Summary
Neste método, nós quantificamos a afinidade obrigatória de proteínas de ligação do RNA (rbps) aos locais de ligação cognato e non-cognato usando um simples, vivo, ensaio do repórter em pilhas bacterianas. O ensaio é baseado na repressão de um gene repórter.
Abstract
No passo de iniciação da tradução da proteína, o Ribossome liga-se à região de iniciação do mRNA. A iniciação da tradução pode ser obstruída pela ligação de uma proteína obrigatória do RNA (RBP) à região de iniciação do mRNA, que interfere com o emperramento ribossoma. No método apresentado, utilizamos este fenômeno de bloqueio para quantificar a afinidade vinculativa de RBPs aos seus locais de ligação cognato e não cognato. Para fazer isso, inserimos um site de vinculação de teste na região de iniciação de um mRNA de repórter e induzem a expressão do teste RBP. No caso da Associação RBP-RNA, observou-se uma repressão sigmoidal da expressão repórter em função da concentração de RBP. No caso de não afinidade ou de afinidade muito baixa entre o local de ligação e a RBP, não foi observada nenhuma repressão significativa. O método é realizado em células bacterianas ao vivo, e não requer maquinaria dispendiosa ou sofisticada. É útil para quantificar e comparar entre as afinidades de ligação de RBPs diferentes que são funcionais nas bactérias a um jogo de locais de ligação projetados. Este método pode ser inadequado para sites de ligação com alta complexidade estrutural. Isto é devido à possibilidade da repressão da iniciação ribosomal pela estrutura complexa do mRNA na ausência de RBP, que conduziria à expressão de gene mais baixa do repórter basal, e assim à repressão menos-Observable do repórter em cima da ligação de RBP.
Introduction
A regulação pós-transcricional de proteína de ligação de RNA (RBP), especificamente a caracterização da interação entre RBPs e RNA, tem sido extensivamente estudada nas últimas décadas. Existem vários exemplos de baixo-regulação translacional em bactérias originárias da inibição do rbps, ou diretamente competindo com, ligação Ribossome1,2,3. No campo da biologia sintética, as interações RBP-RNA estão surgindo como uma ferramenta significativa para o desenho de circuitos genéticos baseados em transcrição4,5. Portanto, há um aumento na demanda para caracterização dessas interações RBP-RNA em um contexto celular.
Os métodos mais comuns para o estudo das interações proteína-RNA são o ensaio eletroforético de deslocamento de mobilidade (EMSA)6, que é limitado a configurações in vitro, e vários ensaios pull-down7, incluindo o método de clipe8,9 . Quando tais métodos permiterem a descoberta de locais de ligação do RNA de de novo, sofrem dos inconvenientes tais como protocolos labor-intensivos e de reações de seqüenciamento profundas caras e podem exigir um anticorpo específico para a tração-para baixo de RBP. Devido à natureza suscetível do RNA ao seu ambiente, muitos fatores podem afetar as interações RBP-RNA, enfatizando a importância de interrogar a ligação RBP-RNA no contexto celular. Por exemplo, nós e outros temos demonstrado diferenças significativas entre as estruturas de RNA in vivo e in vitro10,11.
Baseado na aproximação de um estudo precedente12, Nós demonstramos recentemente10 que ao coloc locais obrigatórios pre-projetados para o capsídeo rbps dos bacteriófagos GA13, MS214, PP715, e qβ16 no região de iniciação de tradução de um repórter mRNA, a expressão do repórter é fortemente reprimido. Nós apresentamos um método relativamente simples e quantitativo, baseado neste fenômeno da repressão, para medir a afinidade entre RBPs e seu local de ligação RNA correspondentes in vivo.
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Protocol
1. preparação do sistema
- Projeto de plasmídeos do ligação-local
- Projete a gaveta do local de ligação como representado na Figura 1. Cada que contém as seguintes peças (5 ' a 3 '): Eagl local de restrição, ~ 40 bases do 5 ' fim do canamicina (Kan) gene de resistência, pLac-ara promotor, Ribossoma Binding site (RBS), Aug do gene mcherry, um espaçador (δ), um local de ligação RBP, 80 bases do 5 ' final do gene mCherry, e um local de restrição ApaLI.
Nota: Para aumentar a taxa de sucesso do ensaio, projetar três gavetas de encadernação para cada local de ligação, com espaçadores consistindo de pelo menos um, dois e três bases. Consulte a seção resultados representativos para obter mais diretrizes.
