Summary
I denne metoden, kvantifisere vi bindende affinitet av RNA bindende proteiner (RBPs) til beslektet og ikke-beslektet bindende områder ved hjelp av en enkel, Live, reporter analysen i bakterielle celler. Analysen er basert på undertrykkelse av et reporter gen.
Abstract
I initiering trinn av protein oversettelse, ribosom binder seg til initiering regionen av mRNA. Oversettelse initiering kan blokkeres ved binding av en RNA bindende protein (RBP) til initiering regionen av mRNA, som forstyrrer ribosom binding. I den presenterte metoden bruker vi dette blokkerende fenomenet for å kvantifisere bindings affinitet fra RBPs til deres beslektet og ikke-beslektet bindings områder. For å gjøre dette setter vi inn et test bindings område i startområdet for en reporter mRNA og induserer uttrykket av testen RBP. Når det gjelder RBP-RNA-binding, observerte vi en sigmoidal undertrykkelse av reporter uttrykket som en funksjon av RBP-konsentrasjon. Ved manglende affinitet eller svært lav affinitet mellom bindings stedet og RBP, ble det ikke observert signifikant undertrykkelse. Metoden er utført i levende bakterieceller, og krever ikke dyre eller sofistikerte maskiner. Det er nyttig for kvantifisere og sammenligne mellom bindende slektskap av ulike RBPs som er funksjonelle i bakterier til et sett av designet bindende nettsteder. Denne metoden kan være upassende for bindende områder med høy strukturell kompleksitet. Dette skyldes muligheten for undertrykkelse av ribosomal initiering av komplekse mRNA struktur i fravær av RBP, noe som vil resultere i lavere basal reporter genuttrykk, og dermed mindre Observer reporter undertrykkelse på RBP bindende.
Introduction
RNA bindende protein (RBP)-basert post-transcriptional regulering, spesielt karakterisering av samspillet mellom RBPs og RNA, har blitt studert grundig de siste ti årene. Det finnes flere eksempler på translational ned-regulering i bakterier som stammer fra RBPs hemme, eller direkte konkurrerer med, ribosom binding1,2,3. Innen syntetisk biologi, RBP-RNA interaksjoner fremstår som et betydelig verktøy for utforming av transkripsjon-baserte genetiske kretser4,5. Derfor er det en økning i etterspørselen etter karakterisering av slike RBP-RNA interaksjoner i en cellulær sammenheng.
De vanligste metodene for å studere protein-RNA interaksjoner er Elektroforetiske Mobility Shift-analysen (EMSA)6, som er begrenset til in vitro-innstillinger, og ulike trekk ned analyser7, inkludert klipp metoden8,9 . Selv om slike metoder muliggjør oppdagelsen av de Novo RNA bindings stedene, lider de av ulemper som arbeidsintensive protokoller og dyre reaksjoner i dyp sekvensering, og kan kreve et spesifikt antistoff for RBP-pull-Down. På grunn av den mottakelige karakteren av RNA til sitt miljø, kan mange faktorer påvirke RBP-RNA-interaksjoner, med vekt på viktigheten av forhører RBP-RNA-binding i den cellulære konteksten. For eksempel har vi og andre demonstrert betydelige forskjeller mellom RNA-strukturene i vivo og in vitro10,11.
Basert på tilnærmingen til en tidligere studie12, har vi nylig demonstrert10 at når du plasserer pre-designede bindings steder for KAPSID RBPs fra bacteriophages ga13, MS214, PP715, og Qβ16 i Oversettelses initiering regionen av en reporter mRNA, er reporter uttrykk sterkt undertrykt. Vi presenterer en relativt enkel og kvantitativ metode, basert på dette undertrykkelse fenomenet, for å måle affinitet mellom RBPs og deres tilsvarende RNA bindings steds in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. system forberedelse
- Design av binding-site plasmider
- Utform bindings område kassetten som vist i figur 1. Hver minigene inneholder følgende deler (5 ' til 3 '): Eagl restriksjons område, ∼ 40 baser av 5 ' slutten av kanamycin (kan) motstands genet, pLac-Ara promoter, ribosom bindings sted (RBS), AUG av mCherry genet, en spacer (δ), en RBP bindende område, 80 baser av 5 ' end av mCherry genet, og en ApaLI restriksjon nettsted.
Merk: For å øke suksessen rate av analysen, design tre bindende-site kassetter for hvert bindende område, med avstandsstykker bestående av minst ett, to og tre baser. Se representant resultater for flere retningslinjer.
