Summary
इस विधि में, हम आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन (RBPs) की बाध्यकारी समानता को एक सरल, लाइव, रिपोर्टर परख का उपयोग करके एक सरल, लाइव, रिपोर्टर परख का उपयोग करने के लिए cognate और गैर-cognate बाध्यकारी साइटों के लिए परिमाणित. परख एक पत्रकार जीन के दमन पर आधारित है.
Abstract
प्रोटीन अनुवाद की दीक्षा चरण में, राइबोसोम MRNA के दीक्षा क्षेत्र के लिए बांधता है. अनुवाद दीक्षा MRNA के दीक्षा क्षेत्र के लिए एक आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन (RBP) के बंधन द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है, जो राइबोसोम बंधन के साथ हस्तक्षेप. प्रस्तुत विधि में, हम इस अवरुद्ध घटना का उपयोग करने के लिए उनके cognate और गैर cognate बाध्यकारी साइटों के लिए RBPs के बाध्यकारी संबंध मात्रा. ऐसा करने के लिए, हम एक पत्रकार MRNA के दीक्षा क्षेत्र में एक परीक्षण बाइंडिंग साइट डालने और परीक्षण RBP की अभिव्यक्ति प्रेरित. RBP-RNA बाइंडिंग के मामले में, हमने रिपोर्टर अभिव्यक्ति के एक सिग्मोइडल दमन को आरबीपी सांद्रता के एक समारोह के रूप में देखा। बाध्यकारी साइट और आरबीपी के बीच कोई आत्मीयता या बहुत कम आत्मीयता के मामले में, कोई महत्वपूर्ण दमन नहीं देखा गया था। विधि लाइव जीवाणु कोशिकाओं में किया जाता है, और महंगी या परिष्कृत मशीनरी की आवश्यकता नहीं है। यह विभिन्न RBPs है कि बैक्टीरिया में काम कर रहे हैं डिजाइन बाध्यकारी साइटों का एक सेट करने के लिए बाध्यकारी सजातीयता के बीच परिमाणीकरण और तुलना के लिए उपयोगी है. इस विधि उच्च संरचनात्मक जटिलता के साथ बाध्यकारी साइटों के लिए अनुपयुक्त हो सकता है. यह आरबीपी के अभाव में जटिल एमआरएनए संरचना द्वारा राइबोसोमल दीक्षा के दमन की संभावना के कारण है, जिसके परिणामस्वरूप कम बेसल रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति होगी, और इस प्रकार आरबीपी बाइंडिंग पर कम-देखने योग्य रिपोर्टर दमन होगा।
Introduction
आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन (आरबीपी) आधारित पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन, विशेष रूप से आरबीपी और आरएनए के बीच बातचीत की विशेषता, हाल के दशकों में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। आरबीपीएस से निकलने वाले बैक्टीरिया में अनुवादात्मक डाउन-विनियमन के कई उदाहरण हैं जो बाधा उत्पन्न करते हैं, या सीधे प्रतिस्पर्धा करते हैं, राइबोसोम बंधन1,2,3. संश् लेषित जीव विज्ञान के क्षेत्र में आरबीपी-आर.एन.ए. अन्तरक्रिया प्रतिलेखन-आधारित आनुवंशिक परिपथों4,5के डिजाइन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में उभर रहे हैं। इसलिए, एक सेलुलर संदर्भ में ऐसे आरबीपी-आरएनए इंटरैक्शन की विशेषता की मांग में वृद्धि हुई है।
प्रोटीन-आरएनए बातचीत के अध्ययन के लिए सबसे आम तरीके इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता पारी परख (EMSA)6, जो इन विट्रो सेटिंग्स में करने के लिए सीमित है, और विभिन्न पुल-डाउन परख7, CLIP विधि8सहित,9 . जबकि इस तरह के तरीकों de नोवो आरएनए बाध्यकारी साइटों की खोज सक्षम, वे इस तरह के श्रम गहन प्रोटोकॉल और महंगी गहरी अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं के रूप में कमियों से ग्रस्त हैं और RBP पुल-डाउन के लिए एक विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता हो सकती है. आरएनए की अतिसंवेदनशील प्रकृति के कारण, कई कारक RBP-RNA बातचीत को प्रभावित कर सकते हैं, सेलुलर संदर्भ में RBP-RNA बाध्यकारी पूछताछ के महत्व पर बल. उदाहरण के लिए, हमने और अन्य ने विवो में आरएनए संरचनाओं और विट्रो10,11में महत्वपूर्ण अंतरों का प्रदर्शन किया है।
एक पिछले अध्ययन12के दृष्टिकोण के आधार पर, हम हाल ही में10 का प्रदर्शन किया है कि जब बैक्टीरियोफेज GA13से capsid RBPs के लिए पूर्व डिजाइन बाध्यकारी साइटों रखने , MS214, PP715, और क्यू में16 एक पत्रकार MRNA के अनुवाद दीक्षा क्षेत्र, रिपोर्टर अभिव्यक्ति दृढ़ता से दमित है. हम एक अपेक्षाकृत सरल और मात्रात्मक विधि प्रस्तुत, इस दमन घटना के आधार पर, RBPs और उनके इसी आरएनए बाध्यकारी साइटके बीच संबंध को मापने के लिए vivo में.
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Protocol
1. सिस्टम तैयारी
- बाइंडिंग-साइट प्लाज्मिड का डिजाइन
- बाइंडिंग साइट कैसेट को चित्र 1में दर्शाए अनुसार डिजाइन करें। प्रत्येक minigene निम्नलिखित भागों में शामिल हैं (5' करने के लिए 3'): Eagl प्रतिबंध साइट, $ 40 kanamycin के अंत के 40 कुर्सियां (कान) प्रतिरोध जीन, pLac-Ara प्रमोटर, राइबोसोम बाइंडिंग साइट (आरबीएस), mcherry जीन के AUG, एक स्पेसर (जेड), एक R bindingBP साइट, 5' अंत के 80 कुर्सियां मचेरी जीन की, और एक ApaLI प्रतिबंध साइट.
नोट: परख की सफलता की दर में वृद्धि करने के लिए, प्रत्येक बाध्यकारी साइट के लिए तीन बाध्यकारी साइट कैसेट डिजाइन, कम से कम एक, दो, और तीन ठिकानों से मिलकर spacers के साथ. आगे के दिशानिर्देशों के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें.