- Projete a gaveta do local de ligação como representado na Figura 1. Cada que contém as seguintes peças (5 ' a 3 '): Eagl local de restrição, ~ 40 bases do 5 ' fim do canamicina (Kan) gene de resistência, pLac-ara promotor, Ribossoma Binding site (RBS), Aug do gene mcherry, um espaçador (δ), um local de ligação RBP, 80 bases do 5 ' final do gene mCherry, e um local de restrição ApaLI.
- Clonagem de plasmídeos do local obrigatório
- Encomende as fitas do site de encadernação como minigenos de DNA de duas cordas (dsDNA). Cada que é ~ 500 BP longo e contem um local da limitação de Eagl e um local da limitação de apali nos 5 ' e 3 ' extremidades, respectivamente (veja a etapa 1.1.1).
Nota: Neste experimento, minigenes com metade do gene da kanamicina foram ordenados para facilitar a triagem para colônias positivas. Entretanto, a montagem17 de Gibson é igualmente apropriada aqui, neste caso o local obrigatório pode ser requisitado como dois oligos single-stranded complementares mais curtos do ADN. - Duplo-digerir ambos os mini-genes e o vetor alvo com Eagl-HF e apali pelo protocolo de restrição18, e coluna purificar19.
- Ligate os minigenes digeridos à espinha dorsal do emperramento-local que contem o descanso do gene do repórter de mcherry, do terminador, e de um gene20da resistência do canamicina.
- Transforme a solução de ligadura em células de Escherichia coli -21.
- Identifique os transformantes positivos através do sequenciamento de Sanger.
- Projetar uma cartilha 100 bases upstream para a região de interesse (ver tabela 1 para sequências de primer).
- Miniprep algumas colônias bacterianas22.
- Prepare 5 μL de uma solução de 5 mM da primeira demão e 10 μL de ADN a 80 ng/μL de concentração.
- Envie as duas soluções para uma instalação conveniente para o sequenciamento de Sanger23.
- Armazene plasmíos purificados a-20 ° c e cepas bacterianas como estoques de glicerol24, ambos no formato 96-well. O DNA será então usado para a transformação em células de E. coli ------------------------(ver passo 1.3.5)
- Encomende as fitas do site de encadernação como minigenos de DNA de duas cordas (dsDNA). Cada que é ~ 500 BP longo e contem um local da limitação de Eagl e um local da limitação de apali nos 5 ' e 3 ' extremidades, respectivamente (veja a etapa 1.1.1).
- Concepção e construção do plasmídeo RBP
Nota: As sequências de aminoácido e nucleotídeo das proteínas do revestimento utilizadas neste estudo estão listadas na tabela 2.- Encomende a sequência de RBP necessária sem um Codon de parada como um minigeno dsDNA ordenado encomenda, faltando um Codon de parada com locais de restrição nas extremidades (Figura 1).
- Clonar o RBP testado faltando um Codon de parada imediatamente a jusante de um promotor induzível e a montante de uma proteína fluorescente que falta um Codon do começo (Figura 1), similar às etapas 1.2.2-1.2.4. Certifique-se de que o plasmídeo RBP contenha um gene diferente da resistência antibiótica do que o plasmídeo do ligação-local.
- Identifique os transformantes positivos através do sequenciamento de Sanger, semelhante ao passo 1.2.5 (ver tabela 1 para sequências de primer).
- Escolha um transformante positivo e torne-o quimicamente-competente25. Armazene como plasmídos purificados de glicerol a-20 ° c e estoques de glicerol de cepas bacterianas24 at-80 ° c em placas 96-well.
- Transforme os plasmídeo do local de ligação (da etapa 1.2.6) armazenados em placas 96-well em pilhas bacterianas quimicamente-competentes que contêm já um plasmídeo RBP-mcerulean21. Para economizar tempo, em vez de galvanizar as células em placas de Petri, placa-los usando um pipetador de 8 canais em 8-pistas de pista contendo Luria-Bertani (LB)26 Agar com antibióticos relevantes (Kan e amp). As colônias devem aparecer em 16 h.
- Selecione uma única colônia para cada transformante duplo e cresça durante a noite no meio LB com os antibióticos relevantes (Kan e amp) e armazene como estoques de glicerol24 at-80 ° c em placas 96-well.
