Summary
この方法では、細菌細胞における簡潔な生きたレポーターアッセイを用いて、RNA結合タンパク質(RBP)の結合親和性を、簡潔で生きたレポーターアッセイを用いて認知および非認知結合部位に定量する。アッセイはレポーター遺伝子の抑圧に基づいています。
Abstract
タンパク質翻訳の開始ステップでは、リボソームはmRNAの開始領域に結合する。翻訳開始は、リボソーム結合を妨げるmRNAの開始領域へのRNA結合タンパク質(RBP)の結合によって遮断されうる。提示された方法では、このブロッキング現象を利用して、その認知部位および非認知結合部位に対するRBPの結合親和性を定量化する。これを行うには、レポーターmRNAの開始領域に試験結合部位を挿入し、試験RBPの発現を誘導する。RBP-RNA結合の場合、RBP濃度の関数としてレポーター発現のシグモイド式の抑圧を観察した。結合部位とRBPとの間に親和性がないか、または非常に低い親和性の場合、有意な抑圧は認められなかった。この方法は、生きた細菌細胞で行われ、高価な機械や洗練された機械を必要としません。これは、細菌で機能する異なるBRBの結合親和性を、設計された結合部位のセットと定量化し、比較するのに有用である。この方法は、構造の複雑度が高い部位をバインドする場合には不適切な場合があります。これは、RBPが存在しない場合に複雑なmRNA構造によるリボソーム開始の抑圧の可能性に起因し、これは基底レポーター遺伝子発現を低下させ、したがってRBP結合時に観察可能なレポーターの抑圧をもたらす。
Introduction
RNA結合タンパク質(RBP)ベースの転写後調節、特にRBPとRNAとの相互作用の特徴付けは、ここ数十年で広範囲に研究されている。RbP阻害に起因する細菌における翻訳下調節の複数の例があり、または直接競合する、リボソーム結合1、2、3。合成生物学の分野では、RBP-RNA相互作用は転写ベースの遺伝回路4、5の設計のための重要なツールとして出現している。従って、このようなRBP-RNA相互作用の特性化に対する需要が細胞コンテキスト内で増加している。
タンパク質-RNA相互作用を研究するための最も一般的な方法は、インビトロ設定に限定される電気泳動シフトアッセイ(EMSA)6、およびCLIP法8、9を含む様々なプルダウンアッセイ7である。.このような方法は、デノボRNA結合部位の発見を可能にする一方で、労働集約的なプロトコルや高価な深いシーケンシング反応などの欠点に苦しんでおり、RBPプルダウンに対する特定の抗体を必要とする場合があります。RNAがその環境に対して感受性を持つため、多くの因子がRBP-RNA相互作用に影響を与える可能性があり、細胞コンテキストにおけるRBP-RNA結合を調知することの重要性を強調する。例えば、我々と他の人は、インビボとインビトロ10、11におけるRNA構造の間に有意な差を示した。
以前の研究12のアプローチに基づいて、我々は最近、バクテリオファージGA 13、MS214、PP715、およびQβ16からカプシドRBP用に事前に設計された結合部位を配置する際に10を実証した。レポーターmRNAの翻訳開始領域は、レポーター表現が強く抑圧されている。この抑圧現象に基づいて比較的単純で定量的な方法を提示し、生体内のRBPと対応するRNA結合部位との間の親和性を測定する。
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Protocol
1. システムの準備
- 結合部位プラスミドの設計
- 図 1に示すように、バインディング サイト カセットを設計します。各ミニ遺伝子は、以下の部分(5'〜3'):Eagl制限部位、カナマイシン(Kan)耐性遺伝子の5'末端の40塩基、pLac-Araプロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、mCherry遺伝子のAUG、スペーサー(δ)、RBP結合部位、5'末端の80塩基を含むmCherry遺伝子、およびApaLI制限部位の。
注:アッセイの成功率を高めるために、各結合部位に対して3つの結合部位カセットを設計し、スペーサーは少なくとも1つ、2つ、および3つのベースで構成される。その他のガイドラインについては、「代表的な結果」セクションを参照してください。
- 図 1に示すように、バインディング サイト カセットを設計します。各ミニ遺伝子は、以下の部分(5'〜3'):Eagl制限部位、カナマイシン(Kan)耐性遺伝子の5'末端の40塩基、pLac-Araプロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、mCherry遺伝子のAUG、スペーサー(δ)、RBP結合部位、5'末端の80塩基を含むmCherry遺伝子、およびApaLI制限部位の。
- 結合部位プラスミドのクローニング
- 結合部位カセットを二本鎖DNA(dsDNA)ミニ遺伝子として注文します。各ミニ遺伝子は500bpの長さで、それぞれ5'と3'の端にEagl制限部位とApaLI制限部位が含まれています(ステップ1.1.1を参照)。
注:本実験では、カナマイシン遺伝子の半分を含むミニ遺伝子を、陽性コロニーのスクリーニングを容易にするよう命じた。しかしながら、ギブソンアセンブリ17もまた、ここで適しており、その場合、結合部位は2つのより短い相補的な一本鎖DNAオリゴとして発注することができる。 - 制限プロトコル18によりEagl-HFおよびApaLIを用いてミニ遺伝子と標的ベクターの両方を二重消化し、カラム精製19.