- बाइंडिंग साइट कैसेट को चित्र 1में दर्शाए अनुसार डिजाइन करें। प्रत्येक minigene निम्नलिखित भागों में शामिल हैं (5' करने के लिए 3'): Eagl प्रतिबंध साइट, $ 40 kanamycin के अंत के 40 कुर्सियां (कान) प्रतिरोध जीन, pLac-Ara प्रमोटर, राइबोसोम बाइंडिंग साइट (आरबीएस), mcherry जीन के AUG, एक स्पेसर (जेड), एक R bindingBP साइट, 5' अंत के 80 कुर्सियां मचेरी जीन की, और एक ApaLI प्रतिबंध साइट.
- बाइंडिंग साइट प्लाज्मिड की क्लोनिंग
- बंधन-साइट कैसेट को डबल-स्लेंड ्ड डीएनए (डीएसडीए) मिनीजेनेस के रूप में ऑर्डर करें। प्रत्येक minigene है $ 500 बीपी लंबी है और एक Eagl प्रतिबंध साइट और एक ApaLI प्रतिबंध साइट पर शामिल 5' और 3' समाप्त होता है, क्रमशः (चरण 1.1.1 देखें).
नोट: इस प्रयोग में, कानामाइसिन जीन के आधे के साथ मिनी जीन सकारात्मक कालोनियों के लिए स्क्रीनिंग की सुविधा के लिए आदेश दिए गए थे. हालांकि, गिब्सन विधानसभा17 भी यहाँ उपयुक्त है, जो मामले में बाध्यकारी साइट दो छोटे पूरक एकल फैला डीएनए oligos के रूप में आदेश दिया जा सकता है. - प्रतिबंध प्रोटोकॉल18द्वारा एगल-एचएफ और ApaLI के साथ मिनी-जीन और लक्ष्य वेक्टर दोनों को डबल-पाच करें, और कॉलम शुद्ध19.
- बाइंडिंग-साइट बैकबोन के लिए पचे हुए मिनीजीनको लिगेट करें जिसमें बाकी मचेरी रिपोर्टर जीन, टर्मिनेटर और एक कानामीसिन प्रतिरोध जीन20शामिल हैं।
- एश्चिया कोली TOP10 कोशिकाओं21में लिगेशन समाधान रूपांतरण .
- Sanger अनुक्रमण के माध्यम से सकारात्मक transformants की पहचान.
- ब्याज के क्षेत्र के लिए ऊपर एक प्राइमर 100 कुर्सियां डिजाइन (प्राइमर दृश्यों के लिए तालिका 1 देखें).
- कुछ जीवाणु कालोनियों22को मिनिप्रीप करें।
- प्राइमर के 5 उम विलयन का 5 डिग्री सेल्सियस तथा 80 उधर् संकेन्द्रण पर डीएनए का 10 डिग्री सेल्सियस घोल तैयार की जा रही है।
- संगर अनुक्रमण23के लिए एक सुविधाजनक सुविधा के लिए दो समाधान भेजें .
- -20 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध प्लाज्मिड स्टोर करें, और ग्लिसरोल स्टॉक24के रूप में बैक्टीरियल उपभेदों, दोनों 96-वेल प्रारूप में। डीएनए तो ई. कोलाई TOP10 चार संलयन-RBP प्लाज्मिड में से एक युक्त कोशिकाओं में परिवर्तन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा (चरण 1.3.5 देखें).
- बंधन-साइट कैसेट को डबल-स्लेंड ्ड डीएनए (डीएसडीए) मिनीजेनेस के रूप में ऑर्डर करें। प्रत्येक minigene है $ 500 बीपी लंबी है और एक Eagl प्रतिबंध साइट और एक ApaLI प्रतिबंध साइट पर शामिल 5' और 3' समाप्त होता है, क्रमशः (चरण 1.1.1 देखें).
- डिजाइन और RBP प्लाज्मिड का निर्माण
नोट: इस अध्ययन में प्रयुक्त कोट प्रोटीनों के एमिनो अम्ल तथा न्यूक्लिओटाइड अनुक्रम सारणी 2में सूचीबद्ध हैं।- आदेश आवश्यक RBP अनुक्रम एक बंद codon के रूप में एक कस्टम आदेश dsDNA minigene एक बंद codon समाप्त होता है पर प्रतिबंध साइटों के साथ कमी की कमी (चित्र 1) आदेश .
- परीक्षण RBP एक रोक codon की कमी का क्लोन तुरंत एक inducable प्रमोटर के बहाव और एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के ऊपर एक शुरू codon की कमी (चित्र 1) कदम के समान 1.2.2-1.2.4. सुनिश्चित करें कि RBP प्लाज्मिड बाइंडिंग साइट प्लाज्मिड की तुलना में एक अलग एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन होता है।
- Sanger अनुक्रमण के माध्यम से सकारात्मक transformants की पहचान, कदम के समान 1.2.5 (प्राइमर दृश्यों के लिए तालिका 1 देखें).
- एक सकारात्मक रूपांतरक चुनें और इसे रासायनिक रूप से सक्षम25बनाएं। -20 डिग्री सेल्सियस पर ग्लिसरोल शुद्ध प्लाज्मिड के रूप में स्टोर करें और 96-वेल प्लेटों में -80 डिग्री सेल्सियस पर जीवाणु उपभेदों के ग्लिसरोल स्टॉक24।
- बाइंडिंग-साइट प्लाज्मिड (चरण 1.2.6 से) को 96-वेल प्लेटों में रासायनिक रूप से सक्षम जीवाणु कोशिकाओं में परिवर्तित करें जिसमें पहले से ही आरबीपी-एमसीरूलियन प्लाज्मिड21है। समय बचाने के लिए, पेट्री व्यंजन पर कोशिकाओं चढ़ाना के बजाय, उन्हें प्रासंगिक एंटीबायोटिक दवाओं (कान और Amp) के साथ Luria-Bertani (एलबी)26 agar युक्त 8 लेन प्लेटों पर एक 8-चैनल pipettor का उपयोग कर प्लेट। कालोनियों 16 एच में दिखाई देना चाहिए.