2. configuração do experimento
Nota: O protocolo aqui apresentado foi realizado por meio de um sistema robótico de manuseio de líquidos em combinação com uma incubadora e um leitor de placas. Cada medida foi realizada para 24 concentrações de indutor, com duas duplicatas para cada combinação de estirpe + indutor. Utilizando este sistema robótico, foram coletados dados para 16 cepas por dia com 24 concentrações de indutor. No entanto, se tal dispositivo não estiver disponível, ou se forem necessários menos experimentos, estes podem ser facilmente feitos manualmente usando uma multipipeta de 8 canais e adaptando o protocolo de acordo. Por exemplo, resultados preliminares para quatro cepas por dia com 12 concentrações de indutor e quatro tempos-pontos foram adquiridos dessa maneira.
- Prepare, com antecedência, 1 L de tampão de bioensaio (BA) misturando 0,5 g de triptona, 0,3 mL de glicerol, 5,8 g de NaCl, 50 mL de 1 M MgSO4, 1 ml de tampão fisiológico de fosfato (PBS) de 10x tamponado e 7,4 ml de água destilada dupla (DDW). Autoclave ou filtro estéril o tampão BA.
- Cresça as estirpes do duplo-Transformant em 37 ° c e 250 rpm que agitam em 1,5 mL LB com os antibióticos apropriados (kanamycin em uma concentração final de 25 μg/mL e Ampicillin em uma concentração final de 100 μg/mL), em placas de 48-well, durante um período de 18 h (durante a noite).
-
De manhã, faça os seguintes preparativos.
- Placa do indutor. Em uma placa limpa 96-well, prepare poços com meio semipobre (SPM) que consiste em 95% BA e em 5% LB26 na incubadora em 37 ° c. O número de poços corresponde ao número desejado de concentrações de indutor. Adicione C4-HSL aos poços na placa do indutor que conterá a concentração a mais elevada do indutor (218 nanômetro).
- Programe o robô para diluir serialmente o meio de cada um dos poços de maior concentração em 23 concentrações inferiores variando de 0 a 218 nM. O volume de cada diluição do indutor deve ser suficiente para todas as estirpes (incluindo duplicatas).
- Enquanto as diluições do indutor estão sendo preparadas, aqueça 180 μL de SPM na incubadora em 37 ° c, em placas de 96 poços.
- Diluir as cepas da noite da etapa 2,2 por um fator de 100 por diluições seriais: primeiro diluir por um fator de 10, misturando 100 μL de bactérias com 900 μL de SPM em placas de 48 poços, e depois diluir novamente por um fator de 10, tomando 20 μL da solução diluída em 180 μL de SPM pré-aquecido, em placas de 96 poços adequadas para medições fluorescentes.
- Adicione o indutor diluído da placa do indutor às placas 96-well com as tensões diluídas de acordo com as concentrações finais.
- Agite as placas 96-well em 37 ° c por 6 h, ao tomar medidas da densidade ótica em 595 nanômetro (OD595), em mcherry (560 nm/612 nanômetro) e em fluorescência de mCerulean (460 nm/510 nanômetro) através de um leitor da placa cada 30 minutos. Para fins de normalização, medir o crescimento de SMP sem células adicionadas.
3. análise preliminar dos resultados
- Para cada dia de experimento, escolha um intervalo de tempo de crescimento logarítmico de acordo com as curvas de crescimento medido, entre a fase de crescimento linear e a estacionária (T0, tfinal). Tome aproximadamente 6 − 8 pontos de tempo, ao descartar a primeira e a última medida para evitar o erro derivado da inexatidão da deteção exponencial do crescimento (veja Figura 2a, painel superior).
Nota: Descarte as cepas que mostram curvas de crescimento anormais ou cepas em que a fase de crescimento logarítmico não pôde ser detectada e repetia o experimento. -
Calcule a fluorescência normalizada média de mCerulean e a taxa de produção de mCherry, a partir dos dados brutos de fluorescência mCerulean e mCherry para cada concentração de indutor (Figura 2a).
- Calcule mCerulean normalizado como segue:
onde em branco (mCerulean) é o nível de mCerulean [u.a.] para o meio somente, o espaço em branco (OD) é a densidade ótica para o meio somente, e o mCerulean e o OD são os valores da fluorescência e da densidade ótica de mCerulean, respectivamente. - MCerulean médio sobre os pontos diferentes do tempo (Figura 2b, os dois painéis superiores) como segue:
onde #Time pontos é o número de temporais dados tidos em conta, t0 é o tempo em que começa a fase de crescimento exponencial, e tfinal é o tempo em que termina a fase de crescimento exponencial. - Calcule a taxa de produção de mCherry (Figura 2b, dois painéis inferiores) da seguinte forma:
onde mCherry (t) é o nível de mCherry [u.a.] no tempo t, OD é o valor de densidade óptica, T0 é o tempo em que a fase de crescimento exponencial começa, e tfinal é o tempo em que a fase de crescimento exponencial termina.
