten af SMP uden at tilføje celler.
3. foreløbige resultater analyse
- For hver dag i forsøget skal du vælge et tidsinterval for logaritmisk vækst i henhold til de målte vækstkurver, mellem den lineære vækstfase og den stationære (T0, t-finalen). Tag ca. 6 − 8 tidspunkter, mens de første og sidste målinger kasseres for at undgå fejl afledt af unøjagtighed af eksponentiel vækst detektering (Se figur 2a, toppanelet).
Bemærk: Kassér stammer, der viser unormale vækstkurver eller-stammer, hvor logaritmisk vækstfase ikke kunne påvises, og Gentag eksperimentet. -
Beregn den gennemsnitlige normaliserede fluorescens for mCerulean og produktionshastigheden af mCherry, fra rådata for både mCerulean og mCherry fluorescens for hver induktor koncentration (figur 2a).
- Beregn normaliseret mCerulean på følgende måde:
hvor blank (mCerulean) er mCerulean niveau [a.u.] for medium kun, blank (OD) er den optiske tæthed for medium kun, og mCerulean og OD er henholdsvis mCerulean fluorescens og optisk tæthed værdier. - Gennemsnitlig mCerulean over de forskellige tidspunkter (figur 2b, de to øverste paneler) som følger:
hvor #Time punkter er antallet af data tidspunkter taget i betragtning, T0 er det tidspunkt, hvor den eksponentielle vækstfase begynder, og tendelig er det tidspunkt, hvor den eksponentielle vækstfase slutter. - Beregn mCherry produktionshastighed (figur 2b, to nederste paneler) som følger:
hvor mCherry (t) er mCherry-niveauet [a.u.] til tiden t, er OD den optiske tætheds værdi, T0 er det tidspunkt, hvor den eksponentielle vækstfase begynder, og tFinal er det tidspunkt, hvor den eksponentielle vækstfase slutter.
- Beregn normaliseret mCerulean på følgende måde:
- Endelig plot mCherry produktionshastigheden som en funktion af mCerulean, skabe dosisrespons kurver som en funktion af RBP-mCerulean fusion fluorescens (figur 2c). Sådanne parceller repræsenterer produktion af reporter genet som en funktion af RBP tilstedeværelse i cellen.
4. dosisrespons funktion montering rutine og KRBP ekstraktion
- Ud fra den antagelse, at den ribosom-oversættelses hastighed, der er bundet til RBP, er konstant, modellere produktions raten for mcherry som følger (Se figur 2D, grøn linje):
hvor [x] er den normaliserede gennemsnitlige mcerulean Fluorescens beregnet i henhold til EQ. 2, er mcherry produktionshastighed den værdi, der beregnes i henhold til EQ. 3, kRBP er den relative bindingsaffinitet [a.u.], kubundet er ribosom-raten for oversættelse med RBP ubundet, n er cooperativitets faktoren, og C er basis fluorescensen [a.u.]. C, n, Kubundetog kRBP findes ved at tilpasse mcherry Production rate data til modellen (EQ. 4). - Ved hjælp af dataanalyse software, gennemføre en passende procedure på parceller skildrer mCherry produktionshastighed som en funktion af gennemsnit mCerulean (trin 3,3), og udtrække pasform parametre i henhold til formlen i EQ. 4.
Bemærk: Der tages kun hensyn til passende resultater med R2 > 0,6. For dem, der passer, KRBP fejl er for det meste i intervallet 0,5% til 20% af KRBP værdier, for en 0,67 konfidensinterval, mens dem med højere KRBP fejl kan også verificeres af øjet. - Normalisere KRBP værdier med den respektive maksimale værdi af gennemsnitligt mCerulean for hver dosis-responsfunktion.
hvor KRBP i [a.u.] er den værdi, der udvindes fra monterings proceduren i EQ. 4, og Max (gennemsnitligt mcerulean) er det maksimale gennemsnits mcerulean signal [a. u] observeret for den aktuelle stamme.