- प्रत्येक डबल ट्रांसफार्मर के लिए एक एकल कॉलोनी का चयन करें और प्रासंगिक एंटीबायोटिक दवाओं (कान और एम्प) के साथ एलबी माध्यम में रात भर बढ़ने और 96-वेल प्लेटों में -80 डिग्री सेल्सियस पर ग्लिसरोल स्टॉक24 के रूप में स्टोर करें।
2. प्रयोग सेटअप
नोट: यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक इनक्यूबेटर और एक प्लेट रीडर के साथ संयोजन में एक तरल हैंडलिंग रोबोट प्रणाली का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था. प्रत्येक माप प्रत्येक तनाव + प्रेरक संयोजन के लिए दो डुप्लिकेट के साथ, 24 inducer सांद्रता के लिए किया गया था. इस रोबोट प्रणाली का उपयोग करना, 24 inducer सांद्रता के साथ प्रति दिन 16 उपभेदों के लिए डेटा एकत्र किया गया था. हालांकि, अगर इस तरह के एक डिवाइस उपलब्ध नहीं है, या कम प्रयोगों आवश्यक हैं, इन आसानी से एक 8 चैनल मल्टी पिपेट का उपयोग कर हाथ से किया जा सकता है और तदनुसार प्रोटोकॉल अनुकूलन. उदाहरण के लिए, 12 प्रेरक सांद्रता और चार समय अंक के साथ प्रति दिन चार उपभेदों के लिए प्रारंभिक परिणाम इस तरह से प्राप्त किए गए थे.
- तैयारी, अग्रिम में, bioassay बफर के 1 एल (बीए) tryptone के 0.5 ग्राम, ग्लिसरोल के 0.3 एमएल, NaCl के 5.8 ग्राम, 1 M MgSO4के 50 एमएल, 10x फॉस्फेट-बफर saline (पीबीएस) बफर पीएच 7.4, और 950 mL ddd पानी के मिश्रण से। ऑटोक्लेव या बाँझ फिल्टर बीए बफर.
- उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ 1.5 एमएल एलबी में 37 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम मिलाते हुए डबल-ट्रांसफॉर्मेंट उपभेदों को बढ़ाएं (25 ग्राम/एमएल और एम्पसिलिन की अंतिम सांद्रता में 100 डिग्री/एमएल की अंतिम एकाग्रता में), 48-वेल प्लेटों में, रात भर की अवधि में,।
-
सुबह में, निम्नलिखित तैयारी करें.
- प्रेरक प्लेट. एक साफ 96-वेल प्लेट में, अर्द्ध गरीब माध्यम (एसपीएम) के साथ कुओं को तैयार करें जिसमें 95% बीए और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में 5% एलबी26 शामिल हैं। कुओं की संख्या प्रेरक सांद्रता की वांछित संख्या से मेल खाती है। Inducer प्लेट है कि उच्चतम inducer एकाग्रता (218 एनएम) शामिल होंगे में कुओं के लिए C4-HSL जोड़ें.
- रोबोट को 0 से 218 एनएम तक 23 कम सांद्रता में उच्चतम सांद्रता वाले प्रत्येक कुएं से मध्यम को क्रमिक रूप से पतला करने के लिए प्रोग्राम करें। प्रत्येक inducer कमजोर पड़ने की मात्रा सभी उपभेदों के लिए पर्याप्त होना चाहिए (डुप्लिकेट सहित).
- जबकि प्रेरक कमजोर पड़ने तैयार किया जा रहा है, गर्म 180 $L एसपीएम के इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर, 96 अच्छी प्लेटों में.
- कदम 2.2 से एक कारक द्वारा रात भर उपभेदों को पतला करें 100 सीरियल कमजोर पड़ने से: पहले 10 के एक कारक द्वारा पतला 48-वेल प्लेटों में एसपीएम के 900 डिग्री सेल्सियस के साथ बैक्टीरिया के 100 डिग्री सेल्सियस मिश्रण द्वारा पतला, और फिर में पतला समाधान से 20 डिग्री सेल्सियस लेने के द्वारा 10 के एक कारक द्वारा फिर से पतला फ्लोरोसेंट माप के लिए उपयुक्त 96-वेल प्लेटों में पूर्व-गर्म एसपीएम का 180 $L।
- अंतिम सांद्रता के अनुसार पतला उपभेदों के साथ 96-वेल प्लेटों में प्रेरक प्लेट से पतला प्रेरक जोड़ें।
- 6 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 96-वेल प्लेटों हिलाओ, जबकि 595 एनएम (ओडी595),mCherry (560 nm/612 एनएम) और mCerulean (460 nm/510 एनएम) एक प्लेट रीडर के माध्यम से हर 30 मिनट पर ऑप्टिकल घनत्व की माप ले रही है। सामान्यीकरण प्रयोजनों के लिए, कोई कोशिकाओं को जोड़ा के साथ एसएमपी के विकास को मापने।
3. प्रारंभिक परिणाम विश्लेषण
- प्रयोग के प्रत्येक दिन के लिए, रेखीय वृद्धि प्रावस्था तथा स्थिर (ट 0, त्अंतिम)के बीच मापे गए वृद्धि वक्रों के अनुसार लघुगणकीय वृद्धि का समय अंतराल चुनें। घातीय वृद्धि का पता लगाने की अशुद्धि से प्राप्त त्रुटि से बचने के लिए पहले और अंतिम माप को छोड़ते समय लगभग 6 "8 समय अंक लें (चित्र 2A,शीर्ष पैनल देखें).।
नोट: उन उपभेदों को छोड़ें जो असामान्य वृद्धि वक्रों या उपभेदों को दर्शाते हैं जहां लघुगणकीय वृद्धि चरण का पता नहीं लगाया जा सका और प्रयोग को दोहराया जा सका। -
प्रत्येक प्रेरक सांद्रता के लिए एम सीरूलियन और मक्की के उत्पादन की दर, मप्र के औसत सामान्यीकृत फ्लोरोसेंट की गणना कीजिए।
- निम्नानुसार सामान्यीकृत mCerulean की गणना करें:
जहाँ रिक्त (mCerulean) है mCerulean स्तर [a.u.] केवल माध्यम के लिए, रिक्त (OD) केवल माध्यम के लिए ऑप्टिकल घनत्व है, और mCerulean और OD हैं mCerulean फ्लोरिसेंस और ऑप्टिकल घनत्व मान, क्रमशः. - विभिन्न समय बिंदुओं पर औसत mCerulean (चित्र 2B, शीर्ष दो पैनलों) इस प्रकार है:
जहां #Time अंक खाते में लिया डेटा timepoints की संख्या है, टी0 समय है जिस पर घातीय विकास चरण शुरू होता है, और टीअंतिम समय है जिस पर घातीय विकास चरण समाप्त होता है। - उत्पादन की मचेरी दर की गणना करें (चित्र 2ख, नीचे दो पैनल) निम्नानुसार हैं:
जहां mCherry (t) mCherry स्तर है [a.u.] समय टी पर, OD ऑप्टिकल घनत्व मूल्य है, टी0 समय है जिस पर घातीय विकास चरण शुरू होता है, और टीअंतिम समय है जिस पर घातीय विकास चरण समाप्त होता है.
