Summary
Dans cette méthode, nous quantifions l'affinité de liaison des protéines de liaison d'ARN (RBPs) aux emplacements de liaison de cognate et non-cognate utilisant un simple, vivant, test de journaliste dans les cellules bactériennes. L'exemple est basé sur la répression d'un gène journaliste.
Abstract
Dans l'étape d'initiation de la traduction de protéine, le ribosome se lie à la région d'initiation de l'ARNm. L'initiation à la traduction peut être bloquée par la liaison d'une protéine de liaison de l'ARN (RBP) à la région d'initiation de l'ARNm, qui interfère avec la liaison ribosome. Dans la méthode présentée, nous utilisons ce phénomène de blocage pour quantifier l'affinité contraignante des RRP à leurs sites de liaison cognate et non cognate. Pour ce faire, nous insérons un site de liaison de test dans la région d'initiation d'un ARNm journaliste et induisons l'expression du test RBP. Dans le cas de la liaison RBP-ARN, nous avons observé une répression sigmoïdale de l'expression du journaliste en fonction de la concentration du RBP. Dans le cas de l'absence d'affinité ou d'une très faible affinité entre le site de liaison et le RBP, aucune répression significative n'a été observée. La méthode est réalisée dans des cellules bactériennes vivantes, et ne nécessite pas de machinerie coûteuse ou sophistiquée. Il est utile pour quantifier et comparer entre les affinités de liaison de différents RBP qui sont fonctionnels dans les bactéries à un ensemble de sites de liaison conçus. Cette méthode peut être inappropriée pour lier les sites à forte complexité structurelle. Cela est dû à la possibilité de répression de l'initiation ribosomale par la structure complexe de l'ARNm en l'absence de RBP, ce qui se traduirait par une expression plus faible du gène journaliste basique, et donc moins observable journaliste répression sur RBP liaison.
Introduction
La régulation post-transcriptionnelle basée sur la protéine de liaison d'ARN (RBP), spécifiquement la caractérisation de l'interaction entre RBPs et ARN, a été étudiée intensivement au cours des dernières décennies. Il existe de multiples exemples de régulation translationnelle des bactéries provenant de RRP inhibant, ou en concurrence directe avec, la liaison ribosome1,2,3. Dans le domaine de la biologie synthétique, les interactions RBP-ARN apparaissent comme un outil important pour la conception de circuits génétiques basés sur la transcription4,5. Par conséquent, il y a une augmentation de la demande pour la caractérisation de telles interactions RBP-ARN dans un contexte cellulaire.
Les méthodes les plus courantes pour étudier les interactions protéine-ARN sont l'analyse de changement de mobilité électrophorétique (EMSA)6, qui est limitée aux paramètres in vitro, et divers essais de tractionvers lebas 7 , y compris la méthode CLIP8,9 . Bien que ces méthodes permettent la découverte de sites de liaison de l'ARN de novo, elles souffrent d'inconvénients tels que des protocoles à forte intensité de main-d'œuvre et des réactions coûteuses de séquençage profond et peuvent nécessiter un anticorps spécifique pour le retrait du RBP. En raison de la nature sensible de l'ARN à son environnement, de nombreux facteurs peuvent affecter les interactions RBP-ARN, soulignant l'importance d'interroger la liaison RBP-ARN dans le contexte cellulaire. Par exemple, nous et d'autres avons démontré des différences significatives entre les structures de l'ARN in vivo et in vitro10,11.
Basé sur l'approche d'une étude précédente12, nous avons récemment démontré10 que lors du placement de sites de liaison pré-conçus pour les RRP capsides des bactériophages GA13, MS214, PP715, et Q16 dans le région d'initiation de traduction d'un ARNm de journaliste, l'expression de journaliste est fortement réprimée. Nous présentons une méthode relativement simple et quantitative, basée sur ce phénomène de répression, pour mesurer l'affinité entre les RBP et leur site de liaison d'ARN correspondantin vivo.