Bemærk: Normaliseringen letter den korrekte sammenligning af regulerings effekten på tværs af stammer ved at eliminere afhængigheden af de særlige maksimale RBP-udtryks niveauer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den præsenterede metode udnytter konkurrencen mellem en RBP og ribosom til binding til mRNA molekyle (figur 1). Denne konkurrence afspejles af faldende mCherry niveauer som en funktion af øget produktion af RBP-mCerulean, på grund af stigende koncentrationer af inducer. I tilfælde af øget mCerulean fluorescens, uden væsentlige ændringer i mCherry, udledes en mangel på RBP binding. Repræsentative resultater for både en positiv og en negativ stamme er afbildet i figur 2. I figur 2apræsenteres OD-, mcherry-og mCerulean-kanalerne som en funktion af tiden og inducerer over et interval på fire timer med t0 = 1 h og tFinal = 3,5 h. I figur 2ber den gennemsnitligt mcerulean fluorescens (top) og mcherry produktionshastighed (bund) præsenteret som en funktion af induktor koncentration, for de to eksempel stammer. Som det kan ses, viser resultaterne for en positiv stamme en tydelig ned regulerende virkning i mcherry-produktionshastigheden (figur 2b, C), hvilket svarer til en signifikant ikke-nulværdi af KRBP (figur 2D). For den positive stamme gav monterings proceduren følgende værdier: KRBP = 394,6 A.u., kubundet = 275,6, n = 2,1, C = 11,2 a.u. og R2 = 0,93. Efter normalisering af den maximale mCerulean fluorescens var KRBP -værdien 0,24. For den negative stamme blev der observeret en mangel på særskilt respons (figur 2c), og ingen KRBP -værdi blev ekstraheret (figur 2D).
I figur 3præsenterer vi resultaterne af denne analyse for to fagtypning coat rbps, PP7 og MS2, på flere muterede bindingssteder, på forskellige steder inden for Initierings området af mcherry mRNA. Resultaterne er groft klassificeret i tre typer svar (figur 3a): stammer, der udviser en nedregulering på et lavt mCerulean niveau, hvilket afspejler en lav KRBP -værdi (høj bindingsaffinitet); stammer, der udviser Nedregulering ved enten mellemliggende eller høje mCerulean-niveauer, hvilket afspejler en høj KRBP -værdi (mellem eller lav affinitet) og stammer udviser ingen særskilt respons på stigende niveauer af mCerulean, hvilket afspejler en højere KRBP værdi end den maksimale RBP koncentration i cellen (ingen detectible binding affinitet). Figur 3b præsenterer den minimale KRBP -værdi beregnet for hver RBP − binding-site kombination baseret på alle kombinationer af de to rbps og ti bindingssteder på forskellige positioner. Bindings stederne omfatter en negativ kontrol (ingen bindingssted), ikke-matchende bindingssteder og en positiv kontrol-det Native bindingssted for hver RBP (PP7-WT for PP7 coat protein [PCP] og MS2-WT for MS2 coat protein [MCP]). Resultaterne svarer til forudsigelserne, da begge RBPs udgør en høj affinitet for deres positive kontroller og en ikke-detectible bindingsaffinitet for de negative kontroller. Desuden har tidligere undersøgelser med disse to rbps27,28 observeret, at de er ortogonale, som er klart transporteres i heatmap præsenteret: både MCP og PCP binder ikke det oprindelige sted for den anden RBP. Desuden præsenterer de muterede bindingssteder varierende resultater, hvor nogle bindingssteder viste et tilsvarende affinitets niveau som det oprindelige websted, såsom PP7-mut-1, PP7-mut-2 og MS2-mut-3, mens andre viste en signifikant lavere affinitet, f. eks. PP7-mut-3 og MS2-mut-2. Analysen viste således en kvantitativ in vivo-måling af den bindende affinitet af RBPs, hvilket giver resultater, der kan sammenlignes med tidligere eksperimenter med disse RBPs.
Da analysen er baseret på undertrykkelse af mCherry-genet, kræves der et levedygtigt mCherry-signal. Derfor, når du udformer bindende site kassette, der er to design regler at huske på. For det første skal den åbne læse ramme (ORF) af mCherry holdes. Da bindings stedets længde kan variere, kan det medføre en forskydning af et eller to baser fra den oprindelige mCherry ORF ved at indsætte det i genet. Hvis det er nødvendigt (figur 4a), skal du derfor indsætte et eller to baser umiddelbart nedstrøms til bindingsstedet. For eksempel, et bindende websted, der er 20-base lang, med en δ af to baser, vil give en tilføjelse af 22 baser til mCherry genet. For at holde ORF, er vi nødt til at tilføje to baser, for i alt 24 baser. Den anden designregel er at undgå indsættelser af stop kodon i mcherry ORF. Nogle bindingssteder, som MS2-mut-2 (figur 4b, inset), indeholder stop kodon, når de er placeret i en eller flere af de tre mulige orf'er. Et eksempel herpå er illustreret i figur 4a, hvor bindingsstedet indeholdt et stop-codon, der kun er i ramme med MCHERRY ORF, når der ikke er tilføjet nogen baser. Som det kan ses i dosis-respons kurven for denne position (figur 4b), var produktionshastigheden for mcherry ikke målbart, således at bindings affiniteten ikke kunne måles.