- निम्नानुसार सामान्यीकृत mCerulean की गणना करें:
- अंत में, mCerulean के एक समारोह के रूप में उत्पादन की mCherry दर साजिश, RBP-mCerulean संलयन फ्लोरोसेंट के एक समारोह के रूप में खुराक प्रतिक्रिया घटता बनाने (चित्र 2C). इस तरह के भूखंडों सेल में RBP उपस्थिति के एक समारोह के रूप में रिपोर्टर जीन के उत्पादन का प्रतिनिधित्व करते हैं.
4. खुराक प्रतिक्रिया समारोह फिटिंग दिनचर्या और KRBP निष्कर्षण
- इस धारणा के तहत कि RBP बाध्य के साथ अनुवाद की राइबोसोम दर स्थिर है, इस प्रकार है (चित्र 2D,हरी रेखा देखें):
जहाँ [x] सामान्यीकृत औसत mCerulean fluorscence है की गणना के अनुसार की जाती है 2. 2, mCherry उत्पादन दर मूल्य के अनुसार गणना की जाती है EQ. 3, KRBP सापेक्ष बाध्यकारी समानता है [a.u.], Kअसीमित की राइबोसोम दर है RBP के साथ अनुवाद असीमित, n cooperativity कारक है, और सी आधार फ्लोरोसेंट [a.u.] है. C, n,K असीमित, और KRBP mCherry उत्पादन दर डेटा मॉडल के लिए फिटिंग द्वारा पाए जाते हैं (EQ. 4). - डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, औसत mCerulean के एक समारोह के रूप में mChery उत्पादन दर चित्रण भूखंडों पर एक फिटिंग प्रक्रिया का संचालन (चरण 3.3), और EQ. 4 में सूत्र के अनुसार फिट पैरामीटर निकालने.
नोट: केवल R2 gt; 0.6 के साथ फिटिंग परिणाम खाते में लिया जाता है। उन फिट बैठता है के लिए, KRBP त्रुटि की सीमा में ज्यादातर है 0.5% करने के लिए 20% KRBP मूल्यों के लिए, एक 0.67 विश्वास अंतराल के लिए, जबकि उच्च KRBP त्रुटि के साथ उन भी आंख से सत्यापित किया जा सकता है. - प्रत्येक खुराक-प्रतिक्रिया फ़ंक्शन के लिए औसत mCerulean के संबंधित अधिकतम मान द्वाराK RBP मानों को सामान्य करें।
जहाँ KRBP में [a.u.] में फिटिंग प्रक्रिया से निकाले गए मूल्य है EQ. 4, और अधिकतम (औसत mCerulean) अधिकतम औसत mCerulean संकेत है [a.u] वर्तमान तनाव के लिए मनाया.
नोट: सामान्यीकरण विशेष अधिकतम RBP अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भरता को नष्ट करने से उपभेदों भर में नियामक प्रभाव की सही तुलना की सुविधा.
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Representative Results
प्रस्तुत विधि में एमआरएनए अणु के लिए बाध्य करने के लिए आरबीपी तथा राइबोसोम के बीच प्रतिस्पर्धा का उपयोग किया जाता है (चित्र 1)। यह प्रतियोगिता प्रेरक की बढ़ती सांद्रता के कारण आरबीपी-एमसीरूलियन के बढ़ते उत्पादन के एक समारोह के रूप में एम चेरी के स्तर को कम करके परिलक्षित होती है। एमसीरूलियन फ्लोरोसेंट में वृद्धि के मामले में, एम सी ई में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं होने के कारण, आरबीपी बाइंडिंग की कमी कम हो जाती है। सकारात्मक और नकारात्मक तनाव दोनों के लिए प्रतिनिधि परिणामचित्र 2में दर्शाया गया है । चित्र 2Aमें, OD, mCherry, और mCerulean चैनल चार घंटे की एक सीमा पर समय और inducer के एक समारोह के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, के साथ टी0 $ 1 ज और टीअंतिम ] 3.5 ज. चित्र 2खमें, औसत mCerulean फ्लोरोसेंट (ऊपर) और उत्पादन की mCherry दर (नीचे) inducer एकाग्रता के एक समारोह के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, दो उदाहरण उपभेदों के लिए. जैसा कि देखा जा सकता है, सकारात्मक विकृति के परिणाम उत्पादन की मक्की दर में स्पष्ट डाउन-नियामक प्रभाव प्रदर्शित करते हैं (चित्र 2ख,ब्), जो KRBP (चित्र 2D) के एक महत्वपूर्ण गैर-शून्य मान में तब्दील हो जाता है। धनात्मक विकृति के लिए उपयुक्त प्रक्रिया ने निम्नलिखित मान प्राप्त किए: KRBP ] 394.6 a.u., Kअनबाउंड ] 275.6, द $ 2.1, ब् ] 11.2 a.u., और R2 ] 0.93. अधिकतम mCerulean फ्लोरोसेंट द्वारा सामान्यीकरण के बाद, KRBP मूल्य 0.24 था. ऋणात्मक विकृति के लिए , विशिष्ट अनुक्रिया की कमी पाई गई (चित्र 2च) और कोई केआरबीपी मान निकाला गया (चित्र 2D) .