- Calcule mCerulean normalizado como segue:
- Por fim, traçar a taxa de produção de mCherry em função de mCerulean, criando curvas de resposta de dose em função da fluorescência de fusão RBP-mCerulean (Figura 2C). Tais parcelas representam a produção do gene repórter em função da presença de RBP na célula.
4. função de resposta da dose rotina de encaixe e extração de KRBP
- a suposição que a taxa Ribossoma de tradução com o limite de RBP é constante, modela a taxa de produção de mcherry como segue (veja Figura 2D, linha verde):
onde [x] é a fluorescência mCerulean média normalizada calculada de acordo com EQ. 2, taxa de produção de mCherry é o valor calculado de acordo com EQ. 3, KRBP é a afinidade de ligação relativa [u.a.], knão acoplado é a taxa Ribossome de Tradução com a RBP não acoplada, n é o fator de cooperatividade, e C é a fluorescência de base [u.a.]. C, n, Knão acoplado, e kRBP são encontrados ajustando os dados da taxa de produção de mcherry ao modelo (EQ. 4). - Usando o software da análise de dados, conduza um procedimento apropriado nos lotes que descrevem a taxa de produção de mCherry em função da média mCerulean (etapa 3,3), e extraia os parâmetros do ajuste de acordo com a fórmula em EQ. 4.
Nota: Somente os resultados de encaixe com R2 > 0,6 são tomados em consideração. Para esses ajustes, o erro de KRBP é principalmente na faixa de 0,5% a 20% dos valores de kRBP , para um intervalo de confiança de 0,67, enquanto aqueles com maior erro de kRBP também podem ser verificados por olho. - Normalize os valores de KRBP pelo respectivo valor máximo de mCerulean média para cada função dose-resposta.
onde KRBP em [u.a.] é o valor extraído do procedimento de encaixe em EQ. 4, e Max (mcerulean média) é o sinal mcerulean de média máxima [a. u] observado para a tensão atual.
Nota: A normalização facilita a comparação correta do efeito regulatório entre as cepas, eliminando a dependência dos níveis máximos de expressão de RBP específicos.
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Representative Results
O método apresentado utiliza a competição entre uma RBP e o Ribossome para ligação à molécula de mRNA (Figura 1). Esta competição é refletida pela diminuição dos níveis de mCherry em função do aumento da produção de RBP-mCerulean, devido ao aumento das concentrações de indutor. No caso de aumento da fluorescência de mCerulean, sem alterações significativas em mCherry, a falta de ligação à RBP é deduzada. Os resultados representativos para uma cepa positiva e negativa são representados na Figura 2. Na Figura 2a, os canais OD, Mcherry e mCerulean são apresentados em função do tempo e do indutor ao longo de uma faixa de quatro horas, com t0 = 1 h e tfinal = 3,5 h. Na Figura 2b, a fluorescência mCerulean média (superior) e a taxa de produção de mcherry (fundo) são apresentadas em função da concentração de indutor, para as duas cepas de exemplo. Como se pode observar, os resultados de uma cepa positiva exibem um efeito de regulação clara na taxa de produção de mcherry (Figura 2b, C), que se traduz em um valor não-zero significativo de KRBP (Figura 2D). Para a cepa positiva, o procedimento de encaixe rendeu os seguintes valores: kRBP = 394,6 u.a., knão acoplado = 275,6, n = 2,1, C = 11,2 u.a. e R2 = 0,93. Após a normalização pela fluorescência máxima de mCerulean, o valor de KRBP era 0,24. Para a cepa negativa, observou-se falta de resposta distinta (Figura 2C), e nenhum valor de KRBP foi extraído (Figura 2D).