- Utform bindings område kassetten som vist i figur 1. Hver minigene inneholder følgende deler (5 ' til 3 '): Eagl restriksjons område, ∼ 40 baser av 5 ' slutten av kanamycin (kan) motstands genet, pLac-Ara promoter, ribosom bindings sted (RBS), AUG av mCherry genet, en spacer (δ), en RBP bindende område, 80 baser av 5 ' end av mCherry genet, og en ApaLI restriksjon nettsted.
- Kloning av binding site plasmider
- Bestill de bindings område kassettene som dobbel-strandet DNA (dsDNA) minigenes. Hver minigene er ∼ 500 BP lang og behersker en Eagl begrensning sted og en ApaLI begrensning sted for det 5 ' og 3 ' ender, respectively (se steg 1.1.1).
Merk: I dette eksperimentet ble mini gener med halvparten av det kanamycin genet beordret til å tilrettelegge for screening for positive kolonier. Imidlertid er Gibson montering17 også egnet her, og da bindingen området kan bestilles som to kortere utfyllende single-strandet DNA oligos. - Double-Digest både mini-gener og målet vektor med Eagl-HF og ApaLI av begrensningen protokollen18, og kolonne rense19.
- Ombinde den fordøyd minigenes til bindings stedet ryggraden som inneholder resten av mCherry reporter genet, Terminator, og en kanamycin motstand genet20.
- Forvandle den ligation løsningen til Escherichia coli top10 celler21.
- Identifiser positive transformants via sanger sekvensering.
- Design en primer 100 baser oppstrøms til regionen av interesse (se tabell 1 for primer sekvenser).
- Miniprep noen bakterie kolonier22.
- Forbered 5 μL av en 5 mM oppløsning av primer og 10 μL av DNA ved 80 ng/μL konsentrasjon.
- Send de to løsningen til et praktisk anlegg for sanger sekvensering23.
- Oppbevar renset plasmider ved-20 ° c, og bakterielle stammer som glyserol aksjer24, både i 96-brønn format. DNA vil da bli brukt for transformasjon til E. coli top10 celler som inneholder en av fire Fusion-RBP plasmider (se trinn 1.3.5).
- Bestill de bindings område kassettene som dobbel-strandet DNA (dsDNA) minigenes. Hver minigene er ∼ 500 BP lang og behersker en Eagl begrensning sted og en ApaLI begrensning sted for det 5 ' og 3 ' ender, respectively (se steg 1.1.1).
- Design og bygging av RBP plasmider
Merk: Amino acid og nukleotid sekvenser av pelsen proteiner som brukes i denne studien er oppført i tabell 2.- Bestill den nødvendige RBP sekvensen mangler en stopp Codon som en egendefinert-bestilt dsDNA minigene mangler en stopp Codon med begrensning nettsteder i endene (figur 1).
- Klon det testet RBP mangler en opphøre Codon med det samme nedstrøms av en induserbart promoter og oppstrøms av en fluorescerende protein mangler en starte Codon (skikkelsen 1), analog med skritt 1.2.2-1.2.4. Pass på at RBP-plasmider inneholder et annet antibiotikaresistens gen enn bindings stedet plasmider.
- Identifiser positive transformants via sanger sekvensering, tilsvarende trinn 1.2.5 (se tabell 1 for primer sekvenser).
- Velg en positiv transformant og gjøre det kjemisk-kompetent25. Oppbevares som glyserol renset plasmider ved-20 ° c og glyserol bestander av bakterielle stammer24 ved-80 ° c i 96-brønn plater.
- Forvandle bindings område plasmider (fra trinn 1.2.6) som er lagret i 96-plater, til kjemisk kompetente bakterieceller som allerede inneholder en RBP-mCerulean plasmider21. For å spare tid, i stedet for plating cellene på Petri retter, tallerken dem ved hjelp av en 8-kanals pipettehjelper på 8-Lane plater som inneholder Luria-Bertani (LB)26 agar med relevante antibiotika (kan og amp). Koloniene skal vises i 16 h.
- Velg en enkelt koloni for hver dobbel transformant og vokse over natten i LB medium med relevante antibiotika (kan og amp) og lagre som glyserol aksjer24 at-80 ° c i 96-brønn plater.
2. oppsett av eksperimenter
Merk: Protokollen som presenteres her ble utført ved hjelp av en væske-håndtering Robotic system i kombinasjon med en inkubator og en plate leser. Hver måling ble utført for 24 induser konsentrasjoner, med to duplikater for hver stamme + induser kombinasjon. Ved hjelp av dette robot systemet ble det samlet inn data for 16 stammer per dag med 24 induser konsentrasjoner. Men hvis en slik enhet er utilgjengelig, eller hvis færre eksperimenter er nødvendig, kan disse enkelt gjøres for hånd ved hjelp av en 8-kanals multi-pipette og tilpasse protokollen tilsvarende. For eksempel, foreløpige resultater for fire stammer per dag med 12 induser konsentrasjoner og fire tid-poeng ble kjøpt på denne måten.