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Protocol
1. Préparation du système
- Conception de plasmides de site de liaison
- Concevoir la cassette du site de liaison telle qu'elle est représentée dans la figure 1. Chaque minigène contient les parties suivantes (5' à 3') : site de restriction d'Eagl, 40 bases de l'extrémité 5' du gène de résistance de kanamycine (Kan), promoteur de pLac-Ara, site de liaison de ribosome (RBS), AUG du gène mCherry, un espaceur () un site de liaison DeBP, 80 bases de la fin de 5' du gène mCherry, et un site de restriction ApaLI.
REMARQUE: Pour augmenter le taux de réussite de l'assiduité, concevez trois cassettes de site de liaison pour chaque site de liaison, avec des espaceurs composés d'au moins une, deux et trois bases. Voir la section Résultats représentatifs pour d'autres lignes directrices.
- Concevoir la cassette du site de liaison telle qu'elle est représentée dans la figure 1. Chaque minigène contient les parties suivantes (5' à 3') : site de restriction d'Eagl, 40 bases de l'extrémité 5' du gène de résistance de kanamycine (Kan), promoteur de pLac-Ara, site de liaison de ribosome (RBS), AUG du gène mCherry, un espaceur () un site de liaison DeBP, 80 bases de la fin de 5' du gène mCherry, et un site de restriction ApaLI.
- Clonage des plasmides de site de liaison
- Commandez les cassettes de site de liaison en minigènes à double brin d'ADN (ADN d'ADN). Chaque minigène mesure 500 pb de long et contient un site de restriction Eagl et un site de restriction ApaLI aux extrémités de 5' et 3' respectivement (voir l'étape 1.1.1).
REMARQUE: Dans cette expérience, des mini-gènes avec la moitié du gène de la kanamycine ont été ordonnés pour faciliter le dépistage des colonies positives. Cependant, l'assemblage Gibson17 est également approprié ici, auquel cas le site de liaison peut être commandé comme deux oligos complémentaires plus courts d'ADN simple brin. - Double-digérer à la fois les mini-gènes et le vecteur cible avec Eagl-HF et ApaLI par le protocole de restriction18, et la colonne purifier19.
- Ligate les minigènes digérés à l'épine dorsale du site de liaison contenant le reste du gène journaliste mCherry, terminator, et un gène de résistance à la kanamycine20.
- Transformez la solution de ligation en cellules EScherichia coli TOP1021.
- Identifier les transformateurs positifs par séquençage Sanger.
- Concevoir une amorce 100 bases en amont de la région d'intérêt (voir tableau 1 pour les séquences d'amorce).
- Miniprep quelques colonies bactériennes22.
- Préparer 5 ll d'une solution de 5 mM de l'amorce et 10 l de l'ADN à une concentration de 80 ng/L.
- Envoyer les deux solutions à une installation pratique pour le séquençage Sanger23.
- Entreposez les plasmides purifiés à -20 oC, et les souches bactériennes sous forme de stocks de glycérol24, tous deux dans le format 96 puits. L'ADN sera ensuite utilisé pour la transformation en cellules E. coli TOP10 contenant l'un des quatre plasmides fusion-RBP (voir l'étape 1.3.5).
- Commandez les cassettes de site de liaison en minigènes à double brin d'ADN (ADN d'ADN). Chaque minigène mesure 500 pb de long et contient un site de restriction Eagl et un site de restriction ApaLI aux extrémités de 5' et 3' respectivement (voir l'étape 1.1.1).
- Conception et construction du plasmide RBP
REMARQUE: Les séquences d'acide aminé et de nucléotide des protéines de couche utilisées dans cette étude sont énumérées dans le tableau 2.- Commandez la séquence RBP requise sans codon d'arrêt en tant que minigène d'ADN personnalisé dépourvu d'un codon d'arrêt avec des sites de restriction aux extrémités (Figure 1).
- Cloner le RBP testé sans codon d'arrêt immédiatement en aval d'un promoteur inductible et en amont d'une protéine fluorescente dépourvue d'un codon de départ (figure 1), semblable aux étapes 1.2.2-1.2.4. Assurez-vous que le plasmide RBP contient un gène de résistance aux antibiotiques différent du plasmide du site de liaison.