- 消化されたミニ遺伝子を、残りのmCherryレポーター遺伝子、ターミネーター、およびカナマイシン耐性遺伝子20を含む結合部位バックボーンにライゲートする。
- ライゲーション溶液を大腸菌TOP10細胞21に変換する。
- サンガーシーケンスを使用して正の形質転換体を識別します。
- 対象地域に上流のプライマー 100 基を設計します (プライマー シーケンスについては、表 1を参照してください)。
- ミニプレップいくつかの細菌のコロニー22.
- プライマーの5 mM溶液の5 μLと80 ng/μL濃度でDNAの10 μLを調出します。
- 2 つのソリューションをサンガー シーケンシング23の便利な施設に送信します。
- 精製プラスミドを-20°Cで貯蔵し、グリセロールストック24として細菌株を、いずれも96ウェル形式で保存する。DNAは、4つの融合RBPプラスミドのいずれかを含む大腸菌TOP10細胞への形質転換に使用されます(ステップ1.3.5参照)。
- 結合部位カセットを二本鎖DNA(dsDNA)ミニ遺伝子として注文します。各ミニ遺伝子は500bpの長さで、それぞれ5'と3'の端にEagl制限部位とApaLI制限部位が含まれています(ステップ1.1.1を参照)。
- RBPプラスミドの設計と建設
注:本研究で用いられるコートタンパク質のアミノ酸およびヌクレオチド配列は表2に記載されている。- 制限部位を持つストップコドンを欠くカスタムオーダーdsDNAミニジーンとしてストップコドンを欠いている必要なRBP配列を注文します(図1)。
- 試験済みのRBPを、誘導性プロモーターの直下流に停止コドンを欠き、開始コドンを欠く蛍光タンパク質の上流(図1)を、ステップ1.2.2-1.2.4と同様にクローンする。RBPプラスミドに結合部位プラスミドとは異なる抗生物質耐性遺伝子が含まれていることを確認してください。
- ステップ 1.2.5 と同様に、Sanger シーケンスを使用して正の変換体を識別します (プライマー シーケンスについては表 1を参照)。
- 1つの正の形質転換剤を選択し、それを化学的に有能な25にする。グリセロール精製プラスミドを-20°C、96ウェルプレートで-80°Cで-80°Cの細菌株24のグリセロールストックとして保存する。
- 96ウェルプレートに保存された結合部位プラスミド(ステップ1.2.6から)を、RBP-mCeruleanプラスミド21を既に含む化学的に有能な細菌細胞に変換する。時間を節約するために、ペトリ皿に細胞をめっきする代わりに、ルリア・ベルタニ(LB)26寒天を含む8レーンプレートに8チャンネルのピペッターを使用して、関連する抗生物質(カンとアンプ)を使用してプレートを付けます。コロニーは16時間で現れるはずです。
- 各二重形質転換剤に対して単一のコロニーを選択し、関連する抗生物質(カンおよびアンプ)とLB培地で一晩成長し、96ウェルプレートで-80°Cでグリセロールストック24として保存します。
2. 実験設定
注:ここで提示されるプロトコルは、インキュベーターおよびプレートリーダーと組み合わせて液体処理ロボットシステムを用いて行った。各測定は、24のインデューサー濃度について行い、各株+インデューサーの組み合わせに対して2つの複製を用いて行った。このロボットシステムを用いて、24のインデューサー濃度を有する1日あたり16株のデータを収集した。しかし、このようなデバイスが利用できない場合、または必要な実験が少ない場合は、8チャンネルのマルチピペットを使用して、それに応じてプロトコルを適応させることが容易に行えます。例えば、12インデューサー濃度と4つのタイムポイントを有する1日あたり4株の予備結果は、このように取得された。
- 調製は、予め、0.5gのトリプトン、0.3mLのグリセロール、5.8gのナクル、1M MgSO4の50mL、10倍リン酸緩衝生理食生(PBS)バッファーpH7.4、および950mLの二重蒸し水(DL)を混合して、1Lのバイオアッセイバッファー(BA)を調製する。オートクレーブまたは無菌フィルタBAバッファ。
- 適切な抗生物質(25μg/mLの最終濃度でカナマイシン、最終濃度100μg/mLでアンピシリン)を1.5mL LBで振る37°Cおよび250rpmで二重形質菌株を48ウェルプレートで、18時間(一晩)に成長させます。
-
午前中は、以下の準備をしてください。
- インデューサープレート。きれいな96ウェルプレートで、37°Cのインキュベーターで95%BAおよび5%LB26からなる半不良培地(SPM)で井戸を準備する。ウェルの数は、所望のインデューサー濃度の数に対応する。最高インデューサ濃度(218 nM)を含むインデューサープレートのウェルにC4-HSLを追加します。