- Forbered, på forhånd, 1 L av fotokarsinogenetisk buffer (BA) ved å blande 0,5 g tryptone, 0,3 mL glyserol, 5,8 g NaCl, 50 mL 1 M MgSO4, 1 ml av 10x fosfat-bufret saltvann (PBS) buffer pH 7,4, og 950 ml av dobbelt destillert vannet (DDW). Autoklav eller sterilt filter BA-bufferen.
- Øk de doble transformant stammene ved 37 ° c og 250 RPM risting i 1,5 mL LB med egnede antibiotika (kanamycin ved en endelig konsentrasjon på 25 μg/mL og Ampicillin ved en endelig konsentrasjon på 100 μg/mL), i 48-brønn plater, over en periode på 18 timer (over natten).
-
I morgen, gjør følgende forberedelser.
- Induser plate. I en ren 96-brønn plate forbereder du brønner med semi-fattig medium (SPM) bestående av 95% BA og 5% LB26 i inkubator ved 37 ° c. Antall brønner tilsvarer det ønskede antall induser konsentrasjoner. Legg C4-HSL til brønnene i induser platen som skal inneholde den høyeste induser konsentrasjonen (218 nM).
- Program roboten til å serielt fortynne medium fra hver av de høyeste konsentrasjonen brønner i 23 lavere konsentrasjoner fra 0 til 218 nM. Volumet av hver induser fortynning bør være tilstrekkelig for alle belastninger (inkludert duplikater).
- Mens de induser fortynninger forberedes, varm 180 μL av SPM i inkubator ved 37 ° c, i 96-brønn plater.
- Fortynne de overnatter stammer fra trinn 2,2 med en faktor på 100 av seriell fortynninger: først fortynne med en faktor på 10 ved å blande 100 μL av bakterier med 900 μL av SPM i 48-brønn plater, og deretter fortynnes igjen med en faktor på 10 ved å ta 20 μL fra den fortynnede oppløsningen i 180 μL av forvarmet SPM i 96-brønn plater som egner seg til fluorescerende målinger.
- Tilsett de fortynnede induser fra induser platen til 96-brønn platene med de fortynnede stammene i henhold til slutt konsentrasjonen.
- Rist 96-brønn platene ved 37 ° c i 6 timer, mens du tar målinger av optisk tetthet ved 595 NM (OD595), mCherry (560 NM/612 NM) og mCerulean (460 NM/510 NM) fluorescens via en plate leser hver 30 min. For normalisering formål, måle veksten av SMP uten celler lagt til.
3. foreløpige resultater analyse
- For hver dag med eksperiment, velger du et tidsintervall på logaritmisk vekst i henhold til den målte vekst kurvene, mellom den lineære vekstfasen og den stasjonære (T0, t-finalen). Ta cirka 6 − 8 tids punkt, mens du forkaster de første og siste målingene for å unngå feil som kommer fra unøyaktigheter i eksponentiell vekst deteksjon (se figur 2a, øvre panel).
Merk: Kast stammer som viser unormal vekst kurver eller belastninger der logaritmisk vekstfase ikke kunne oppdages og gjenta eksperimentet. -
Beregn gjennomsnittlig normalisert fluorescens for mCerulean og frekvensen av produksjon av mCherry, fra rådata til både mCerulean og mCherry fluorescens for hver induser konsentrasjon (figur 2a).
- Beregn normalisert mCerulean som følger:
der blank (mCerulean) er mCerulean nivå [a.u.] for medium bare, blank (OD) er den optiske tettheten for medium bare, og mCerulean og OD er mCerulean fluorescens og optiske tetthetsverdier, henholdsvis. - Gjennomsnittlig mCerulean over de forskjellige tids punktene (figur 2b, de to øverste panelene) som følger:
der #Time poeng er antall data tidspunkter tatt i betraktning, T0 er tiden hvor den eksplosive vekstfasen begynner, og t-finalen er tiden hvor den eksplosive vekstfasen slutter. - Beregn mCherry produksjonshastighet (fig. 2b, de to nederste panelene) som følger:
der mCherry (t) er mCherry nivå [a.u.] på tid t, OD er den optiske tetthets verdien, T0 er tiden hvor den eksplosive vekstfasen begynner, og t-finalen er tiden der eksponentiell vekstfase slutter.
- Beregn normalisert mCerulean som følger:
- Til slutt, plot mCherry rate av produksjonen som en funksjon av mCerulean, skape dose respons kurver som en funksjon av RBP-mCerulean Fusion fluorescens (figur 2C). Slike plott representerer produksjon av reporteren genet som en funksjon av RBP tilstedeværelse i cellen.