चित्रा 3में, हम MCherry MRNA के दीक्षा क्षेत्र के भीतर विभिन्न स्थानों पर, कई उत्परिवर्तित बाइंडिंग साइटों पर दो phage कोट RBPs, PP7 और MS2 के लिए इस परख के परिणाम प्रस्तुत करते हैं। परिणाम मोटे तौर पर प्रतिक्रियाओं के तीन प्रकार में वर्गीकृत कर रहे हैं (चित्र 3A):एक कम mCerulean स्तर पर एक नीचे नियामक प्रभाव का प्रदर्शन उपभेदों, एक कमK RBP मूल्य को दर्शाती है (उच्च बाध्यकारी संबंध); या तो मध्यवर्ती या उच्च mCerulean स्तर पर नीचे नियामक प्रभाव का प्रदर्शन तनाव, एक उच्चK RBP मूल्य को दर्शाती है (मध्यस्थ या कम आत्मीयता); और mCerulean के बढ़ते स्तर के लिए कोई विशिष्ट प्रतिक्रिया प्रदर्शित उपभेदों, सेल में अधिकतम RBP एकाग्रता से एक उच्चK RBP मूल्य को दर्शाती है (कोई पता लगाने योग्य बंधन समानता). चित्र 3B दो RBPs के सभी संयोजनों और विभिन्न पदों पर दस बाइंडिंग-साइट्स के आधार पर प्रत्येक RBP-बाध्यकारी-साइट संयोजन के लिए गणना न्यूनतमK RBP मान प्रस्तुत करता है। बाइंडिंग साइटों में एक नकारात्मक नियंत्रण (कोई बाइंडिंग साइट), गैर-मिलान बाइंडिंग साइटें, और एक सकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं - प्रत्येक RBP के लिए मूल बाइंडिंग साइट (PP7-wt PP7 कोट प्रोटीन [PCP] के लिए, और MS2-wt MS2 कोट प्रोटीन के लिए [MCP]). परिणाम भविष्यवाणियों से मेल खाते हैं, क्योंकि दोनों RBPs उनके सकारात्मक नियंत्रणों के लिए एक उच्च समानता प्रस्तुत करते हैं, और नकारात्मक नियंत्रणों के लिए एक गैर-डिटेक्टेबल बाइंडिंग एफ़िनिटी प्रस्तुत करते हैं. इसके अतिरिक्त, इन दो RBPs का उपयोग कर पिछले अध्ययन27,28 ने कहा है कि वे orthogonal हैं, जो स्पष्ट रूप से प्रस्तुत heatmap में व्यक्त किया है: दोनों MCP और पीसीपी अन्य RBP के मूल साइट बाँध नहीं है. इसके अलावा, उत्परिवर्तित बाइंडिंग साइटें अलग-अलग परिणाम प्रस्तुत करती हैं, जहां कुछ बाइंडिंग साइट्स ने मूल साइट जैसे PP7-mut-1, PP7-mut-2, और MS2-mut-3 के समान स्तर को प्रदर्शित किया, जबकि अन्य लोगों ने काफी कम आत्मीयता प्रदर्शित की, जैसे PP7-mut-3 और MS2-mut-2. इस प्रकार, परख RBPs के बाध्यकारी आत्मीयता के vivo माप में एक मात्रात्मक प्रस्तुत किया, परिणाम है कि इन RBPs के साथ पिछले प्रयोगों के उन लोगों के लिए तुलनीय हैं उपज.
चूंकि परख mCherry जीन के दमन पर आधारित है, एक व्यवहार्य mCherry संकेत की आवश्यकता है. इसलिए, जब बाध्यकारी साइट कैसेट डिजाइन, वहाँ दो डिजाइन नियमों को ध्यान में रखना है. सबसे पहले, मक्की का खुला पठन फ्रेम (ओआरएफ) रखा जाना चाहिए। चूंकि बाइंडिंग-साइट की लंबाई भिन्न हो सकती है, इसलिए इसे जीन में डालने से मूल एमचेरी ओआरएफ से एक या दो क्षारकों का विस्थापन हो सकता है। इसलिए, यदि आवश्यक हो (चित्र4A)तो बाइंडिंग साइट के नीचे एक या दो आधार सम्मिलित करें. उदाहरण के लिए, एक बाइंडिंग साइट जो 20-आधार लंबी है, जिसमें दो आधारों का एक $ है, एमचेरी जीन में 22 क्षारकों का योग होगा। ORF रखने के लिए, हम दो ठिकानों को जोड़ने की जरूरत है, 24 ठिकानों की कुल के लिए. दूसरा डिजाइन नियम mCherry ORF में रोक codons के सम्मिलन से बचने के लिए है. कुछ बाइंडिंग साइट्स, MS2-mut-2 (चित्र 4B,इनसेट) के रूप में, स्टॉप codons जब एक या अधिक तीन संभव ORFs में स्थित हो. इस तरह के एक उदाहरण चित्र 4Aमें सचित्र है, जहां बाइंडिंग साइट एक रोक codon कि mCherry ORF के साथ फ्रेम में है केवल जब कोई कुर्सियां जोड़ रहे हैं निहित है. जैसा कि उस स्थिति के लिए खुराक-प्रतिक्रिया वक्र में देखा जा सकता है (चित्र 4B), मचेरी उत्पादन दर अज्ञेय थी, इस प्रकार बंधन संबंध को मापा नहीं जा सकता था।
चित्र 4ठ पर एक निकट देखो दूरी के प्रभाव को दर्शाता है - mCherry उत्पादन पर. उदाहरण के लिए, उदाहरण के लिए, र् 4 के लिए बेसल उत्पादन दर छह से अधिक का एक कारक था $ 5 के लिए, एक उच्च गुना दमन प्रभाव सुनिश्चित करने. तथापि, $ 14 के लिए, आधारीय उत्पादन स्तर बहुत कम थे ताकि डाउन-नियामक प्रभाव का निरीक्षण किया जा सके।
चित्र 1: सिस्टम डिज़ाइन और क्लोनिंग चरणों का अवलोकन. बाध्यकारी साइट प्लाज्मिड (बाएं) और RBP-mCerulean प्लाज्मिड (दाएं) के लिए कैसेट डिजाइन की मिसाल. अगले कदम सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं में दोनों प्लाज्मिड के लगातार परिवर्तनों है, RBP प्लाज्मिड के साथ पहले. डबल-ट्रांसफॉर्मेंट तो inducer सांद्रता बढ़ाने में उनके mCherry अभिव्यक्ति के स्तर के लिए परीक्षण कर रहे हैं; यदि RBP बाइंडिंग साइट से बांधता है, तो mChery स्तर mCerulean (ग्रे बुलबुला) के एक समारोह के रूप में गिरावट. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: विश्लेषण योजना. (ए) तीन आयामी (3 डी) कच्चे ओडी स्तर (ऊपर), mCerulean फ्लोरोसेंट (मध्य) का चित्रण भूखंडों, और MCherry फ्लोरोसेंट (नीचे) समय और inducer एकाग्रता के एक समारोह के रूप में, एक सकारात्मक तनाव के लिए. (B) शीर्ष: प्रत्येक प्रेरक एकाग्रता के लिए mCerulean स्थिर राज्य अभिव्यक्ति स्तर संबंधित OD द्वारा प्रत्येक फ्लोरोसेंट स्तर विभाजित करके और दोनों सकारात्मक (बाएं) के लिए 2 $3 एच घातीय वृद्धि समय खिड़की में सभी मूल्यों पर औसत द्वारा गणना की है (बाएं) और नकारात्मक (दाएं) उपभेदों. बॉटम: मेचेरी उत्पादन दर को प्रेरण के बाद समय-बिंदु 2$3 एच के लिए EQ. 3 के अनुसार परिकलित किया जाता है। (ग) मचेरी उत्पादन दर को दो उपभेदों के लिए दो जैविक डुप्लिकेटों से अधिक औसत माध्य एम सीयूरूलियन फ्लोरोसेंट के एक समारोह के रूप में प्लॉट किया गया। त्रुटि सलाखों दोनों mCherry उत्पादन दर और औसत mCerulean फ्लोरोसेंट कम से कम दो प्रतिकृति से प्राप्त की मानक विचलन कर रहे हैं. (घ) केRBP के लिए फिट करें, एक विशिष्ट बाइंडिंग रिस्पॉन्स प्रदर्शित करने वाले धनात्मक विकृति (बाएं) के लिए दिखाया गया एक्यू. 