- ロボットをプログラムして、最も高濃度の井戸のそれぞれから0~218 nMまでの23の低濃度に連続的に媒体を希釈します。各インデューサー希釈の体積は、すべての株(重複を含む)に対して十分である必要があります。
- インデューサ希釈剤が調製されている間、96ウェルプレートで37°CのインキュベーターでSPMの180 μLを温める。
- ステップ2.2から一晩の菌株を連続希釈で100倍に希釈:まず、100μLの細菌と48ウェルプレートの900μLのSPMを混合して10倍に希釈し、希釈液から20μLを取り込んで再び10倍に希釈する。蛍光測定に適した96ウェルプレートで、予め温められたSPMの180 μL。
- 最終濃度に応じて希釈株を用いて96ウェルプレートに誘導板から希釈インデューサを加加える。
- 595nm(OD 595)、mCherry(560 nm/612 nm)、mCerulean(460 nm/510 nm)の蛍光を30分毎にプレートリーダーで測定しながら、37°Cで96ウェルプレートを6時間振ります。正規化の目的で、細胞を追加しない SMP の増殖を測定します。
3. 予備結果分析
- 実験の各日について、測定された成長曲線に従って対数成長の時間間隔を選択し、線形成長相と静止期(T0,T最終)の間にする。指数成長検出の不正確さから生じた誤差を避けるために、最初と最後の測定値を破棄しながら、約 6-8 の時点を取ります (図 2A、トップパネルを参照)。
注:対数成長相が検出できなかった異常な成長曲線または株を示す株を破棄し、実験を繰り返します。 -
mCeruleanの平均正規化蛍光およびmCherryの産生速度を、各インデューサー濃度に対するmCeruleanおよびmCherry蛍光の両方の生データから算出する(図2A)。
- 正規化された mCerulean を次のように計算します。
ブランク(mCerulean)は中程度のみのmCeruleanレベル[a.u.]で、ブランク(OD)は中程度のみの光学密度であり、mCeruleanおよびODはそれぞれmCerulean蛍光および光学密度値である。 - 異なるタイムポイント(図2B、上2パネル)の平均mCeruleanは次のとおりです。
#Timeポイントは考慮されるデータタイムポイントの数であり、T0は指数成長フェーズが開始される時刻であり、T最終値は指数成長フェーズが終了する時刻です。 - 生産のmCherry率(図2B、下の2つのパネル)を次のように計算します。
ここで mCherry(t) は時間 t の mCherry レベル [a.u.] で、OD は光学密度値、T0は指数成長フェーズが始まる時刻であり、Tファイナルは指数成長フェーズが終了する時刻です。
- 正規化された mCerulean を次のように計算します。
- 最後に、mCeruleanの関数として生産のmCherry率をプロットし、RBP-mCerulean融合蛍光の関数として用量応答曲線を作成する(図2C)。このようなプロットは、細胞内のRBP存在の関数としてのレポーター遺伝子の産生を表す。
4. 線量応答機能フィッティングルーチンとKRBP抽出
- RBP バインドを持つリボソーム変換率が一定であることを前提として、mCherry の生産率を次のようにモデル化します (図 2D、緑色の線を参照)。
ここで[x]は、Eq.2に従って計算された正規化平均mCerulean蛍光であり、mCherry産生率はEq.3に従って計算された値であり、KRBPは相対結合親和性[a.u.]であり、Kアンバウンドはリボソーム率である。RBP非結合での変換、nは協調性因子であり、Cはベース蛍光[a.u.]である。C、n、K非連結、および KRBPは、mCherry 生産率データをモデルに適合することによって見つかります (Eq. 4)。 - データ解析ソフトウェアを用いて、平均mCerulean(ステップ3.3)の関数としてmCherry生産率を描写するプロットにフィッティング手順を行い、Eq.4の式に従って適合パラメータを抽出する。
注:R2 > 0.6 の適合結果のみが考慮されます。これらの適合については、KRBP誤差は主にKRBP値の0.5%~20%の範囲にあり、0.67信頼区間では、KRBP誤差が高い場合も目で確認できます。 - 各用量応答関数の平均mCeruleanのそれぞれの最大値によってKRBP値を正規化する。
ここで[a.u.]のKRBPはEq.4のフィッティング手順から抽出された値であり、最大値(平均mCerulean)は現在の株に対して観察される最大平均mCeruleanシグナル[a.u]です。