4. dose respons funksjon montering rutine og KRBP ekstraksjon
- Under forutsetning av at ribosom raten for oversettelse med RBP bundet er konstant, modellere mCherry produksjonshastighet som følger (se figur 2D, grønn linje):
der [x] er normalisert gjennomsnittet mCerulean fluorescens beregnet i henhold til EQ. 2, mCherry produksjonshastighet er verdien som beregnes i henhold til EQ. 3, KRBP er den relative bindings affinitet [a.u.], kubundet er ribosom raten for oversettelse med RBP ubundet, n er cooperativity faktor, og C er basen fluorescens [a.u.]. C, n, Kubundetog kRBP finnes ved å tilpasse mCherry produksjonsrate data til modellen (EQ. 4). - Ved hjelp av dataanalyse programvare, gjennomføre en passende prosedyre på tomter som viser mCherry produksjonshastighet som en funksjon av gjennomsnitt mCerulean (trinn 3,3), og trekke ut passer parametrene i henhold til formelen i EQ. 4.
Merk: Bare tilpasnings resultater med R2 > 0,6 tas i betraktning. For de som passer, er KRBP Error meste i størrelsesområdet 0,5% til 20% av KRBP verdier, for en 0,67 tillit intervall, mens de med høyere KRBP feil kan også verifiseres av øyet. - Normalisere KRBP verdier etter den respektive maksimale verdien på gjennomsnitt mCerulean for hver dose reaksjons funksjon.
der KRBP in [a.u.] er verdien som trekkes ut fra tilpasnings prosedyren i EQ. 4, og maks (gjennomsnitt mCerulean) er det maksimale gjennomsnittet mCerulean-signalet [a. u] observert for gjeldende belastning.
Merk: Normalisering forenkler riktig sammenligning av regulatoriske effekten på tvers av stammer ved å eliminere avhengigheten av de spesielle maksimalt RBP uttrykk nivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den presenterte metoden utnytter konkurransen mellom en RBP og ribosom for binding til mRNA molekylet (figur 1). Denne konkurransen gjenspeiles ved å redusere mCherry nivåer som en funksjon av økt produksjon av RBP-mCerulean, på grunn av økende konsentrasjoner av induser. I tilfelle av økende mCerulean fluorescens, uten vesentlige endringer i mCherry, en mangel på RBP binding er utledet. Representative resultater for både positiv og negativ belastning er avbildet i figur 2. I figur 2ablir OD-, mCherry-og mCerulean-kanalene presentert som en funksjon av tid og induser over et område på fire timer, med T0 = 1 t og T-finalen = 3,5 h. I figur 2b, gjennomsnitt mCerulean fluorescens (topp) og mCherry rate av produksjon (nederst) er presentert som en funksjon av induser konsentrasjon, for de to eksempel stammer. Som kan sees, resultatene for en positiv belastning vise en klar ned-regulatoriske effekt i mCherry rate av produksjon (figur 2b, C), som oversettes til en betydelig ikke-nullverdi av KRBP (figur 2D). For den positive belastningen ga tilpasnings prosedyren følgende verdier: KRBP = 394,6 A.u., kubundet = 275,6, n = 2,1, C = 11,2 a.u. og R2 = 0,93. Etter normalisering av maksimal mCerulean fluorescens, var KRBP Value 0,24. For den negative belastningen ble det observert en mangel på tydelig respons (figur 2C), og ingen KRBP -verdi ble trukket ut (figur 2D).
I Figur 3, presenterer vi resultatene av denne analysen for to Phage pels RBPS, PP7 og MS2, på flere mutert bindende områder, på ulike steder innenfor initiering regionen av mCherry mRNA. Resultatene er grovt klassifisert i tre typer svar (figur 3a): stammer viser en ned-regulatoriske effekt på et lavt mCerulean nivå, noe som reflekterer en lav KRBP Value (høy bindende tilhørighet); stammer stiller ned-regulatoriske effekt på enten middels eller høy mCerulean nivåer, som reflekterer en høy KRBP verdi (middels eller lav affinitet); og stammer viser ingen tydelig respons på stigende nivåer av mCerulean, som reflekterer en høyere KRBP verdi enn maksimal RBP konsentrasjon i cellen (ingen detectible bindende affinitet). Figur 3b presenterer den minimale KRBP -verdien beregnet for hver RBP − bindings område kombinasjon basert på alle kombinasjoner av de to RBPs og ti bindings områder på forskjellige plasseringer. Bindings områdene inkluderer en negativ kontroll (ingen bindings område), ikke-samsvarende bindings områder og en positiv kontroll – det opprinnelige bindings området for hver RBP (PP7-WT for PP7 coat protein [PCP] og MS2-WT for MS2 coat protein [MCP]). Resultatene samsvarer med prognosene, siden begge RBPs presenterer en høy affinitet for sine positive kontroller, og en ikke-detectible bindings affinitet for de negative kontrollene. I tillegg har tidligere studier ved hjelp av disse to RBPs observert at de er ortogonale, som er tydelig formidlet i heatmap presentert: både MCP og PCP ikke bind native site av de andre RBP. Videre er mutert bindende områder presentere varierende resultater, hvor noen bindende områder viste et tilsvarende nivå av affinitet som for det opprinnelige området, for eksempel PP7-mut-1, PP7-mut-2, og MS2-mut-3, mens andre viste en betydelig lavere affinitet, for eksempel PP7-mut-3 og MS2-mut-2. Dermed analysen presenterte en kvantitativ in vivo måling av bindingen affinitet av RBPs, gir resultater som kan sammenlignes med de tidligere eksperimenter med disse RBPs.