4 में फिटिंग सूत्र का उपयोग करते हुए। नकारात्मक तनाव (दाएं) के लिए, कोई KRBP मान निकाला गया था। डेटा डुप्लिकेट में दिखाया गया है. यह आंकड़ा Katz एट अल10से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है. कॉपीराइट 2018 अमेरिकी रासायनिक सोसायटी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: प्रतिनिधि अंतिम परिणाम. (क) दो आरबीपी और विभिन्न स्थानों पर दस बाध्यकारी स्थलों के आधार पर तीस अलग-अलग उपभेदों के लिए सामान्यीकृत खुराक-प्रतिक्रिया वक्र। तीन प्रकार की प्रतिक्रियाएं देखी जाती हैं: उच्च आत्मीयता, कम आत्मीयता, और कोई आत्मीयता नहीं। (ख) पांच अलग-अलग बाइंडिंग साइट कैसेट (सूचीबद्ध) के साथ दो आरबीपी (एमसीपी और पीसीपी) के लिए मात्रात्मक केआरबीपी परिणाम। सभी RBP-बाध्यकारी-साइट उपभेदों डुप्लिकेट में मापा गया. यह आंकड़ा Katz एट अल10से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है. कॉपीराइट 2018 अमेरिकी रासायनिक सोसायटी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: उदाहरण डिजाइन और एक उत्परिवर्ती बाइंडिंग साइट के साथ MCP के लिए परिणाम. (क) चार अलग-अलग स्थानों में बाध्यकारी स्थल कैसेटों का डिजाइन चित्रण। राइबोसोम बाइंडिंग साइट सहित कैसेट, मची के लिए कोडोन शुरू करें, स्पेसर बेस, बाइंडिंग साइट का परीक्षण किया गया, ओआरएफ को बनाए रखने के लिए एक या दो कुर्सियां, और बाकी एमचेरी जीन। लाल सितारों एक बंद codon संकेत मिलता है. (बी) चार अलग-अलग स्थानों पर उत्परिवर्ती बाइंडिंग साइट के साथ एमसीपी के लिए खुराक-प्रतिक्रिया वक्र। इनसेट: परीक्षण उत्परिवर्तित बाइंडिंग साइट का अनुक्रम. प्रस्तुत परिणाम प्रत्येक तनाव के डुप्लिकेट के लिए कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| नाम | Binidng साइट स्थान, AUG में एक $ 1 | बाइंडिंग साइट अनुक्रम (नियंत्रण के लिए आरबीएस) | साइट: ATG करने के लिए दूसरी mCherry codon GTG नियंत्रण: आरबीएस दूसरे mCherry codon GTG करने के लिए |
स्रोत |
| MS2]wt]d5 | 5 | ऐकैटगाग्टकैकैट | एटगकाटगगटकैकटगगटग | Gen9 इंक |
| MS2[wt]d6 | 6 | ऐकैटगाग्टकैकैट | अटगकाटगगटकगटगटगगटग | Gen9 इंक |
| MS2[wt]d8 | 8 | ऐकैटगाग्टकैकैट | एटगग्काकाटगगटकैट्ट cgtg |
Gen9 इंक |
| MS2]wt]d9 | 9 | ऐकैटगाग्टकैकैट | एटगगकाकैटगगटकैटग टी.टी.जी. |
Gen9 इंक |
| MS2]U(-5)C$d8 | 8 | ऐकेटागाटकाकैट | एटगकाटगागाटगगग टीजी |
Gen9 इंक |
| MS2]U(-5)C$d9 | 9 | ऐकेटागाटकाकैट | अटगकाटगागटकाकटग टीजी |
Gen9 इंक |
| MS2]U(-5)C$d8 | 8 | ऐकेटागागाकैट | एटगकाटगागाटगगगगगगगगगगगगगगगगगगगटग टीजी |
Gen9 इंक |
| MS2]U(-5)G$d9 | 9 | ऐकेटागागाकैट | अटगकाटगागटगाकटगग टीजी |
Gen9 इंक |
| MS2[संरचना]d9 | 9 | काकागगटैक्टैक्टटग | ए.टी.जी.के.ए.गगगटैक्टैक्टटग टीजी |
Gen9 इंक |
| MS2[संरचना]d8 | 8 | काकागगटैक्टैक्टटग | एटजीकेकागगटैक्टैक्टटग टीजी |
Gen9 इंक |
| PP7wt[d5' | 5 | तागागटट्टाटगाआक्क्क्क्क्टा | एटजीकेटागागटटगगाक सी टी टैकगग |
Gen9 इंक |
| PP7wt[d6' | 6 | तागागटट्टाटगाआक्क्क्क्क्टा | अटगातागागटटगटगाआक ccttagtg |
ट्विस्ट बायोसाइंस |
| PP7wt$d8' | 8 | तागागटट्टाटगाआक्क्क्क्क्टा | एटगाकाटागागटटगा एक् क् टैक्ट् गग |
ट्विस्ट बायोसाइंस |
| PP7wt[d9' | 9 | तागागटट्टाटगाआक्क्क्क्क्टा | एटगाकाएटागागटटटग्गा ऐक्क्क्टगग |
ट्विस्ट बायोसाइंस |
| PP7[USLSBm]d6 | 6 | टैकगक्टटाटाटगागागगटा | ए.टी.जी.टी.सी.सी.टी.टी.टी.टी.ए.ए.ए. ggttagtg |
Gen9 इंक |
| PP7[USLSBm]d15 | 15 | टैकगक्टटाटाटगागागगटा | एटजीजीजीसीजीजीसीजीसीटाएक् कक् टाटा टाटगागागगटग |
Gen9 इंक |
| PP7[nB]d5 | 5 | तागगटतत्तगगाआक्क्क्क्टा | एटजीकेटागगटटगगाएक् सी टी.टी.जी.टी.जी.टी.जी. |
Gen9 इंक |
| PP7[nB]d6 | 6 | तागगटतत्तगगाआक्क्क्क्टा | ए.टी.जी.टी.ए.गगटटटगगाक सीटीटीजी |
Gen9 इंक |
| PP7[USs]d5 | 5 | तागागटटाटागक्क्क्टा | एटगस्टागागटटगकाक्क्ट टैग्टग |
Gen9 इंक |
| PP7[USs]d6 | 6 | तागागटटाटागक्क्क्टा | ऐटगक्टगागट्टाटगकासी टी.टी.जी.टी.जी.टी.जी. |
Gen9 इंक |
| No[BS]d1 | - | - | टागागागागट्टेकग टीजी |
Gen9 इंक |
| No[BS]d4 | - | - | टागागागागट्टेकग जी.सी.जी.टी.जी. |
Gen9 इंक |
| No[BS]d10 | - | - | टागागागागट्टेकग जीसीजीसीजीजीजीजी |
Gen9 इंक |
| बाध्यकारी साइट कैसेट के लिए समकारक प्राइमर | गगट्टाटागगटगग | Idt | ||
| आरबीपी कैसेट के लिए प्राइमर को अलग करना | जी.सी.जी.जी.जी.सी.टी.जी.टी.टी.टी.टी.टी.ए. | Idt | ||
तालिका 1: बाइंडिंग साइटों और अनुक्रमण प्राइमर. बाध्यकारी साइटों और बाध्यकारी साइट कैसेट इस अध्ययन में इस्तेमाल के लिए अनुक्रम, साथ ही प्रोटोकॉल में विस्तृत अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं के लिए प्राइमर (कदम 1.2.5.1 और 1.3.3).