- Identifier les transformants positifs par séquençage Sanger, semblable à l'étape 1.2.5 (voir le tableau 1 pour les séquences d'apprêt).
- Choisissez un transformateur positif et le rendre chimiquement compétent25. Conservez sous forme de plasmides purifiés au glycérol à -20 oC et en stocks de glycérol de souches bactériennes24 à -80 oC dans des assiettes de 96 puits.
- Transformez les plasmides du site de liaison (à partir de l'étape 1.2.6) stockés dans des plaques de 96 puits en cellules bactériennes chimiquement compétentes contenant déjà un plasmide RBP-mCerulean21. Pour gagner du temps, au lieu de placage les cellules sur les plats Petri, les plaquer à l'aide d'un pipettor à 8 canaux sur des plaques à 8 voies contenant Luria-Bertani (LB)26 agar avec des antibiotiques pertinents (Kan et Amp). Les colonies devraient apparaître en 16 h.
- Sélectionnez une seule colonie pour chaque double transformateur et poussez du jour au lendemain dans le milieu LB avec les antibiotiques pertinents (Kan et Amp) et entreposez les stocks de glycérol24 à -80 oC dans des assiettes de 96 puits.
2. Configuration d'expérience
REMARQUE: Le protocole présenté ici a été exécuté à l'aide d'un système robotique de manipulation liquide en combinaison avec un incubateur et un lecteur de plaque. Chaque mesure a été effectuée pour 24 concentrations d'inducteurs, avec deux doublons pour chaque combinaison souche et inducteur. À l'aide de ce système robotique, des données sur 16 souches par jour avec 24 concentrations d'inducteurs ont été recueillies. Toutefois, si un tel dispositif n'est pas disponible, ou si moins d'expériences sont nécessaires, ceux-ci peuvent facilement être faites à la main en utilisant un multi-pipette à 8 canaux et en adaptant le protocole en conséquence. Par exemple, les résultats préliminaires de quatre souches par jour avec 12 concentrations d'inducteurs et quatre points de temps ont été acquis de cette façon.
- Préparer, à l'avance, 1 L de tampon de bio-analyse (BA) en mélangeant 0,5 g de tryptone, 0,3 ml de glycérol, 5,8 g de NaCl, 50 ml de 1 M MgSO4, 1 mL de 10x tampon salin tamponné par phosphate (PBS) pH 7,4, et 950 mL d'eau distillée double (DDW). Filtre automatique ou stérile de la mémoire tampon BA.
- Cultivez les souches à double régime à 37 oC et 250 tr/min en secouant dans 1,5 mL lb avec des antibiotiques appropriés (kanamycine à une concentration finale de 25 g/mL et ampicilline à une concentration finale de 100 g/mL), dans des plaques de 48 puits, sur une période de 18 h (nuit).
-
Le matin, faites les préparatifs suivants.
- Plaque inducteur. Dans une assiette propre de 96 puits, préparer les puits avec un milieu semi-pauvre (SPM) composé de 95 % de BA et deLB 26 à 5 % dans l'incubateur à 37 oC. Le nombre de puits correspond au nombre souhaité de concentrations inducteurs. Ajouter c4-HSL aux puits de la plaque inducteur qui contiendra la plus forte concentration d'inducteurs (218 nM).
- Programmez le robot pour diluer en série le milieu de chacun des puits les plus à concentration élevée en 23 concentrations inférieures allant de 0 à 218 nM. Le volume de chaque dilution inducteur doit être suffisant pour toutes les souches (y compris les doublons).
- Pendant que les dilutions inducteurs sont en cours de préparation, réchauffez 180 L de SPM dans l'incubateur à 37 oC, dans des assiettes de 96 puits.