Siden analysen er basert på undertrykkelse av mCherry genet, en levedyktig mCherry signal er nødvendig. Når du utformer bindings område kassetten, er det derfor to utformingsregler å huske på. For det første, det åpen lesing rammen (ORF) av det mCherry burde være holdt. Siden bindings område lengden kan variere, kan det å sette den inn i genet føre til et skifte av en eller to baser fra den opprinnelige mCherry ORF. Hvis det er nødvendig (figur 4a), må du derfor sette inn en eller to baser umiddelbart nedstrøms til bindings området. For eksempel vil et bindings sted som er 20-base lang, med en δ av to baser, gi et tillegg på 22 baser til mCherry-genet. For å holde ORF, må vi legge til to baser, for totalt 24 baser. Den andre design regelen er å unngå innsettinger av stopp kodon inn i mCherry ORF. Noen bindings områder, som MS2-mut-2 (figur 4b, innfelt), inneholder stopp kodon når den plasseres i en eller flere av de tre mulige ORFs. Et slikt eksempel er illustrert i figur 4a, der bindings området inneholdt et stopp-Codon som er i-ramme med mCherry ORF bare når det ikke er lagt til noen baser. Som kan sees i dose-respons kurve for den posisjonen (figur 4b), mCherry produksjonshastighet var undetectable, og dermed bindingen affinitet ikke kunne måles.
En nærmere titt på figur 4b demonstrerer effekten av avstands δ på mCherry produksjon. For eksempel, for δ = 4, basal produksjonshastighet var en faktor på seks mer enn for δ = 5, noe som sikrer en høyere fold-undertrykking effekt. For δ = 14, men de basale produksjonsnivåene var for lave til å observere en ned-regulatoriske effekt.
Figur 1: oversikt over system design og kloning trinn. Illustrasjon av kassettdesign for bindings området plasmider (venstre) og RBP-mCerulean plasmider (høyre). Det neste trinnet er påfølgende transformasjoner av begge plasmider i kompetente E. coli celler, med RBP plasmider først. Double-transformants blir deretter testet for deres mCherry uttrykks nivåer i økende induser konsentrasjoner; Hvis RBP binder seg til bindings området, mCherry nivåer nedgang som en funksjon av mCerulean (grå boble). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: analyse ordning. (A) tre-dimensjonale (3D) tomter som viser rå OD nivåer (øverst), mCerulean fluorescens (midten), og mCherry fluorescens (nederst) som en funksjon av tid og induser konsentrasjon, for en positiv belastning. (B) topp: mCerulean jevnt-statlige uttrykks nivåer for hver induser konsentrasjon beregnes ved å dele hvert fluorescens nivå av de respektive OD og snitt over alle verdier i vinduet 2 − 3 timer eksponentiell vekst for både den positive (venstre) og negative (høyre) stammer. Bunn: mCherry produksjonshastighet beregnet i henhold til EQ. 3 for tids punkt 2 − 3 timer etter induksjon. (C) mCherry produksjonshastighet plottet som en funksjon av bety mCerulean fluorescens gjennomsnitt over to biologiske duplikater for to stammer. Feilfelt er standardavvik for både mCherry produksjonshastighet og gjennomsnitt mCerulean fluorescens anskaffet fra minst to replikerer. (D) passer til KRBP bruk tilpasnings formelen i EQ. 4 vist for positiv belastning (venstre), viser en bestemt bindende respons. For den negative belastningen (høyre), ble ingen KRBP Value trukket ut. Data vises i duplikat. Dette tallet er tilpasset med tillatelse fra Katz et al.10. Copyright 2018 American Chemical Society. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative endelige resultater. (A) normalisert dose-respons kurver for tretti forskjellige stammer basert på to RBPs og ti bindende steder på forskjellige steder. Tre typer svar er observert: høy affinitet, lav affinitet, og ingen affinitet. (B) kvantitativ KRBP resultater for to RBPS (MCP og PCP) med fem forskjellige bindings område kassetter (listet). Alle RBP − bindings område stammer ble målt i duplikat. Dette tallet er tilpasset med tillatelse fra Katz et al.10. Copyright 2018 American Chemical Society. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: eksempel utforming og resultater for MCP med et mutant bindings område. (A) design illustrasjon av bindingen området kassetter på fire forskjellige steder. Kassett inkludert ribosom bindende nettsted, start Codon for mCherry, δ spacer baser, bindings stedet testet, en eller to baser for å opprettholde ORF, og resten av mCherry genet. Røde stjerner indikerer en stopp Codon. (B) dose-respons KURVER for MCP med et mutant bindende sted på fire forskjellige steder. Innfelt: sekvensen av testet mutert bindende område. Resultatene som presenteres er for duplikater av hver belastning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| navn | Binidng sted, A i august = 1 | Bindings område sekvens (RBS for kontroller) | Site: ATG til andre mCherry Codon GTG Kontroller: RBS til andre mCherry Codon GTG |
Kilde |
| MS2_wt_d5 | 5 | acatgaggattacccatgt | atgcacatgaggattacccatgtcgtg | Gen9 Inc. |
| MS2_wt_d6 | 6 | acatgaggattacccatgt | atggcacatgaggattacccatgtgtg | Gen9 Inc. |
| MS2_wt_d8 | 8 | acatgaggattacccatgt | atggcgcacatgaggattacccatgt cgtg |
Gen9 Inc. |
| MS2_wt_d9 | 9 | acatgaggattacccatgt | atggcgccacatgaggattacccatg tgtg |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) C_d8 | 8 | acatgaggatcacccatgt | atgcacatgaggatcacccatgtgg Vs |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) C_d9 | 9 | acatgaggatcacccatgt | atggcacatgaggatcacccatgtg Vs |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) C_d8 | 8 | acatgaggatgacccatgt | atgcacatgaggatgacccatgtgg Vs |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) G_d9 | 9 | acatgaggatgacccatgt | atggcacatgaggatgacccatgtg Vs |
Gen9 Inc. |
| MS2_struct_d9 | 9 | cacaagaggttcacttatg | atggccacaagaggttcacttatgg Vs |
Gen9 Inc. |
| MS2_struct_d8 | 8 | cacaagaggttcacttatg | atgccacaagaggttcacttatggg Vs |
Gen9 Inc. |
| PP7wt_d5' | 5 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgctaaggagtttatatggaaacc cttacgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7wt_d6' | 6 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgaataaggagtttatatggaaac ccttagtg |
Twist Bioscience |
| PP7wt_d8' | 8 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgaacataaggagtttatatggaa acccttacgtg |
Twist Bioscience |
| PP7wt_d9' | 9 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgaacaataaggagtttatatgga aacccttagtg |
Twist Bioscience |
| PP7_USLSBm_d6 | 6 | taaccgctttatatggaaagggtta | atggctaaccgctttatatggaaag ggttagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_USLSBm_d15 | 15 | taaccgctttatatggaaagggtta | atgggcgccggcgctaaccgcttta tatggaaagggttagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_nB_d5 | 5 | taagggtttatatggaaaccctta | atgctaagggtttatatggaaaccc ttagcgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_nB_d6 | 6 | taagggtttatatggaaaccctta | atggctaagggtttatatggaaacc cttatgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_USs_d5 | 5 | taaggagttatatggaaccctta | atgctaaggagttatatggaaccct tagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_USs_d6 | 6 | taaggagttatatggaaccctta | atggctaaggagttatatggaaccc ttagcgtg |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d1 | - | - | ttaaagaggagaaaggtacccatgg Vs |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d4 | - | - | ttaaagaggagaaaggtacccatgg gcgtg |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d10 | - | - | ttaaagaggagaaaggtacccatgg gcgccggcgtg |
Gen9 Inc. |
| Primer for bindings område kassetter | gcatttttatccataagattagcgg | Idt | ||
| Primer for RBP-kassetter | gcggcgctgggtctcatctaataa | Idt | ||
Tabell 1: bindings områder og sekvensering-primere. Sekvenser for bindende nettsteder og bindende nettsted kassetter som brukes i denne studien, samt primere for sekvensering reaksjonene beskrevet i protokollen (trinn 1.2.5.1 og 1.3.3).