注:正規化は、特定の最大RBP発現レベルへの依存性を排除することにより、株間の調節効果の正しい比較を容易にする。
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Representative Results
提示された方法は、mRNA分子に結合するためのRBPとリボソームとの間の競争を利用する(図1)。この競争は、インデューサーの濃度の増加に起因するRBP-mCeruleanの生産増加の関数としてmCherryレベルを減少させることによって反映されます。mCerulean蛍光を増加させる場合、mCherryに有意な変化はなく、RBP結合の欠如が推測される。正と負のひずみの両方の代表的な結果を図 2に示します。図 2Aでは、OD チャネル、mCherry チャネル、および mCerulean チャネルは、T0 = 1 h および Tファイナル= 3.5 h で、4 時間の範囲にわたって時間とインデューサーの関数として表示されます。図2Bにおいて、平均mCerulean蛍光(上)およびmCherryの産生速度(下)は、2つの実施例株に対するインデューサー濃度の関数として提示される。ごく一見の結果として、陽性株の結果は、生産のmCherry率(図2B、C)における明確なダウンレギュレーション効果を示し、これはKRBP(図2D)の有意な非ゼロ値に変換する。正のひずみの場合、フィッティング手順では、KRBP = 394.6 a.u.、K非連結= 275.6、n = 2.1、C = 11.2 a.u.、および R2 = 0.93 という値が得られます。最大mCerulean蛍光による正規化後、KRBP値は0.24であった。負のひずみについては、明確な応答の欠如が観察され(図2C)、KRBP値は抽出されなかった(図2D)。
図3では、mCherry mRNAの開始領域内の異なる位置にあるいくつかの変異結合部位上の2つのファージコートRBP、PP7およびMS2に対するこのアッセイの結果を提示する。結果は、大きく3種類の応答に分類される(図3A):低いmCeruleanレベルで下調節効果を示す株は、低いKRBP値(高結合親和性)を反映する。高いKRBP値(中間または低親和性)を反映し、中間または高mCeruleanレベルでダウンレギュレータ効果を示す株。mCeruleanの上昇レベルに対して明確な応答を示さない株は、細胞内の最大RBP濃度よりも高いKRBP値を反映する(検出可能な結合親和性がない)。図 3Bは、2 つの RBP と異なる位置の 10 個のバインディング・サイトのすべての組み合わせに基づいて、RBP-バインディング・サイトの組み合わせごとに計算される最小 KRBP値を示しています。結合部位には、負対照(結合部位なし)、非一致結合部位、および陽性対照(各RBPのネイティブ結合部位(PP7コートタンパク質[PCP]のPP7-wt、およびMS2コートタンパク質[MCP]用MS2-wt)が含まれる。結果は、両方の RBP が正のコントロールに対して高い親和性を示し、負のコントロールに対して検出不可能な結合アフィニティを示すため、予測と一致します。さらに、これら2つのRbp27、28を用いた以前の研究では、それらが直交的であり、提示されたヒートマップで明らかに伝達される:MCPおよびPCPの両方が他のRBPのネイティブ部位を結合しない。さらに、変異型結合部位は様々な結果を示し、PP7-mut-1、PP7-mut-2、MS2-mut-3など、一部の結合部位はネイティブサイトと同様のレベルの親和性を示す一方で、他の結合部位は、以下のような有意に低い親和性を示した。PP7-mut-3およびMS2-mut-2。したがって、アッセイは、RBPの結合親和性の生体内測定において定量的に提示し、これらのRBPとの過去の実験と同等の結果をもたらした。
アッセイはmCherry遺伝子の抑圧に基づいているため、実行可能なmCherryシグナルが必要です。したがって、バインディング サイト カセットを設計する場合、2 つの設計規則に留意する必要があります。まず、mCherryの開いた読み取りフレーム(ORF)を保持する必要があります。結合部位の長さは異なる可能性があるため、遺伝子に挿入すると、元のmCherry ORFから1つまたは2つの塩基のシフトを引き起こす可能性があります。したがって、必要に応じて (図 4A)、バインド 部位に直下に 1 つまたは 2 つのベースを挿入します。例えば、20塩基長の結合部位は、2つの塩基のδを有し、mCherry遺伝子に22塩基の添加を得る。ORF を維持するには、合計 24 のベースに対して 2 つのベースを追加する必要があります。2 番目の設計規則は、ストップ コドンが mCherry ORF に挿入されないようにすることです。一部の結合部位は、MS2-mut-2(図 4B、インセット)として、3 つの可能な OrF のうちの 1 つ以上に配置された場合にストップ コドンを含む。このような例は図4Aに例示され、そこで結合部位は、ベースが追加されていない場合にのみmCherry ORFとフレーム内にあるストップコドンを含んでいた。その位置(図4B)に対する用量応答曲線に見られるように、mCherryの産生速度は検出できず、従って結合親和性を測定することができなかった。