Na Figura 3, apresentamos os resultados deste ensaio para dois fago Coat rbps, PP7 e MS2, em vários sítios de ligação mutado, em diferentes locais dentro da região de iniciação do mRNA de mcherry. Os resultados são grosseiramente classificados em três tipos de respostas (Figura 3a): cepas exibindo um efeito de regulação para baixo em um nível baixo de mCerulean, refletindo um baixo valor de KRBP (alta afinidade de ligação); cepas que exibem efeito regulatório para baixo em níveis intermediários ou altos de mCerulean, refletindo um valor elevado de KRBP (intermediário ou de baixa afinidade); e cepas que não exibem resposta distinta aos níveis crescentes de mCerulean, refletindo um valor maior de KRBP do que a concentração máxima de RBP na célula (sem afinidade de ligação detectível). A Figura 3B apresenta o valor mínimo de KRBP calculado para cada combinação de RBP − Binding-site com base em todas as combinações dos dois rbps e dez locais de ligação em posições diferentes. Os sites de vinculação incluem um controle negativo (sem site obrigatório), sites de ligação não correspondentes e um controle positivo ― o local de ligação nativa para cada RBP (PP7-WT para proteína de revestimento PP7 [PCP] e MS2-WT para proteína de revestimento MS2 [MCP]). Os resultados correspondem às previsões, pois ambos os RBPs apresentam uma alta afinidade para seus controles positivos e uma afinidade de vinculação não detectível para os controles negativos. Adicionalmente, estudos prévios que utilizam esses dois rbps27,28 observaram que são ortogonais, o que é claramente transmitido no mapa de calor apresentado: tanto o MCP quanto o PCP não ligam o local nativo da outra RBP. Além disso, os sites de vinculação mutado apresentam resultados variados, onde alguns sites vinculativos apresentaram um nível semelhante de afinidade como o do site nativo, como PP7-Mut-1, PP7-Mut-2 e MS2-MUT-3, enquanto outros exibiam uma afinidade significativamente menor, como PP7-MUT-3 e MS2-Mut-2. Assim, o ensaio apresentou uma medida quantitativa in vivo da afinidade vinculativa de RBPs, produzindo resultados comparáveis aos de experimentos passados com esses RBPs.
Uma vez que o ensaio é baseado na repressão do gene mCherry, é necessário um sinal de mCherry viável. Portanto, ao projetar o gravador de site de ligação, há duas regras de design para manter em mente. Primeiramente, o frame de leitura aberto (ORF) do mCherry deve ser mantido. Uma vez que o comprimento do local de ligação pode variar, inseri-lo no gene pode causar uma mudança de uma ou duas bases do original mCherry ORF. Portanto, se necessário (figura 4a), insira uma ou duas bases imediatamente downstream para o site de vinculação. Por exemplo, um site de ligação que é 20-base longa, com um δ de duas bases, produzirá uma adição de 22 bases para o gene mCherry. Para manter o ORF, nós precisamos de adicionar duas bases, para um total de 24 bases. A segunda régua do projeto é evitar inserções de códons da parada no mcherry ORF. Alguns locais obrigatórios, como o MS2-Mut-2 (Figura 4B, Inset), contêm codões de parada quando posicionados em um ou mais dos três ORFS possíveis. Tal exemplo é ilustrado na figura 4a, onde o site de vinculação continha um Codon de parada que está em-quadro com o MCHERRY ORF somente quando não há bases são adicionadas. Como pode ser observado na curva dose-resposta para essa posição (Figura 4B), a taxa de produção de mcherry foi indetectável, portanto a afinidade de ligação não pôde ser mensurada.
Um olhar mais atento na Figura 4B demonstra o efeito do espaçamento δ na produção de mcherry. Por exemplo, para δ = 4, a taxa de produção basal foi um fator de seis mais do que aqueles para δ = 5, assegurando um maior efeito de rebaixação. Para δ = 14, no entanto, os níveis de produção basal foram muito baixos para observar um efeito de regulação para baixo.