| RBP navn i dette arbeidet | kilde organisme navn, protein | kilde organisme genet | kilde organisme refseq | wt AA SEQ | endringer fra WT (og referanser) | AA SEQ brukes i dette arbeidet | NT SEQ brukes i dette arbeidet |
| Mcp | Escherichia virus MS2 | Cp | NC_001417.2 | MASNFTQFVLV DNGGTGDVTV APSNFANGVA EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI KVEVPKVATQT VGGVELPVA AWRSYLNMEL TIPIFATNSD CELIVKAMQG LLKDGNPIPS AIAANSGIY |
delF-G 1 V29I [1] tatt fra addgene plasmider 27121 |
MASNFTQFVLV DNGGTGDVTV APSNFANGIA EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI KVEVPKG AWRSYLNMEL TIPIFATNSD CELIVKAMQG LLKDGNPIPS AIAANSGIY |
ATGGCTTCTA ACTTTACTCA GTTCGTTCTC GTCGACAATG GCGGAACTGG CGACGTGACT GTCGCCCCAA GCAACTTCGC TAACGGGATC GCTGAATGGA TCAGCTCTAA CTCGCGTTCA CAGGCTTACA AAGTAACCTG TAGCGTTCGT CAGAGCTCTG CGCAGAATCG CAAATACACC ATCAAAGTCG AGGTGCCTAA AGGCGCCTGG CGTTCGTACT TAAATATGGA ACTAACCATT CCAATTTTCG CCACGAATTC CGACTGCGAG CTTATTGTTA AGGCAATGCA AGGTCTCCTA AAAGATGGAA ACCCGATTCC CTCAGCAATC GCAGCAAACT CCGGCATCTAC |
| Pcp | Pseudomonas phage PP7 | Cp | NC_001628.1 | MSKTIVLSVGEA TRTLTEIQST ADRQIFEEKV GPLVGRLRLT ASLRQNGAKT AYRVNLKLDQ ADVVDCSTSVC GELPKVRYTQ VWSHDVTIVA NSTEASRKSL YDLTKSLVAT SQVEDLVVNL VPLGR |
delF-G [2] tatt fra addgene plasmider 40650 |
MLASKTIVLSVG EATRTLTEIQ STADRQIFEE KVGPLVGRLR LTASLRQNGA KTAYRVNLKL DQADVVDSG LPKVRYTQVW SHDVTIVANS TEASRKSLYD LTKSLVATSQ VEDLVVNLVP LGR |
ATGCTAGCCTC CAAAACCATC GTTCTTTCGG TCGGCGAGGC TACTCGCACT CTGACTGAGA TCCAGTCCAC CGCAGACCGT CAGATCTTCG AAGAGAAGGT CGGGCCTCTG GTGGGTCGGC TGCGCCTCAC GGCTTCGCTC CGTCAAAACG GAGCCAAGAC CGCGTATCGC GTCAACCTAA AACTGGATCA GGCGGACGTC GTTGATTCCG GACTTCCGAA AGTGCGCTAC ACTCAGGTAT GGTCGCACGA CGTGACAATC GTTGCGAATA GCACCGAGGC CTCGCGCAAA TCGTTGTACG ATTTGACCAA GTCCCTCGTC GCGACCTCGC AGGTCGAAGA TCTTGTCGTC AACCTTGTGC CGCTGGGCCGT |
| Referanser: | |||||||
| 1. Peabody, D.S., Ely, K.R. kontroll av translational undertrykkelse av protein-protein interaksjoner. Nukleinsyre syrer Research. 20 (7), 1649 – 1655 (1992). | |||||||
| 2. Chao, J.A., Patskovsky, Y., Almo, SC, Singer, R.H. strukturelle grunnlag for coevolution av en viral RNA-protein kompleks. Natur strukturelle &Amp; molekylærbiologi. 15 (1), 103 – 105, Doi: 10.1038/nsmb1327 (2008) | |||||||
Tabell 2: RBP sekvenser. Amino acid og nukleotid sekvenser av pelsen proteiner som brukes i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet i denne artikkelen forenkler kvantitativ in vivo måling av RBP-RNA bindende affinitet i E. coli celler. Protokollen er relativt enkel og kan gjennomføres uten bruk av sofistikerte maskiner, og dataanalyse er grei. Videre er resultatene produseres umiddelbart, uten den relativt lange ventetiden knyttet til neste generasjons sekvensering (NGS) resultater.
En begrensning til denne metoden er at det fungerer bare i bakterielle celler. En tidligere studie12 har imidlertid vist en undertrykkelse effekt ved hjelp av en lignende tilnærming for L7AE RBP i pattedyrceller. En ytterligere begrensning av metoden er at innsetting av bindings området i mCherry initiering regionen kan undertrykke basal mCherry nivåer. Strukturelle kompleksitet eller høy stabilitet i bindings området kan forstyrre ribosomal innvielse selv i fravær av RBP, noe som resulterer i redusert mCherry basal nivåer. Hvis basal nivåene er for lave, vil den ekstra undertrykkelsen på av økende konsentrasjoner av RBP ikke bli synlig. I et slikt tilfelle, er det best å designe bindingen området kassetten med bindende området fortsatt i initiering regionen, men på randen av overgangen fra initiering regionen til forlengelse regionen (δ i området 12-15 BP10,29). Vi har vist at for slike δ verdier en undertrykkelse effekt kan fortsatt observeres. For å øke sjansene for at analysen vil fungere, uavhengig av strukturell kompleksitet, anbefaler vi å utføre analysen på minst tre forskjellige posisjoner for en gitt bindende nettsted.