- Diluer les souches de nuit de l'étape 2.2 par un facteur de 100 par dilutions en série: diluer d'abord par un facteur de 10 en mélangeant 100 L de bactéries avec 900 L de SPM dans 48-puits plaques, puis diluer à nouveau par un facteur de 10 en prenant 20 L de la solution diluée dans 180 l de SPM pré-chauffé, dans des plaques de 96 puits adaptées aux mesures fluorescentes.
- Ajouter l'inducteur dilué de la plaque inducteur aux plaques de 96 puits avec les souches diluées selon les concentrations finales.
- Secouez les plaques de 96 puits à 37 oC pendant 6 h, tout en prenant des mesures de densité optique à 595 nm (OD595), mCherry (560 nm/612 nm) et mCerulean (460 nm/510 nm) fluorescence via un lecteur de plaque toutes les 30 min. Aux fins de normalisation, mesurez la croissance de SMP sans ajout de cellules.
3. Analyse préliminaire des résultats
- Pour chaque jour d'expérience, choisissez un intervalle de temps de croissance logarithmique en fonction des courbes de croissance mesurées, entre la phase de croissance linéaire et l'stationnaire (T0,T final). Prenez environ 6 à 8 points de temps, tout en rejetant les premières et dernières mesures pour éviter les erreurs découlant de l'inexactitude de la détection exponentielle de la croissance (voir la figure 2A, panneau supérieur).
REMARQUE: Jetez les souches qui présentent des courbes de croissance anormales ou des souches où la phase de croissance logarithmique n'a pas pu être détectée et répéter l'expérience. -
Calculer la fluorescence normalisée moyenne du mCerulean et le taux de production de mCherry, à partir des données brutes de fluorescence mCerulean et mCherry pour chaque concentration inducteure (Figure 2A).
- Calculer mCerulean normalisé comme suit:
où le blanc (mCerulean) est le niveau mCerulean [a.u.] pour le milieu seulement, blanc (OD) est la densité optique pour le milieu seulement, et le mCerulean et oD sont la fluorescence mCerulean et les valeurs de densité optique, respectivement. - Moyenne mCerulean sur les différents points de temps (Figure 2B, les deux premiers panneaux) comme suit:
lorsque #Time points est le nombre de points de temps de données pris en compte, T0 est le moment où la phase de croissance exponentielle commence, et Tfinal est le moment où la phase de croissance exponentielle se termine. - Calculer le taux de production de mCherry (Figure 2B, les deux panneaux inférieurs) comme suit :
où mCherry(t) est le niveau mCherry [a.u.] au moment t, OD est la valeur de densité optique, T0 est le moment où la phase de croissance exponentielle commence, et Tfinale est le moment où la phase de croissance exponentielle se termine.
- Calculer mCerulean normalisé comme suit:
- Enfin, tracez le taux de production de mCherry en fonction du mCerulean, en créant des courbes de réponse de dose en fonction de la fluorescence de fusion RBP-mCerulean (figure 2C). Ces parcelles représentent la production du gène reporter en fonction de la présence de RBP dans la cellule.
4. Dose Response Function Fitting Routine et KRBP Extraction
- En supposant que le taux de traduction de ribosome avec la limite RBP est constant, modélisez le taux de production de mCherry comme suit (voir figure 2D, ligne verte) :
où [x] est la fluorescence moyenne normalisée de mCerulean calculée selon Eq. 2, taux de production de mCherry est la valeur calculée selon Eq. 3, KRBP est l'affinité relative de liaison [a.u.], Kunbound est le taux de ribosome de traduction avec le RBP non lié, n est le facteur de coopérativité, et C est la fluorescence de base [a.u.]. C, n, Kunbound, et KRBP sont trouvés en adaptant les données de taux de production mCherry au modèle (Eq. 4). - À l'aide d'un logiciel d'analyse de données, effectuez une procédure d'ajustement sur les parcelles représentant le taux de production de mCherry en fonction de la moyenne mCerulean (étape 3.3), et extrayez les paramètres d'ajustement selon la formule de l'Eq. 4.