Figura 1: visão geral do projeto do sistema e etapas de clonagem. Ilustração do projeto da gaveta para o plasmídeo obrigatório do local (esquerdo) e do plasmídeo RBP-mcerulean (direito). A etapa seguinte é transformações consecutivas de ambos os plasmídeos em pilhas competentes de E. coli , com plasmídeos de RBP primeiramente. Os duplo-transformants são testados então para seus níveis da expressão de mCherry em concentrações crescentes do indutor; se a RBP se liga ao local de ligação, os níveis de mCherry diminuem em função de mCerulean (bolha cinzenta). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: esquema de análise. (A) parcelas tridimensionais (3D) que descrevem níveis de OD crus (parte superior), fluorescência de mCerulean (meio), e fluorescência de mcherry (parte inferior) em função do tempo e da concentração do indutor, para uma tensão positiva. (B) parte superior: os níveis de expressão de estado estacionário de mCerulean para cada concentração do indutor são computados dividindo cada nível da fluorescência pelo OD respectivo e calculando a média sobre todos os valores na janela exponencial do tempo de crescimento de 2 − 3 h para o positivo (esquerdo) e negativos (à direita). Parte inferior: taxa de produção de mCherry computada de acordo com EQ. 3 para tempo-pontos 2 − 3 h após a indução. (C) taxa de produção de mcherry plotada em função da média da fluorescência de mCerulean em média em duas duplicatas biológicas para duas cepas. As barras de erro são o desvio padrão da taxa de produção de mCherry e a fluorescência mCerulean média adquirida de pelo menos duas repetições. (D) ajuste para KRBP usando a fórmula de encaixe em EQ. 4 mostrada para a tensão positiva (esquerda), exibindo uma resposta de ligação específica. Para a deformação negativa (direita), nenhum valor de KRBP foi extraído. Os dados são mostrados em duplicado. Este número foi adaptado com permissão de Katz et al.10. Copyright 2018 sociedade química americana. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados finais representativos. (A) curvas de dose-resposta normalizadas para trinta cepas diferentes com base em dois rbps e dez sítios de ligação em diferentes locais. Três tipos de respostas são observadas: alta afinidade, baixa afinidade e sem afinidade. (B) resultados quantitativos de KRBP para dois rbps (MCP e PCP) com cinco fitas de local de ligação diferentes (listadas). Todas as cepas de RBP − Binding-site foram medidas em duplicata. Este número foi adaptado com permissão de Katz et al.10. Copyright 2018 sociedade química americana. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: exemplo de design e resultados para MCP com um site de ligação mutante. (A) ilustração do projeto das gavetas do local obrigatório em quatro posições diferentes. A gaveta que inclui o local obrigatório do Ribossoma, Codon do começo para o mcherry, δ bases do espaçador, o local obrigatório testou, uma ou dois bases para manter o ORF, e o descanso do gene de mcherry. Estrelas vermelhas indicam um Codon de parada. (B) curvas dose-resposta para MCP com um local de ligação mutante em quatro locais diferentes. Inset: a seqüência do site de ligação mutado testado. Os resultados apresentados são para duplicatas de cada cepa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | Localização do site binidng, A em agosto = 1 | Sequência de site de vinculação (RBS para controles) | Local: ATG ao segundo Codon GTG de mCherry Controles: RBS ao segundo Codon GTG de mCherry |
Fonte |
| MS2_wt_d5 | 5 | acatgaggattacccatgt | atgcacatgaggattacccatgtcgtg | Gen9 Inc. |
| MS2_wt_d6 | 6 | acatgaggattacccatgt | atggcacatgaggattacccatgtgtg | Gen9 Inc. |
| MS2_wt_d8 | 8 | acatgaggattacccatgt | atggcgcacatgaggattacccatgt cgtg |
Gen9 Inc. |
| MS2_wt_d9 | 9 | acatgaggattacccatgt | atggcgccacatgaggattacccatg tgtg |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) C_d8 | 8 | acatgaggatcacccatgt | atgcacatgaggatcacccatgtgg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) C_d9 | 9 | acatgaggatcacccatgt | atggcacatgaggatcacccatgtg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) C_d8 | 8 | acatgaggatgacccatgt | atgcacatgaggatgacccatgtgg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) G_d9 | 9 | acatgaggatgacccatgt | atggcacatgaggatgacccatgtg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_struct_d9 | 9 | cacaagaggttcacttatg | atggccacaagaggttcacttatgg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_struct_d8 | 8 | cacaagaggttcacttatg | atgccacaagaggttcacttatggg Tg |
Gen9 Inc. |
| PP7wt_d5' | 5 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgctaaggagtttatatggaaacc cttacgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7wt_d6' | 6 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgaataaggagtttatatggaaac o ccttagtg |
Torção Bioscience |
| PP7wt_d8' | 8 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgaacataaggagtttatatggaa acccttacgtg |
Torção Bioscience |
| PP7wt_d9' | 9 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgaacaataaggagtttatatgga aacccttagtg |
Torção Bioscience |
| PP7_USLSBm_d6 | 6 | taaccgctttatatggaaagggtta | atggctaaccgctttatatggaaag ggttagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_USLSBm_d15 | 15 | taaccgctttatatggaaagggtta | atgggcgccggcgctaaccgcttta tatggaaagggttagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_nB_d5 | 5 | taagggtttatatggaaaccctta | atgctaagggtttatatggaaaccc o ttagcgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_nB_d6 | 6 | taagggtttatatggaaaccctta | atggctaagggtttatatggaaacc cttatgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_USs_d5 | 5 | taaggagttatatggaaccctta | atgctaaggagttatatggaaccct o tagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_USs_d6 | 6 | taaggagttatatggaaccctta | atggctaaggagttatatggaaccc o ttagcgtg |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d1 | - | - | ttaaagaggagaaaggtaccatgg Tg |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d4 | - | - | ttaaagaggagaaaggtaccatgg o gcgtg |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d10 | - | - | ttaaagaggagaaaggtaccatgg gcgccggcgtg |
Gen9 Inc. |
| Sequenciamento de primer para fitas de local de ligação | gcatttttatccataagattagcgg | IDT | ||
| Sequenciamento primário para gavetas RBP | gcggcgctgggtctcatctaataa | IDT | ||
Tabela 1: locais obrigatórios e iniciadores de sequenciamento. Seqüências para os locais de ligação e as fitas de ligação do local usadas neste estudo, assim como os primers para as reações de sequenciamento detalhadas no protocolo (etapas 1.2.5.1 e 1.3.3).