Den største ulempen med metoden i forhold til in vitro metoder, slik som EMSA, er at RBP-RNA binding affinitet ikke måles i absolutte enheter av RBP konsentrasjon, men heller i form av Fusion-RBP fluorescens. Denne ulempen er et direkte resultat av in vivo-innstillingen, som begrenser vår evne til å lese ut de faktiske konsentrasjonene av RBP. Denne ulempen er oppveid av fordelene ved å måle i in vivo-innstillingen. For eksempel har vi funnet forskjeller i bindende slektskap når vi sammenligner resultater fra vår in vivo-analyse med tidligere in vitro-og in situ-analyser. Disse forskjellene kan stamme fra uoverensstemmelser i strukturen til de mRNA molekylene i vivo som kommer fra deres tilstedeværelse i cellene10,11,30,31. Slike strukturelle forskjeller kan føre til endringer i stabiliteten i foldet statene in vivo som i sin tur enten stabilisere eller de-stabilisere RBP binding.
Siden metoden er relativt enkel og rimelig, anbefaler vi å kjøre flere kontroller sammen med selve eksperimentet. Å kjøre en negativ kontroll, dvs., en sekvens som ikke har noen affinitet til RBP, har likevel liknende strukturelle funksjoner, kan bidra til å unngå falske positiver som stammer fra ikke-spesifikk interaksjon med mRNA. I de representative resultatene som vises, var de to negative kontrollene mCherry-genet alene (ingen bindings område), og det opprinnelige bindings stedet til de andre RBP (dvs. PP7-WT for MCP og MS2-WT for PCP). Videre foreslår vi å innlemme en positiv kontroll (for eksempel en RBP og den innfødte bindende nettsted). En slik kontroll vil bidra til å kvantifisere bindingen affinitet ved å presentere et referansepunkt, og for å unngå falske negativer som stammer fra lav fold-undertrykking.
Til slutt, for de som ønsker å få et strukturelt perspektiv av RBP-RNA bindende, foreslår vi utføre en selektiv 2 ′-hydroksyl acylering analysert av primer forlengelse sekvensering (Shape-SEQ)11,32,33 Eksperiment. SHAPE-SEQ er en NGS-tilnærming kombinert med kjemiske undersøkelser av RNA, som kan brukes til å estimere den sekundære strukturen av RNA og RNA-interaksjoner med andre molekyler, for eksempel proteiner. I vårt tidligere arbeid gjennomførte vi en Shape-SEQ eksperiment på en representativ stamme i både in vivo vilkår34 og in vitro med renset rekombinant protein10,35. I vårt tilfelle viste resultatene at RBP-binding påvirket et mye bredere segment av RNA enn tidligere rapportert for disse RBPs in vitro36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet fikk støtte fra i-CORE program av planlegging og budsjettering komiteen og Israel Science Foundation (Grant no. 152/11), Marie Curie reintegrasjon Grant no. PCIG11-GA-2012-321675, og fra EUs Horizon 2020 Research and Innovation program under innvilge avtale no. 664918-MRG-grammatikk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8-lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| Glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| Incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| Ligase | NEB | B0202S | |
| Liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| Multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| Platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| Sodium Chloride (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
References
- Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).
- Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. Regulation of translation initiation by RNA binding proteins. Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).
- Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria. Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).
- Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).
- Bendak, K., et al. A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein. Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).
- Strein, C., Alleaume, A. -M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells. RNA. 20 (5), 721-731 (2014).
- Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
- Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
- Katz, N., et al. An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).
- Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Methods. 103, 34-48 (2016).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA. Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).
- Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
- Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
- Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein. Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- NEB. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions. , Available from: https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions (2018).
- Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol. , Available from: https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/ (2018).
- NEB. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202). , Available from: https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202 (2018).
- Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html (2018).
- NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit. , Available from: https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx (2018).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Addgene. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/ (2018).
- NEB. Making your own chemically competent cells. , Available from: https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells (2018).
- Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling. , Available from: https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation (2018).
- Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo. Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).
- Espah Borujeni, A., et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505, (2013).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486 (2015).
- Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq. Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).
- Bernardi, A., Spahr, P. -F. Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).