Et nærmere kig på figur 4b viser virkningen af afstanden δ på mcherry produktion. For eksempel, for δ = 4, basal produktion sats var en faktor på seks mere end dem for δ = 5, sikre en højere fold-undertrykkelse effekt. For δ = 14 var de basale produktionsniveauer imidlertid for lave til at overholde en nedadgående regulerende virkning.
Figur 1: oversigt over system design og klonings trin. Illustration af kassette designet til bindingsstedet plasmid (venstre) og RBP-mCerulean plasmid (højre). Det næste skridt er efterfølgende transformationer af begge plasmider til kompetente E. coli -celler, med RBP plasmider først. Dobbelt transformanter testes derefter for deres mcherry Expression niveauer i stigende induktor koncentrationer; Hvis RBP binder sig til bindingsstedet, forringes mCherry-niveauerne som en funktion af mCerulean (grå boble). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: analyseordning. (A) tredimensionale (3D) parceller, der skildrer rå OD niveauer (top), mcerulean fluorescens (midten), og mcherry fluorescens (bund) som funktion af tid og induktor koncentration, for en positiv stamme. (B) Top: mCerulean Steady-State ekspressionsniveauer for hver induktor koncentration beregnes ved at dividere hvert fluorescens niveau med den respektive OD og gennemsnit over alle værdier i 2 − 3 h eksponentiel væksttids vindue for både den positive (venstre) og negative (højre) stammer. Bund: mCherry produktionshastighed beregnet i henhold til EQ. 3 for tidspunkter 2 − 3 h efter induktion. C) mcherry produktionshastighed afbildet som en funktion af middelværdien af mCerulean fluorescens i gennemsnit over to biologiske duplikater for to stammer. Fejllinjer er standardafvigelsen for både mCherry-produktionshastigheden og den gennemsnitligt mCerulean-fluorescens, der er erhvervet fra mindst to replikater. D) egnet til KRBP ved hjælp af tilpasnings formlen i EQ. 4, der er vist for den positive stamme (venstre), og som udviser et specifikt bindings respons. For den negative stamme (højre) blev ingen KRBP -værdi ekstraheret. Data vises i duplikat. Dette tal er blevet tilpasset med tilladelse fra Katz et al.10. Copyright 2018 det amerikanske kemikalie selskab. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative endelige resultater. A) normaliserede dosisrespons kurver for tredive forskellige stammer baseret på to rbps og ti bindingssteder på forskellige steder. Der observeres tre typer svar: høj affinitet, lav affinitet og ingen affinitet. B) kvantitative KRBP -resultater for to RBPS (MCP og PCP) med fem forskellige indbindings sted kassetter (angivet). Alle RBP − binding-site stammer blev målt i duplikat. Dette tal er blevet tilpasset med tilladelse fra Katz et al.10. Copyright 2018 det amerikanske kemikalie selskab. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: eksempel design og resultater for MCP med et mutant bindingssted. (A) design illustration af bindende side kassetter på fire forskellige steder. Kassette, herunder ribosom bindingssted, start codon for mcherry, δ spacer baser, bindende site testet, en eller to baser til at vedligeholde ORF, og resten af mcherry genet. Røde stjerner indikerer et stop codon. B) dosisrespons kurver for MCP med et mutant bindingssted på fire forskellige steder. Inset: sekvensen af det testede, muterede bindingssted. De forelagte resultater er for dubletter af hver stamme. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn | Binidng site placering, A i AUG = 1 | Sekvens af bindingssted (RBS for kontrolelementer) | Websted: ATG til Second mCherry codon GTG Kontrol: RBS til Second mCherry codon GTG |