REMARQUE: Seuls les résultats d'ajustement avec R2 'gt; 0.6 sont pris en compte. Pour ces ajustements, l'erreur KRBP est principalement dans la gamme de 0,5% à 20% des valeurs KRBP, pour un intervalle de confiance de 0,67, tandis que ceux avec une erreur Plus élevée KRBP peut également être vérifié par l'œil. - Normalisez les valeurs KRBP par la valeur maximale respective du mCerulean moyen pour chaque fonction dose-réponse.
où KRBP dans [a.u.] est la valeur extraite de la procédure d'ajustement dans Eq. 4, et max (mCerulean moyen) est le signal mCerulean moyen maximal [a.u] observé pour la souche actuelle.
REMARQUE: La normalisation facilite la comparaison correcte de l'effet réglementaire entre les souches en éliminant la dépendance à l'égard des niveaux d'expression maximaux particuliers du RBP.
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Representative Results
La méthode présentée utilise la concurrence entre un RBP et le ribosome pour se lier à la molécule d'ARNm (Figure 1). Cette concurrence se reflète par la diminution des niveaux de mCherry en fonction de l'augmentation de la production de RBP-mCerulean, en raison de l'augmentation des concentrations d'inducteur. Dans le cas de l'augmentation de la fluorescence mCérulean, sans changements significatifs dans mCherry, un manque de liaison DeRBP est déduit. Les résultats représentatifs d'une souche positive et négative sont représentés à la figure 2. Dans la figure 2A, les canaux OD, mCherry et mCerulean sont présentés en fonction du temps et inducteurs sur une plage de quatre heures, avec T0 et 1 h et Tfinal 3,5 h. Dans la figure 2B, la fluorescence moyenne de mCérulean (en haut) et le taux de production de mCherry (en bas) sont présentés en fonction de la concentration inducteur, pour les deux souches d'exemple. Comme on peut le voir, les résultats d'une souche positive montrent un effet net de réduction de la réglementation dans le taux de production mCherry (Figure 2B, C), qui se traduit par une valeur non nulle significative de KRBP (Figure 2D). Pour la souche positive, la procédure d'ajustement a donné les valeurs suivantes: KRBP 394,6 a.u., Kunbound - 275,6, n - 2,1, C - 11,2 a.u., et R2 - 0,93. Après normalisation par la fluorescence mCerulean maximale, la valeur de KRBP était 0.24. Pour ce qui est de la souche négative, on a observé un manque de réponse distincte (figure 2C) et aucune valeur KRBP n'a été extraite (Figure 2D).
Dans la figure 3, nous présentons les résultats de cet analyse pour deux rRP de pelage de phage, PP7 et MS2, sur plusieurs emplacements de liaison mutés, à différents endroits dans la région d'initiation de l'ARNm mCherry. Les résultats sont à peu près classés en trois types de réponses (figure 3A): souches présentant un effet de régulation à un faible niveau de mCerulean, reflétant une faible valeur KRBP (affinité de liaison élevée); souches présentant un effet de régulation du duvet à des niveaux mCérulean séditiaux intermédiaires ou élevés, reflétant une valeur KRBP élevée (affinité intermédiaire ou faible); et les souches ne présentant aucune réponse distincte à l'élévation des niveaux de mCerulean, reflétant une valeur Plus élevée de KRBP que la concentration maximale de RBP dans la cellule (aucune affinité de liaison détectable). La figure 3B présente la valeur minimale de KRBP calculée pour chaque combinaison RBP-binding-site basée sur toutes les combinaisons des deux RBP et des dix sites de liaison à des positions différentes. Les sites de liaison comprennent un contrôle négatif (aucun site de liaison), des sites de liaison non assortis et un contrôle positif, le site de liaison indigène pour chaque RBP (PP7-wt pour la protéine de couche PP7 [PCP], et MS2-wt pour la protéine de couche MS2 [MCP]). Les résultats correspondent aux prédictions, car les deux RBP présentent une forte affinité pour leurs contrôles positifs, et une affinité de liaison non détectable pour les contrôles négatifs. En outre, des études antérieures utilisant ces deux RBPs27,28 ont observé qu'ils sont orthogonaux, ce qui est clairement véhiculé dans la carte thermique présentée: les deux MCP et PCP ne lient pas le site indigène de l'autre RBP. En outre, les sites de liaison mutés présentent des résultats variables, où certains sites de liaison affichaient un niveau d'affinité similaire à celui du site natif, comme PP7-mut-1, PP7-mut-2 et MS2-mut-3, tandis que d'autres affichaient une affinité significativement plus faible, comme PP7-mut-3 et MS2-mut-2. Ainsi, l'essai a présenté une mesure quantitative in vivo de l'affinité contraignante des RRP, donnant des résultats qui sont comparables à ceux des expériences passées avec ces RBPs.