| इस कार्य में RBP नाम | स्रोत जीव नाम, प्रोटीन | स्रोत जीव जीन | स्रोत जीव refseQ | डब्ल्यू टी आ सेक | wt (और संदर्भ) से परिवर्तन | aa सेक इस काम में इस्तेमाल किया | इस कार्य में प्रयुक्त एन टी सेक |
| Mcp | Escherichia वायरस MS2 | वाणिज्यिक पत्र | एनसीजेड 001417.2 | MASNFTQFVLVV DNGGTGDVTV एपीएसएएनएफंगवा EWISNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI केवीवीपीकेवैटक्यूटी वीजीजीवीएलपीवीए AWRSYLNMEL TIPIFATNSD CELIVKAMQG LLKDGNPIPS AIAANSGIY |
डेलएफ-जी [1] V29I [1] ऐडजीन प्लाज्मिड से लिया गया 27121 |
MASNFTQFVLVV DNGGTGDVTV एपीएसएएनएफजीए EWISNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI केवीवीपीकेजी AWRSYLNMEL TIPIFATNSD CELIVKAMQG LLKDGNPIPS AIAANSGIY |
ATGGCTTCTA ACTTTACTCA जी.टी.सी.टी.टी.सी. जी.टी.सी.जी.सी.ए.टी.जी. जीसीजीजीजीजी CGACGTGACT जी.टी.सी.सी.सी.सी.सी.सी.ए जीसीएसीटीसीसी TAACGGATC जीसीटीगाटगा TCAGCTAA सीसीसीसीजीटीसीए कैगजीसीटीए AAGTAACCTG TAGCGTTCGT CAGAGCTG सीजीएजीएएटीसीजी CAAATACACC ATCAAGTCG AGGTGCCTAA AGGCGCCTGG CGTTCGTACT TAAATGGA ACTAACCATT सीसीएएटीटीसीजी सीसीसीएजीएटीसी CGACTGCGAG CTATGTTA AGGCAATGCA एगसीटीसीटीटीए AAAGATGGAA ACCCGATTCC सीटीसीएएटीसी जी.सी.ए.सी.ए.सी. CCGGCATTAC |
| Pcp | Peudomonas phage PP7 | वाणिज्यिक पत्र | एनसीजेड 001628.1 | एमएसकेटीवीएलएसवीजीईए TRTLTEIQST ADRQIFEEKV जीपीएलवीजीआरएलएलटी ASLRQNGAKT AYRVNLKLDQ एडीवीडीसीएसटीएससीसी जीईLPKVRYTQ VWSHDVTIVA एनएसईएएसआरकेएसएल YDLTKSLVAT SQVEDLVVNL वीपीएलजीआर |
delF-जी [2] ऐडजीन प्लाज़्मिड 40650 से लिया गया |
MLASKTIVLSVG EATRTLTEIQ STADRQIFEI केवीजीपीएलवीजीआरआरआर LTASLRQNGA KTAYRVNLKL DQADVVDएसजी LPKVRYTQVW SHDVTIVANS TEASRKSLYD एलटीकेएसएलवीएटीक्यू VEDLVVNLVP एलजीआर |
ATGCTAGCCTC CAAAACCATC GTTCTCGG TCGGCGAGGC TACTCGCACT CTGACTGAGA टीसीएजीजीटीसीएसी सीजीएजीएसीजीटी कैगसीटीसीजी AAggaGAGT CGGGCCTCTG जी.टी.जी.जी.टी.सी.जी.सी.जी टीजीसीसीसीएसी जीजीसीटीसीटीसी CGTCAAAACG GAGCCAAGAC CGCGTATCGC जी.टी.सी.ए.टी.ए. AACTGGATCA जीजीसीजीजीजीटीसी GTTGATCCG GACTTCCGAA AGTGCGCTAC ACTCAGGTAT जीजीटीसीसीसीगा CGTGACAATC GTTGCGAATA जीसीएसीसीजीसी सीसीजीसीजीसीएए टीसीजीटीजीटीसीजी ATTTGACCAA जी.टी.सी.सी.सी.सी.सी.टी.सी जीसीजीएसीसीटीसीसीसीसी AGGTCGA टी.सी.टी.टी.सी.टी.सी.टी. AACCTTGTGC सीजीसीटीजीजीसीसीटी |
| संदर्भ: | |||||||
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| 2. चाओ, जे.ए., Patskovsky, Y., Almo, S.C., गायक, R.H. एक वायरल आरएनए प्रोटीन परिसर के सहविकास के लिए संरचनात्मक आधार. प्रकृति संरचनात्मक और आण्विक जीव विज्ञान| 15 (1), 103-105, डोई: 10.1038/ | |||||||
तालिका 2: आरबीपी अनुक्रम. इस अध्ययन में प्रयुक्त कोट प्रोटीन के एमिनो एसिड और न्यूक्लिओटाइड अनुक्रम।
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Discussion
इस अनुच्छेद में वर्णित विधि ई. कोलाई कोशिकाओं में आरबीपी-आरएनए बंधनात्मक संबंध के विवो माप में मात्रात्मक की सुविधा प्रदान करती है। प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत आसान है और परिष्कृत मशीनरी के उपयोग के बिना आयोजित किया जा सकता है, और डेटा विश्लेषण सीधा है. इसके अलावा, परिणाम तुरंत उत्पादन कर रहे हैं, अपेक्षाकृत लंबे समय तक प्रतीक्षा समय अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) परिणामों के साथ जुड़े बिना.