Kilde |
| MS2_wt_d5 | 5 | acatgaggattacccatgt | atgcacatgaggattacccatgtcgtg | Gen9 Inc. |
| MS2_wt_d6 | 6 | acatgaggattacccatgt | atggcacatgaggattacccatgtgtg | Gen9 Inc. |
| MS2_wt_d8 | 8 | acatgaggattacccatgt | atggcgcacatgaggattacccatgt cgtg |
Gen9 Inc. |
| MS2_wt_d9 | 9 | acatgaggattacccatgt | atggcgccacatgaggattacccatg var |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) C_d8 | 8 | acatgaggatcacccatgt | atgcacatgaggatcacccatgtgg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) C_d9 | 9 | acatgaggatcacccatgt | atggcacatgaggatcacccatgtg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) C_d8 | 8 | acatgaggatgacccatgt | atgcacatgaggatgacccatgtgg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) G_d9 | 9 | acatgaggatgacccatgt | atggcacatgaggatgacccatgtg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_struct_d9 | 9 | cacaagaggttcacttatg | atggccacaagaggttcacttatgg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_struct_d8 | 8 | cacaagaggttcacttatg | atgccacaagaggttcacttatggg Tg |
Gen9 Inc. |
| PP7wt_d5' | 5 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgctaaggagtttatatggaaacc cttacgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7wt_d6' | 6 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgaataaggagtttatatggaaac ccttagtg |
Twist Bioscience |
| PP7wt_d8' | 8 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgaacataaggagtttatatggaa acccttacgtg |
Twist Bioscience |
| PP7wt_d9' | 9 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgaacaataaggagtttatatgga aacccttagtg |
Twist Bioscience |
| PP7_USLSBm_d6 | 6 | taaccgctttatatggaaagggtta | atggctaaccgctttatatggaaag ggttagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_USLSBm_d15 | 15 | taaccgctttatatggaaagggtta | atgggcgccggcgctaaccgcttta tatggaaagggttagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_nB_d5 | 5 | taagggtttatatggaaaccctta | atgctaagggtttatatggaaaccc ttagcgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_nB_d6 | 6 | taagggtttatatggaaaccctta | atggctaagggtttatatggaaacc cttatgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_USs_d5 | 5 | taaggagttatatggaaccctta | atgctaaggagttatatggaaccct tagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_USs_d6 | 6 | taaggagttatatggaaccctta | atggctaaggagttatatggaaccc ttagcgtg |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d1 | - | - | ttaaagaggagaaaggtacccatgg Tg |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d4 | - | - | ttaaagaggagaaaggtacccatgg gcgtg |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d10 | - | - | ttaaagaggagaaaggtacccatgg gcgccggcgtg |
Gen9 Inc. |
| Sequencing primer til binding af side kassetter | gcatttttatccataagattagcgg | Idt | ||
| Sequencing primer til RBP kassetter | gcggcgctgggtctcatctaataa | Idt | ||
Tabel 1: bindingssteder og sekventering primere. Sekvenser for de bindende steder og bindende side kassetter, der anvendes i dette studie, samt primere for de sekvensningsreaktioner, som er beskrevet i protokollen (trin 1.2.5.1 og 1.3.3).