| Nome RBP neste trabalho | nome do organismo de origem, proteína | gene do organismo de origem | organismo fonte RefSEQ | (alcoólicos) | alterações do peso (e referências) | AA Seq usado neste trabalho | NT Seq utilizados neste trabalho |
| Pcm | Vírus de Escherichia MS2 | Cp | NC_001417.2 | MASNFTQFVLV DNGGTGDVTV APSNFANGVA EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI KVEVPKVGGVELPVA Vatqt O AWRSYLNMEL TIPIFATNSD CELIVKAMQG LLKDGNPIPS AIAANSGIY |
DELF-G 1 V29I [1] tomado do plasmídeo 27121 do addgene |
MASNFTQFVLV DNGGTGDVTV APSNFANGIA EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI KVEVPKG O AWRSYLNMEL TIPIFATNSD CELIVKAMQG LLKDGNPIPS AIAANSGIY |
O ATGGCTTCTA ACTTTACTCA GTTCGTTCTC GTCGACAATG GCGGAACTGG O CGACGTGACT GTCGCCCCAA GCAACTTCGC TAACGGGATC GCTGAATGGA TCAGCTCTAA CTCGCGTTCA O CAGGCTTACA AAGTAACCTG TAGCGTTCGT O CAGAGCTCTG CGCAGAATCG CAAATACACC ATCAAAGTCG AGGTGCCTAA AGGCGCCTGG CGTTCGTACT TAAATATGGA ACTAACCATT CCAATTTTCG CCACGAATTC O CGACTGCGAG CTTATTGTTA AGGCAATGCA AGGTCTCCTA AAAGATGGAA ACCCGATTCC O CTCAGCAATC GCAGCAAACT CCGGCATCTAC |
| Pcp | Fago Pseudomonas PP7 | Cp | NC_001628.1 | MSKTIVLSVGEA O TRTLTEIQST O ADRQIFEEKV GPLVGRLRLT ASLRQNGAKT O AYRVNLKLDQ ADVVDCstsvc GElpkvrytq VWSHDVTIVA NSTEASRKSL YDLTKSLVAT SQVEDLVVNL O VPLGR |
delF-G [2] tomado do plasmídeo 40650 do addgene |
MLASKTIVLSVG EATRTLTEIQ O STADRQIFEE KVGPLVGRLR LTASLRQNGA KTAYRVNLKL DQADVVDSG LPKVRYTQVW SHDVTIVANS O TEASRKSLYD LTKSLVATSQ VEDLVVNLVP LGR |
ATGCTAGCCTC CAAAACCATC GTTCTTTCGG O TCGGCGAGGC O TACTCGCACT O CTGACTGAGA TCCAGTCCAC O CGCAGACCGT CAGATCTTCG AAGAGAAGGT CGGGCCTCTG GTGGGTCGGC TGCGCCTCAC GGCTTCGCTC CGTCAAAACG O GAGCCAAGAC MÉTODO CGCGTATCGC GTCAACCTAA AACTGGATCA GGCGGACGTC GTTGATTCCG O GACTTCCGAA AGTGCGCTAC O ACTCAGGTAT GGTCGCACGA CGTGACAATC GTTGCGAATA O GCACCGAGGC CTCGCGCAAA TCGTTGTACG ATTTGACCAA GTCCCTCGTC O GCGACCTCGC AGGTCGAAGA TCTTGTCGTC AACCTTGTGC CGCTGGGCCGT |
| Referências: | |||||||
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Tabela 2: Sequências de RBP. Sequências de aminoácidos e nucleotídeo das proteínas do revestimento utilizadas neste estudo.