図4Bを詳しく見ると、mCherry生産に対する間隔δの効果を示しています。例えばδ=4の場合、基底生産率はδ=5よりも6倍多く、折りたたみ抑圧効果が高い。しかし、δ = 14の場合、基底生産レベルが低すぎて、下方規制効果を観察できすぎました。
図 1: システム設計とクローン作成手順の概要。結合部プラスミド(左)及びRBP-mCeruleanプラスミド(右)のカセット設計の図。次のステップは、両方のプラスミドを有能な大腸菌細胞に連続的に変換し、最初にRBPプラスミドを用いる。二重形質転換剤は、インデューサー濃度の増加におけるmCherry発現レベルについてテストされます。RBPが結合部位に結合する場合、mCherryレベルはmCerulean(灰色のバブル)の関数として低下する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:解析スキーム。(A) 生のODレベル(上)、mCerulean蛍光(中央)、およびmCherry蛍光(下)を時間および誘導子濃度の関数として描写する3次元(3D)プロットは、陽性株に対する。(B) 上: 各インデューサー濃度のmCerulean定常状態発現レベルは、各蛍光レベルをそれぞれのODで割り、2−3時間指数成長時間枠内のすべての値を平均化することによって計算される(左)負の(右)株。下: mCherryの生産率は、誘導後のタイムポイント2-3hについてEq.3に従って計算した。(C) mCherryの産生速度は、2株に対して2つの生物学的重複を平均した平均mCerulean蛍光の関数としてプロットされた。誤差バーは、少なくとも2回の反復から得られたmCherry産生速度と平均mCerulean蛍光の両方の標準偏差である。(D)正のひずみについて示すEq.4のフィッティング式を用いてKRBPに適合し(左)、特定の結合応答を示す。負のひずみ(右)については、KRBP値は抽出されなかった。データは重複して表示されます。この図は、Katzら10の許可を受けて適応されています。著作権2018アメリカ化学会。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:代表的な最終結果。(A) 異なる場所の2つのRBPと10の結合部位に基づいて30の異なる株に対する正規化された用量応答曲線。高い親和性、低い親和性、および親和性の 3 種類の応答が観察されます。(B) 5つの異なる結合部位カセット(リスト)を持つ2つのRBP(MCPおよびPCP)に対する定量的KRBP結果。全てのRBP−結合部位株を複製して測定した。この図は、Katzら10の許可を受けて適応されています。著作権2018アメリカ化学会。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 変異結合部位を持つ MCP の設計と結果の例。(A) 4つの異なる場所に結合部カセットのデザイン図。リボソーム結合部位を含むカセットは、mCherry、δスペーサーベース、試験された結合部位、ORFを維持するための1つまたは2つの塩基、および残りのmCherry遺伝子に対するコドンを開始する。赤い星はストップコドンを示します。(B) 4つの異なる場所に変異結合部位を持つMCPの線量応答曲線。インセット:テストされた変異結合部位の配列。提示された結果は、各株の複製用です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 名前 | ビニドンサイトの場所、AUGのA = 1 | バインディング サイト シーケンス (コントロールの RBS) | サイト: ATG から 2 番目の mCherry コドン GTG コントロール: RBS から 2 番目の mCherry コドン GTG |
ソース |
| MS2_wt_d5 | 5 | アカタガッタッカツ | atgcacataggaggatcggtg | 株式会社ゲン9 |