Étant donné que l'astodonte est basé sur la répression du gène mCherry, un signal mCherry viable est nécessaire. Par conséquent, lors de la conception de la cassette du site de liaison, il ya deux règles de conception à garder à l'esprit. Tout d'abord, le cadre de lecture ouverte (ORF) de la mCherry doit être conservé. Étant donné que la longueur du site de liaison peut varier, l'insérer dans le gène peut provoquer un déplacement d'une ou deux bases par rapport à l'ORF mCherry d'origine. Par conséquent, si nécessaire (figure 4A), insérez une ou deux bases immédiatement en aval du site de liaison. Par exemple, un site de liaison de 20 bases de long, avec un ' de deux bases, donnera un ajout de 22 bases au gène mCherry. Pour conserver l'ORF, nous devons ajouter deux bases, pour un total de 24 bases. La deuxième règle de conception est d'éviter les insertions de codons d'arrêt dans le mCherry ORF. Certains sites de liaison, comme le MS2-mut-2 (figure4B, enchet), contiennent des codons d'arrêt lorsqu'ils sont placés dans un ou plusieurs des trois ORF possibles. Un tel exemple est illustré dans la figure 4A, où le site de liaison contenait un codon d'arrêt qui est dans le cadre avec le mCherry ORF seulement quand aucune base n'est ajoutée. Comme on peut le voir dans la courbe dose-réponse pour cette position (figure 4B), le taux de production de mCherry était indétectable, de ce fait l'affinité de liaison n'a pas pu être mesurée.
Un examen plus attentif de la figure 4B démontre l'effet de l'espacement sur la production de mCherry. Par exemple, pour le taux de production basale de 4, le taux de production basale a été un facteur de six de plus que celui de 5, ce qui a assuré un effet de répression des plis plus élevé. Toutefois, pour 14, les niveaux de production basale étaient trop faibles pour observer un effet de régulation à la baisse.
Figure 1 : Aperçu de la conception du système et des étapes de clonage. Illustration de la conception de la cassette pour le plasmide du site de liaison (à gauche) et le plasmide RBP-mCerulean (à droite). L'étape suivante consiste à transformer les deux plasmides en cellules E. coli compétentes, avec d'abord des plasmides RBP. Les doubles transformateurs sont ensuite testés pour leurs niveaux d'expression mCherry dans l'augmentation des concentrations inducteurs; si le RBP se lie au site de liaison, les niveaux de mCherry diminuent en fonction du mCerulean (bulle grise). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Système d'analyse. (A) Diagrammes tridimensionnels (3D) représentant les niveaux bruts d'OD (en haut), la fluorescence mCérulean (milieu) et la fluorescence mCherry (en bas) en fonction du temps et de la concentration inducteur, pour une souche positive. (B) Haut : les niveaux d'expression à l'état stable mCerulean pour chaque concentration inducteur sont calculés en divisant chaque niveau de fluorescence par l'OD respectif et en moyenne sur toutes les valeurs dans la fenêtre de temps de croissance exponentielle de 2 à 3 h pour le positif (gauche) et les souches négatives (droite). En bas : taux de production mCherry calculé selon Eq. 3 pour les