| RBP navn i dette arbejde | kilde organismens navn, protein | kilde organisme gen | kilde organisme refseq | WT AA SEQ | ændringer fra WT (og referencer) | anvendt i dette arbejde | NT SEQ anvendt i dette arbejde |
| Mcp | Escherichia virus MS2 | Cp | NC_001417.2 | MASNFTQFVLV DNGGTGDVTV APSNFANGVA EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI KVEVPKVatqt VGGVELPVA AWRSYLNMEL TIPIFATNSD CELIVKAMQG LLKDGNPIPS AIAANSGIY |
DELF-G 1 V29I [1] taget fra addgene plasmid 27121 |
MASNFTQFVLV DNGGTGDVTV APSNFANGIA EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI KVEVPKG AWRSYLNMEL TIPIFATNSD CELIVKAMQG LLKDGNPIPS AIAANSGIY |
ATGGCTTCTA ACTTTACTCA GTTCGTTCTC GTCGACAATG GCGGAACTGG CGACGTGACT GTCGCCCCAA GCAACTTCGC TAACGGGATC GCTGAATGGA TCAGCTCTAA CTCGCGTTCA CAGGCTTACA AAGTAACCTG TAGCGTTCGT CAGAGCTCTG CGCAGAATCG CAAATACACC ATCAAAGTCG AGGTGCCTAA AGGCGCCTGG CGTTCGTACT TAAATATGGA ACTAACCATT CCAATTTTCG CCACGAATTC CGACTGCGAG CTTATTGTTA AGGCAATGCA AGGTCTCCTA AAAGATGGAA ACCCGATTCC CTCAGCAATC GCAGCAAACT CCGGCATCTAC |
| Pcp | Pseudomonas fagtypning PP7 | Cp | NC_001628.1 | MSKTIVLSVGEA TRTLTEIQST ADRQIFEEKV GPLVGRLRLT ASLRQNGAKT AYRVNLKLDQ ADVVDCstsvc GElpkvrytq VWSHDVTIVA NSTEASRKSL YDLTKSLVAT SQVEDLVVNL VPLGR |
delF-G [2] taget fra addgene plasmid 40650 |
MLASKTIVLSVG EATRTLTEIQ STADRQIFEE KVGPLVGRLR LTASLRQNGA KTAYRVNLKL DQADVVDSG LPKVRYTQVW SHDVTIVANS TEASRKSLYD LTKSLVATSQ VEDLVVNLVP LGR |
ATGCTAGCCTC CAAAACCATC GTTCTTTCGG TCGGCGAGGC TACTCGCACT CTGACTGAGA TCCAGTCCAC CGCAGACCGT CAGATCTTCG AAGAGAAGGT CGGGCCTCTG GTGGGTCGGC TGCGCCTCAC GGCTTCGCTC CGTCAAAACG GAGCCAAGAC CGCGTATCGC GTCAACCTAA AACTGGATCA GGCGGACGTC GTTGATTCCG GACTTCCGAA AGTGCGCTAC ACTCAGGTAT GGTCGCACGA CGTGACAATC GTTGCGAATA GCACCGAGGC CTCGCGCAAA TCGTTGTACG ATTTGACCAA GTCCCTCGTC GCGACCTCGC AGGTCGAAGA TCTTGTCGTC AACCTTGTGC CGCTGGGCCGT |
| Referencer: | |||||||
| 1. Peabody, D.S., Ely, K.R. kontrol af translationel undertrykkelse ved protein-protein interaktioner. Nukleinsyre forskning. 20 , stk. 7, 1649 – 1655 (1992). | |||||||
| 2. Chao, J.A., Patskovsky, Y., Almo, S.C., sanger, RH strukturelt grundlag for den coevolution af en viral RNA-protein kompleks. Natur strukturel &Amp; molekylær biologi. 15 , stk. 1, 103 – 105, Doi: 10.1038/nsmb1327 (2008) | |||||||
Tabel 2: RBP-sekvenser. Amino syre og nukleotidsekvenser af de pels proteiner, der anvendes i dette studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metode, der er beskrevet i denne artikel, letter kvantitativ in vivo-måling af RBP-RNA-bindingsaffinitet i E. coli -celler. Protokollen er forholdsvis let og kan gennemføres uden brug af sofistikerede maskiner, og dataanalyse er ligetil. Desuden, resultaterne er produceret straks, uden den relativt lange ventetid i forbindelse med næste generation sekventering (NGS) resultater.
En begrænsning til denne metode er, at det kun virker i bakterieceller. En tidligere undersøgelse12 har imidlertid vist en undertrykkelses effekt ved hjælp af en lignende fremgangsmåde for L7AE RBP i pattedyrsceller. En yderligere begrænsning af metoden er, at indsættelsen af bindingsstedet i mCherry-Initierings regionen kan undertrykke basal mCherry-niveauerne. Strukturel kompleksitet eller høj stabilitet af bindingsstedet kan interferere med ribosomale initiering selv i fravær af RBP, hvilket resulterer i nedsat mCherry basal niveauer. Hvis basal niveauerne er for lave, vil den yderligere undertrykkelse, der er anlagt ved stigende koncentrationer af RBP, ikke kunne observeres. I et sådant tilfælde er det bedst at designe indbindings stedets kassette med bindingsstedet stadig i Initierings området, men på randen af overgangen fra Initierings region til langdistance region (δ i intervallet 12 − 15 BP10,29). Vi har vist, at der for sådanne δ-værdier stadig kan iagttages en undertrykkelses effekt. For at øge chancerne for, at analysen vil arbejde, uanset strukturel kompleksitet, anbefaler vi at udføre analysen på mindst tre forskellige positioner for et givent bindingssted.