| MS2_wt_d6 | 6 | アカタガッタッカツ | アッグカガガッタッカッグgtg | 株式会社ゲン9 |
| MS2_wt_d8 | 8 | アカタガッタッカツ | アッグスカッカガガッタッカッガット cgtg |
株式会社ゲン9 |
| MS2_wt_d9 | 9 | アカタガッタッカツ | アッグッカカカッガッタッカッカッカッカッキャッカッカッキャッカッキャッ tgtg |
株式会社ゲン9 |
| MS2_U(-5)C_d8 | 8 | アカタガッカッカッガット | アッカタカガッカッカッカッチャッグツッグ Tg |
株式会社ゲン9 |
| MS2_U(-5)C_d9 | 9 | アカタガッカッカッガット | アッグカガガッカッチャッチャッグ Tg |
株式会社ゲン9 |
| MS2_U(-5)C_d8 | 8 | アカッガガッカッガット | アッカタカッガガッガッカッカッグググググ Tg |
株式会社ゲン9 |
| MS2_U(-5)G_d9 | 9 | アカッガガッカッガット | アッグカガガガッカッガッグ Tg |
株式会社ゲン9 |
| MS2_構造体_d9 | 9 | カカガグットチャクタツ | アッサカアガグトチャクタッタッグ Tg |
株式会社ゲン9 |
| MS2_構造体_d8 | 8 | カカガグットチャクタツ | atgccacaagaggttttatggg Tg |
株式会社ゲン9 |
| PP7wt_d5' | 5 | タガグッタッタッタガアッチャッカッカッカッタ | アッグタガッタッタッタガアック cttacgtg |
株式会社ゲン9 |
| PP7wt_d6' | 6 | タガグッタッタッタガアッチャッカッカッカッタ | アガタガッタッタッタガーアック cctgtg |
ツイストバイオサイエンス |
| PP7wt_d8' | 8 | タガグッタッタッタガアッチャッカッカッカッタ | アガアガガッタッタッタガ アクタクグ |
ツイストバイオサイエンス |
| PP7wt_d9' | 9 | タガグッタッタッタガアッチャッカッカッカッタ | アッカアカターガッタッタッタッタッガ アクトタグ |
ツイストバイオサイエンス |
| PP7_USLSBm_d6 | 6 | タアッチェッタッタガアガアッガアッガッタ | アッグクタクッタッタアガアグ グッタグ |
株式会社ゲン9 |
| PP7_USLSBm_d15 | 15歳 | タアッチェッタッタガアガアッガアッガッタ | atgggcgcgctaacccttッタ タッガアグタグッタッグ |
株式会社ゲン9 |
| PP7_nB_d5 | 5 | タグッタッタッタガアッッカッカッカッカッタ | atgcaagggttatgaataaaccc タックググ |
株式会社ゲン9 |
| PP7_nB_d6 | 6 | タグッタッタッタガアッッカッカッカッカッタ | アッグタグッタッタガアッチ cttatgtg |
株式会社ゲン9 |
| PP7_USs_d5 | 5 | タガグッタッタガッカッカッカッカッタ | atgcaaggagtatatgaatgaaccct タグ |
株式会社ゲン9 |
| PP7_USs_d6 | 6 | タガグッタッタガッカッカッカッカッタ | アッグクタガグッタッタッガッガッチャッ タックググ |
株式会社ゲン9 |
| いいえ_BS_d1 | - | - | ターアガガガガグタックッグ Tg |
株式会社ゲン9 |
| いいえ_BS_d4 | - | - | ターアガガガガグタックッグ gcgtg |
株式会社ゲン9 |
| いいえ_BS_d10 | - | - | ターアガガガガグタックッグ gcgccggcgtg |
株式会社ゲン9 |
| 結合部カセットのシーケンシングプライマー | gcattttttttatataagattaggッグ | Idt | ||
| RBPカセットのシーケンシングプライマー | gcggcgctgggtctcatctaaaa | Idt | ||
表 1: バインディング サイトとシーケンス プライマー。本研究で使用される結合部位および結合部位カセットの配列、ならびにプロトコルで詳述されているシーケンシング反応のプライマー(ステップ1.2.5.1および1.3.3)。
| この作品の RBP 名 | ソース生物名, タンパク質 | ソース生物遺伝子 | ソース生物 refseq | wt aa seq | wt (および参照) からの変更 | この作品で使用されるaa seq | この作品で使用されるnt seq |