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Discussion
O método descrito neste artigo facilita a medida in vivo quantitativa da afinidade obrigatória da RBP-RNA em pilhas de E. coli . O protocolo é relativamente fácil e pode ser conduzido sem o uso de maquinaria sofisticada, e a análise de dados é direta. Além disso, os resultados são produzidos imediatamente, sem o tempo de espera relativamente longo associado com os resultados de sequenciamento da próxima geração (NGS).
Uma limitação a este método é que trabalha somente em pilhas bacterianas. No entanto, um estudo anterior12 demonstrou um efeito de repressão usando uma abordagem semelhante para a RBP L7AE em células de mamíferos. Uma limitação adicional do método é que a inserção do local de ligação na região de iniciação de mcherry pode reprimir níveis basais de mcherry. A complexidade estrutural ou a alta estabilidade do local de ligação podem interferir na iniciação ribossômica mesmo na ausência de RBP, resultando em diminuição dos níveis basais de mCherry. Se os níveis basais são muito baixos, a repressão adicional provocada pelo aumento das concentrações de RBP não será observável. Nesse caso, é melhor projetar a gaveta do local de ligação com o local de ligação ainda na região de iniciação, mas à beira da transição da região de iniciação para a região de alongamento (δ no intervalo de 12 − 15 BP10,29). Nós mostramos que para tais valores do δ um efeito da repressão pode ainda ser observado. Para aumentar as chances de que o ensaio funcionará, independentemente da complexidade estrutural, aconselhamos a realização do ensaio em pelo menos três posições diferentes para um determinado local de ligação.
A principal desvantagem do método em comparação com os métodos in vitro, como a EMSA, é que a afinidade de ligação RBP-RNA não é medida em unidades absolutas de concentração de RBP, mas sim em termos de fluorescência Fusion-RBP. Esta desvantagem é um resultado direto da configuração in vivo, que limita a nossa capacidade de ler as concentrações reais de RBP. Esta desvantagem é compensada pelos benefícios da medição na configuração in vivo. Por exemplo, encontramos diferenças nas afinidades vinculantes ao comparar os resultados do nosso ensaio in vivo com os ensaios in vitro e in situ anteriores. Essas diferenças podem ser decorrentes de discrepâncias na estrutura das moléculas de mRNA in vivo que emergem de sua presença dentro das células10,11,30,31. Tais diferenças estruturais podem levar a mudanças na estabilidade dos Estados dobrados in vivo que, por sua vez, estabilizam ou desestabilizam a ligação da RBP.
Como o método é relativamente simples e barato, aconselhamos a execução de vários controles ao lado do experimento real. Executar um controle negativo, ou seja, uma seqüência que não tem afinidade com a RBP ainda tem características estruturais semelhantes, pode ajudar a evitar falsos positivos decorrentes de interações não específicas com o mRNA. Nos resultados representativos mostrados, os dois controles negativos eram o gene de mCherry sozinho (nenhum local obrigatório), e o local obrigatório nativo do outro RBP (isto é, PP7-WT para MCP e MS2-WT para PCP). Além disso, propomos incorporar um controle positivo (como uma RBP e seu local de ligação nativa). Tal controle ajudará a quantificar a afinidade vinculante, apresentando um ponto de referência, e evitando falsos negativos decorrentes da baixa repressão.
Por fim, para aqueles que desejam obter uma perspectiva estrutural da ligação RBP-RNA, propomos a realização de uma acilação seletiva de 2 ′-hidroxila analisada por sequenciamento de extensão de primer (Shape-Seq)11,32,33 Experiência. Shape-seq é uma aproximação de NGS combinada com o sondagem químico do RNA, que pode ser usado para estimar a estrutura secundária do RNA assim como interações do RNA com outras moléculas, tais como proteínas. Em nosso trabalho anterior realizamos um experimento Shape-Seq em uma cepa representativa em ambas as condições in vivo34 e in vitro com proteína recombinante purificada10,35. Em nosso caso, os resultados revelaram que a RBP-ligação afetou um segmento muito mais largo do RNA do que relatado previamente para estes RBPs in vitro36.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este projeto recebeu financiamento do programa I-CORE do Comitê de planejamento e orçamento e da Fundação de ciência de Israel (Grant no. 152/11), Marie Curie reintegration Grant no. PCIG11-GA-2012-321675, e do programa Horizonte 2020 de investigação e inovação da União Europeia, a Convenção de subvenção n. º 664918-MRG-gramática.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8-lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| Glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| Incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| Ligase | NEB | B0202S | |
| Liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| Multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| Platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| Sodium Chloride (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
References
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