points de temps de 2 à 3 h après l'induction. (C) taux de production mCherry tracé en fonction de la fluorescence moyenne mCérulean moyenne sur deux doublons biologiques pour deux souches. Les barres d'erreur sont un écart standard du taux de production de mCherry et de la fluorescence mCéruleenne moyenne acquise à partir d'au moins deux répliques. (D) Fit for KRBP using the fitting formula in Eq. 4 showed for the positive strain (left), exhibiting a specific binding response. Pour la souche négative (à droite), aucune valeur KRBP n'a été extraite. Les données sont affichées en double. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Katz et coll.10. Copyright 2018 American Chemical Society. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Résultats définitifs représentatifs. (A) Courbes dose-réponse normalisées pour trente souches différentes basées sur deux RBP et dix sites de liaison à différents endroits. Trois types de réponses sont observés : une affinité élevée, une faible affinité et aucune affinité. (B) Résultats quantitatifs KRBP pour deux RBP (MCP et PCP) avec cinq cassettes de sites de liaison différentes (listées). Toutes les souches de site de liaison RBP ont été mesurées en double. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Katz et coll.10. Copyright 2018 American Chemical Society. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Exemple de conception et de résultats pour MCP avec un site de liaison mutant. (A) Illustration de conception des cassettes de site de liaison dans quatre endroits différents. Cassette comprenant le site de liaison de ribosome, codon de démarrage pour le mCherry, les bases d'espaceur, le site de liaison testé, une ou deux bases pour maintenir l'ORF, et le reste du gène mCherry. Les étoiles rouges indiquent un codon d'arrêt. (B) Courbes dose-réponse pour MCP avec un site de liaison mutant à quatre endroits différents. Enset : séquence du site de liaison muté testé. Les résultats présentés sont pour les doublons de chaque souche. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| nom | Emplacement du site Binidng, A en AUG 1 | Séquence du site de liaison (RBS pour les contrôles) | Site: ATG to second mCherry codon GTG Contrôles: RBS à la deuxième mCherry codon GTG |
source |
| MS2-wt5 | 5 Annonces | acatgaggattacccatgt acatgaggattacccatgt | atgcacatgaggattacccatgtcgtg | Gen9 inc. |
| MS2-wt6 | 6 Annonces | acatgaggattacccatgt acatgaggattacccatgt | atggcacatgaggattacccatgtgtg | Gen9 inc. |
| MS2-wt8 | 8 Annonces | acatgaggattacccatgt acatgaggattacccatgt | atggcgcacatgaggattacccatgt cgtg (en) |
Gen9 inc. |
| MS2-wt9 | 9 (en) | acatgaggattacccatgt acatgaggattacccatgt | atggcgccacatgaggattacccatg tgtg tgtg |
Gen9 inc. |
| MS2-U(-5)C-d8 | 8 Annonces | acatgaggatcacccatgt acatgaggatcacccatgt | atgcacatgaggatcacccatgtgggg atgcacatgaggatcacccatgtgggg Tg |
Gen9 inc. |
| MS2-U(-5)C-d9 | 9 (en) | acatgaggatcacccatgt acatgaggatcacccatgt | atggcacatgaggatcacccatgtg Tg |
Gen9 inc. |
| MS2-U(-5)C-d8 | 8 Annonces | acatgaggatgacccatgt | atgcacatgaggatgacccatgtgggg Tg |
Gen9 inc. |
| MS2-U(-5)G-d9 | 9 (en) | acatgaggatgacccatgt | atggcacatgaggatgacccatgtg Tg |