इस विधि के लिए एक सीमा यह है कि यह केवल जीवाणु कोशिकाओं में काम करता है. हालांकि, एक पिछले अध्ययन12 स्तनधारी कोशिकाओं में L7AE RBP के लिए एक समान दृष्टिकोण का उपयोग कर एक दमन प्रभाव का प्रदर्शन किया है. विधि का एक अतिरिक्त सीमा है कि mChery दीक्षा क्षेत्र में बाइंडिंग साइट की प्रविष्टि बेसल mCherry स्तर दबा सकता है. संरचनात्मक जटिलता या बाइंडिंग साइट की उच्च स्थिरता RBP के अभाव में भी राइबोसोमल दीक्षा के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप कम mCherry बेसल स्तर में कमी आई है। यदि आधार स्तर बहुत कम है, तो आरबीपी की सांद्रता में वृद्धि करके अतिरिक्त दमन को प्रेक्षणीय नहीं माना जाएगा। ऐसे मामले में, यह सबसे अच्छा है बाध्यकारी साइट के साथ कैसेट डिजाइन करने के लिए अभी भी दीक्षा क्षेत्र में, लेकिन दीक्षा क्षेत्र से दीर्घीकरण क्षेत्र के लिए संक्रमण के कगार पर ($ 12 की सीमा में 12 डिग्री 15 बीपी10,29). हमने दिखाया है कि ऐसे मूल्यों के लिए एक दमन प्रभाव अभी भी देखा जा सकता है. संभावना है कि परख काम करेंगे बढ़ाने के लिए, संरचनात्मक जटिलता की परवाह किए बिना, हम एक दिया बाध्यकारी साइट के लिए कम से कम तीन अलग अलग पदों पर परख प्रदर्शन सलाह.
इन विट्रो विधियों की तुलना में विधि का मुख्य नुकसान, जैसे कि ईएमएसए, यह है कि आरबीपी-आरएनए बाध्यकारी आत्मीयता आरबीपी एकाग्रता की निरपेक्ष इकाइयों में नहीं मापी जाती है, बल्कि संलयन-आरपीपी फ्लोरोसेंट के संदर्भ में। यह नुकसान में vivo सेटिंग का एक सीधा परिणाम है, जो हमारे RBP की वास्तविक सांद्रता बाहर पढ़ने की क्षमता को सीमित करता है. इस नुकसान में vivo सेटिंग में मापने के लाभों से ऑफसेट है. उदाहरण के लिए, हम संबंध संबंध में मतभेद पाया है जब हमारे vivo परख में से पिछले इन विट्रो में और situ assays से परिणामों की तुलना. ये अंतर विवो में एम आर एन ए अणुओं की संरचना में विसंगतियों से उत्पन्न हो सकते हैं जो कोशिकाओं के अंदर उनकी उपस्थिति से उत्पन्न होते हैं10,11,30,31. इस तरह के संरचनात्मक मतभेदों से विवो में मुड़े हुए राज्यों की स्थिरता में परिवर्तन हो सकता है, जो बदले में, या तो स्थिर या आरबीपी बाइंडिंग को कम कर सकता है।
चूंकि विधि अपेक्षाकृत सरल और सस्ती है, हम वास्तविक प्रयोग के साथ कई नियंत्रण चलाने की सलाह देते हैं. एक नकारात्मक नियंत्रण चल रहा है, यानी, एक दृश्य है कि RBP के लिए कोई संबंध नहीं है अभी तक इसी तरह की संरचनात्मक विशेषताएं हैं, गलत सकारात्मक MRNA के साथ गैर विशिष्ट बातचीत से स्टेमिंग से बचने में मदद कर सकते हैं. दिखाए गए प्रतिनिधि परिणामों में, दो नकारात्मक नियंत्रण अकेले mCherry जीन थे (कोई बाध्यकारी साइट), और अन्य RBP के मूल बाइंडिंग साइट (यानी, PP7-wt MCP के लिए और MS2-wt PCP के लिए). इसके अलावा, हम एक सकारात्मक नियंत्रण को शामिल करने का प्रस्ताव (जैसे एक RBP और उसके मूल बंधन साइट के रूप में). इस तरह के एक नियंत्रण एक संदर्भ बिंदु पेश करके बाध्यकारी संबंध मात्रा निर्धारित करने में मदद मिलेगी, और कम गुना दमन से उपजी झूठी नकारात्मक से बचने में.
अंत में, जो लोग RBP-RNA बाइंडिंग के संरचनात्मक परिप्रेक्ष्य प्राप्त करना चाहते हैं, हम प्राइमर एक्सटेंशन अनुक्रमण (SHAPE-SeQ)11,32,33 द्वारा विश्लेषण किए गए एक चयनात्मक 2"-hydroxyl acylation बाहर ले जाने का प्रस्ताव प्रयोग. SHAPE-सेक आरएनए की रासायनिक जांच के साथ संयुक्त एक NGS दृष्टिकोण है, जो आरएनए की माध्यमिक संरचना का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और साथ ही अन्य अणुओं के साथ आरएनए बातचीत, जैसे प्रोटीन. हमारे पिछले काम में हम दोनों vivo स्थितियों में एक प्रतिनिधि तनाव पर एक SHAPE-सेक प्रयोग किया34 और इन विट्रो में शुद्ध पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ10,35. हमारे मामले में, परिणामों से पता चला है कि RBP बाध्यकारी आरएनए का एक बहुत व्यापक खंड प्रभावित से पहले इन RBPs के लिए इन इन RbPs के लिए इन विट्रो36में रिपोर्ट की तुलना में.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस परियोजना की योजना और बजट समिति और इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (ग्रेंट नंबर 152/11), मैरी क्यूरी पुन: एकीकरण अनुदान No. के आई-कोर कार्यक्रम से धन प्राप्त किया। PCIG11-GA- 2012-321675, और अनुदान समझौते के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से संख्या 664918 - MRG-Grammar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8-lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| Glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| Incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| Ligase | NEB | B0202S | |
| Liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| Multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| Platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| Sodium Chloride (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
References
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