| Mcp | エシェリヒアウイルス MS2 | Cp | NC_001417.2 | マスンフトクフヴヴ DNGGTGDVTV APSNFANGVA エビスンスルク アイクVTCSVRQ サククルキティ KVEVPKバットク VGGVELPVA アウルシルンメル ティフィファトンズド セリフカムク ルクドグンピップス アイアアンジー |
デルフ-G[1] V29I [1] アジーンプラスミド 27121 から取られた |
マスンフトクフヴヴ DNGGTGDVTV APSNFANGIA エビスンスルク アイクVTCSVRQ サククルキティ KVEVPKG アウルシルンメル ティフィファトンズド セリフカムク ルクドグンピップス アイアアンジー |
アツクッタ アクテクタクカ GTTCGTCTC GTCGACAATG GCGGAACTGG CGACGTGACT GTCGCCAA GCAACTTCGC タグッグガッチ GCTGAATGGA TCAGCTCTAA CTCGCGTTCA カックタカ アグタアックツグ タグCGTTCGT カガグクト CGCAGAATCG カーアタック アトカアグトグCG アグトククタア アッググックツッグ CGTTCGTACT ターアツガ アクタクト CCAATTTCG カッカガアット CGACTGCGAG クッタッタ アッカアトカ アグトクッタ アアガガア アッカアット CTCAGCAATC グガカアクト CCGGCATCTAC |
| Pcp | シュードモナスファージPP7 | Cp | NC_001628.1 | MSKTIVLSVGEA トルテイクスト ADRQIFEEKV GPLVGRLRLT アスルクンガクト アーヴンクルクルドク アドヴドVSVC ゲLPKVRYTQ ヴウシュドヴティバ NSTEASRKSL イドルトクスルヴァット SQVEDLVVNL VPLGR |
デルフ-G [2] アジーンプラスミド 40650 から取られた |
ムラスクティヴルスVG EATRTLTEIQ スタドルキフィー KVGPLVGRLR ルタスルクンガ KTAYRVNLKL DQADVVDSG LPKVRYTQVW シュドヴィヴァンス ティーズルクリド LTKSLVATSQ ヴェドルヴンルンVP LGR |
アトグタグック CAAAACCC GTTCTTCGG TCGGCGAGGC タクトククタクト CTGACTGAGA TCCAGTC CGCAGACCGT カガトクトCG アガガグット CGGGCCTCTG GTGGGTCGGC TGCGCCTCAC グクトククツ CGTCAAAACG ガッカアガック CGCGTATCGC GTCAACCTAA アクトガッカ グッガクツ GTTGATTCCG ガクトッカア アググックタック アクカグタット グットCGカッガ CGTGACAATC GTTGCGAATA GCACCGAGGC CTCGCGCAAA TCGTTGTACG アットガッカア GTCCCTCGTC GCGACCTCGC アグトCGAアガ TCTGTCGTC AACCTTGTGC CGCTGGGCCGT |
| 参照： | |||||||
| 1.ピーボディ、D.S.、Ely、K.R.タンパク質相互作用による翻訳抑制の制御核酸研究.20 (7), 1649-1655 (1992) | |||||||
| 2. チャオ,J.A., パツコフスキー, Y., アルモ, S.C., 歌手, R.H. ウイルスRNAタンパク質複合体の共進化のための構造的基礎.自然構造・分子生物学15 (1), 103-105, doi: 10.1038/nsmb1327 (2008) | |||||||
表 2:RBP シーケンス。本研究で用いられるコートタンパク質のアミノ酸およびヌクレオチド配列。
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Discussion
本稿に記載の方法は、大腸菌細胞におけるRBP-RNA結合親和性の生体内測定を容易にする。プロトコルは比較的簡単で、高度な機械を使用せずに行うことができ、データ分析は簡単です。さらに、結果は、次世代シーケンシング(NGS)結果に関連する比較的長い待ち時間なしで、すぐに生成されます。
この方法の 1 つの制限は、細菌細胞でのみ動作することです。.しかしながら、以前の研究12は、哺乳動物細胞におけるL7AE RBPに対する同様のアプローチを用いて抑圧効果を実証している。この方法の追加の制限は、mCherry開始領域における結合部位の挿入が基底mCherryレベルを抑圧しうる点である。結合部位の構造的複雑さまたは高い安定性は、RBPが存在しない場合でもリボソーム開始を妨げることができ、その結果mCherry基底レベルが低下する。基底レベルが低すぎる場合、RBPの濃度を増加させることによってもたらされる追加の抑圧は観察できません。このような場合には、開始領域にまだ結合部位を持つ結合部位カセットを設計するのが最善であるが、開始領域から伸長領域への移行の寸前(δは12−15 bp10、29の範囲)である。このようなδ値に対しては、抑圧効果がまだ観察できることを示した。構造的な複雑さにかかわらず、アッセイが機能する可能性を高めるために、特定の結合部位に対して少なくとも3つの異なる位置でアッセイを実行することをお勧めします。