Den væsentligste ulempe ved metoden i forhold til in vitro-metoder, såsom EMSA, er, at RBP-RNA-bindings affiniteten ikke måles i absolutte enheder af RBP-koncentration, men snarere i form af fusion-RBP-fluorescens. Denne ulempe er et direkte resultat af in vivo-indstillingen, som begrænser vores evne til at oplæse de faktiske koncentrationer af RBP. Denne ulempe opvejes af fordelene ved at måle i in vivo-indstillingen. For eksempel har vi fundet forskelle i bindende tilhørsforhold ved sammenligning af resultater fra vores in vivo-analyse til tidligere in vitro-og in situ-analyser. Disse forskelle kan stamme fra uoverensstemmelser i strukturen af mRNA-molekyler in vivo, der opstår ud fra deres tilstedeværelse inde i cellerne10,11,30,31. Sådanne strukturelle forskelle kan føre til ændringer i de foldede staters stabilitet in vivo, som igen enten stabiliserer eller stabiliserer RBP-bindingen.
Da metoden er relativt enkel og billig, anbefaler vi at køre flere kontroller sammen med selve eksperimentet. Kører en negativ kontrol, dvs en sekvens, der ikke har affinitet til RBP endnu har lignende strukturelle funktioner, kan hjælpe med at undgå falske positiver stammer fra ikke-specifikke interaktioner med mRNA. I de viste repræsentative resultater var de to negative kontroller mCherry-genet alene (ingen bindingssted) og det andet RBP (dvs. PP7-WT for MCP og MS2-WT for PCP). Desuden foreslår vi, at der inkorporerer en positiv kontrol (f. eks. et RBP og dets indbindings sted). En sådan kontrol vil bidrage til at kvantificere den bindende affinitet ved at præsentere et referencepunkt og til at undgå falsk-negativer som følge af lav fold-undertrykkelse.
Endelig, for dem, der ønsker at opnå et strukturelt perspektiv af RBP-RNA binding, vi foreslår at udføre en selektiv 2 ′-hydroxyl acyleringen analyseret af primer forlængelse sekventering (form-SEQ)11,32,33 Eksperiment. SHAPE-SEQ er en NGS tilgang kombineret med kemisk sondering af RNA, som kan bruges til at estimere sekundær struktur af RNA samt RNA interaktioner med andre molekyler, såsom proteiner. I vores tidligere arbejde gennemførte vi en form-SEQ eksperiment på en repræsentativ stamme i både in vivo betingelser34 og in vitro med renset rekombinant protein10,35. I vores tilfælde afslørede resultaterne, at RBP-binding påvirkede et meget bredere segment af RNA end tidligere rapporteret for disse RBPs in vitro36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette projekt modtog støtte fra i-CORE-programmet i planlægnings-og budgetterings udvalget og Israels Science Foundation (Grant nr. 152/11), Marie Curie-reintegrations tilskuddet nr. PCIG11-GA-2012-321675 og fra den Europæiske Unions Horisont 2020-forsknings-og innovations program i henhold til tilskudsaftale nr. 664918-MRG-grammatik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8-lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| Glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| Incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| Ligase | NEB | B0202S | |
| Liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| Multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| Platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| Sodium Chloride (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
References
- Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).
- Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. Regulation of translation initiation by RNA binding proteins. Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).
- Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria. Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).
- Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).
- Bendak, K., et al. A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein. Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).
- Strein, C., Alleaume, A. -M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells. RNA. 20 (5), 721-731 (2014).
- Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
- Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
- Katz, N., et al. An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).
- Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Methods. 103, 34-48 (2016).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA. Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).
- Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
- Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
- Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein. Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- NEB. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions. , Available from: https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions (2018).
- Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol. , Available from: https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/ (2018).
- NEB. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202). , Available from: https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202 (2018).
- Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html (2018).
- NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit. , Available from: https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx (2018).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Addgene. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/ (2018).
- NEB. Making your own chemically competent cells. , Available from: https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells (2018).
- Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling. , Available from: https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation (2018).
- Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo. Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).
- Espah Borujeni, A., et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505, (2013).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486 (2015).
- Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq. Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).
- Bernardi, A., Spahr, P. -F. Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).