EMSAのようなインビトロ法と比較してこの方法の主な欠点は、RBP-RNA結合親和性がRBP濃度の絶対単位ではなく、むしろ融合-RBP蛍光の観点から測定される点である。この欠点は、RBPの実際の濃度を読み取る能力を制限するインビボ設定の直接的な結果です。この欠点は、インビボ設定で測定する利点によって相殺されます。例えば、インビボアッセイの結果をインビトロとインビトウアッセイとインシッツアッセイで比較すると、結合親和性に違いが見つかりました。これらの相違は、細胞10、11、30、31内の存在から出現する生体内のmRNA分子の構造の不一致に起因しうる。このような構造的な違いは、生体内の折り畳まれた状態の安定性の変化を引き起こし、順番に、RBP結合を安定化または不安定化させる。
この方法は比較的簡単で安価であるため、実際の実験と一緒に複数のコントロールを実行することをお勧めします。否定的な対照、すなわち、RBPとの親和性を有しない配列を実行することは、同様の構造的特徴を有し、mRNAとの非特異的相互作用に起因する偽陽性を回避するのに役立つ。示された代表的な結果では、2つの陰性対照はmCherry遺伝子単独(結合部位なし)、および他のRBPのネイティブ結合部位(すなわち、MCPのPP7-wtおよびPCP用MS2-wt)であった。さらに,肯定的な制御(RBPとそのネイティブ結合部位など)を組み込むことを提案する。このようなコントロールは、基準点を提示することによって結合親和性を定量化し、低い折りたたみ抑制に起因する偽陰性を回避するのに役立ちます。
最後に、RBP-RNA結合の構造的な視点を得たい人のために、プライマー延長シーケンシング(SHAPE-Seq)11、32、33によって分析された選択的2'-ヒドロキシルアシレーションを行うことを提案する。実験。SHAPE-Seqは、RNAの化学的プローブと組み合わせたNGSアプローチであり、RNAの二次構造やタンパク質などの他の分子とのRNA相互作用を推定するために使用することができます。前作では、精製組換えタンパク質10,35を用いてインビボ条件34とインビトロの両方で代表的な株に関するSHAPE-Seq実験を行った。我々の場合、結果は、RBP結合がインビトロ36でこれらのRBPについて以前に報告されたよりもはるかに広いRNAセグメントに影響を与えたことを明らかにした。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
このプロジェクトは、計画予算委員会のI-COREプログラムとイスラエル科学財団(助成金第152/11)、マリー・キュリー再統合助成金第1号から資金を受け取りました。PCIG11-GA- 2012-321675、および補助金契約第664918号の下で欧州連合のホライズン2020研究革新プログラムから - MRG-文法。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8-lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| Glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| Incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| Ligase | NEB | B0202S | |
| Liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| Multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| Platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| Sodium Chloride (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
References
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