Gen9 inc. |
| MS2-struct9 | 9 (en) | cacaagaggttcacttatg | atggccacagaggttcacttatgg Tg |
Gen9 inc. |
| MS2-struct8 | 8 Annonces | cacaagaggttcacttatg | atgccacaagaggttacttatggggg Tg |
Gen9 inc. |
| PP7wt-d5' | 5 Annonces | taaggagtttatatggaaaccctta taaggagtttatatggaaaccctta | atgctaaggagtttatatggaaaaacc cttacgtg (cttacgtg) |
Gen9 inc. |
| PP7wt-d6' | 6 Annonces | taaggagtttatatggaaaccctta taaggagtttatatggaaaccctta | atgaataaggagtttatatggaaac ccttagtg (en anglais) |
Bioscience Twist |
| PP7wt-d8' | 8 Annonces | taaggagtttatatggaaaccctta taaggagtttatatggaaaccctta | atgaacataaggagtttatatggaa acccttacgtg (en) |
Bioscience Twist |
| PP7wt-d9' | 9 (en) | taaggagtttatatggaaaccctta taaggagtttatatggaaaccctta | atgaacaataaggagtttatatgga aacccttagtg (aacccttagtg) |
Bioscience Twist |
| PP7-USLSBm-d6 | 6 Annonces | taaccgctttatatggaagggtta taaccgctttatatggggggtta taaccgctttatatggaagggtta taaccgct | atggctaaccgctttatatggaaag ggttagtg ggttagtg ggttagtg ggt |
Gen9 inc. |
| PP7-USLSBm-d15 | 15 Annonces | taaccgctttatatggaagggtta taaccgctttatatggggggtta taaccgctttatatggaagggtta taaccgct | atgggcgccggtaaccgcttta tatggaagggttagtg |
Gen9 inc. |
| PP7-nB-d5 | 5 Annonces | taagggtttatatggaaaccctta taagggtttatatggaaccctta taagggtttatatggaaaccctta | atgctaagggtttatatggaaaccc ttagcgtg (ttagcgtg) |
Gen9 inc. |
| PP7-nB-d6 | 6 Annonces | taagggtttatatggaaaccctta taagggtttatatggaaccctta taagggtttatatggaaaccctta | atggctaagggtttatatggaaaaacc cttatgtg (en anglais seulement) |
Gen9 inc. |
| PP7-USs5 | 5 Annonces | taaggagttatatggaaccctta taaggagttatatggaaccctta | atgctaaggagttatatggaaccct tagtg (en) |
Gen9 inc. |
| PP7-USs-d6 | 6 Annonces | taaggagttatatggaaccctta taaggagttatatggaaccctta | atggctaaggagttatatggaaccc ttagcgtg (ttagcgtg) |
Gen9 inc. |
| No-BS-d1 | - | - | ttaaagaggagaaggtacccatgg ttaaagaggagaaggtacccatgg ttaaagaggagaaggtacccatgg ttaaagaggaga Tg |
Gen9 inc. |
| No-BS-d4 | - | - | ttaaagaggagaaggtacccatgg ttaaagaggagaaggtacccatgg ttaaagaggagaaggtacccatgg ttaaagaggaga gcgtg gcgtg |
Gen9 inc. |
| No-BS-d10 | - | - | ttaaagaggagaaggtacccatgg ttaaagaggagaaggtacccatgg ttaaagaggagaaggtacccatgg ttaaagaggaga gcgccggcgtg gcgccggg |
Gen9 inc. |
| Apprêt de séquençage pour les cassettes de site de liaison | gcatttttatccataagattagcgg gcgg gcgg gcgg | Idt | ||
| Apprêt de séquençage pour cassettes RBP | gcggcgctgggtctcatctaataaa | Idt | ||
Tableau 1 : Sites de liaison et amorces de séquençage. Séquences pour les sites de liaison et cassettes de sites de liaison utilisées dans cette étude, ainsi que les amorces pour les réactions de séquençage détaillées dans le protocole (étapes 1.2.5.1 et 1.3.3).
| Nom du RBP dans ce travail | nom de l'organisme source, protéine | gène de l'organisme source | organisme source refseq | wt aa seq | changements de wt (et références) | aa seq utilisé dans ce travail | nt seq utilisé dans ce travail |
| Mcp | Virus Escherichia MS2 | cf | NC-001417.2 | MASNFTQFVVVV DNGGTGDVTV APSNFANGVA (en) EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ (en) SSAQNRKYTI KVEVPKVATQT VGGVELPVA AWRSYLNMEL (En) TIPIFATNSD CELIVKAMQG LLKDGNPIPS (en) AIAANSGIY (EN) |
delF-G [1] V29I [1] tiré de addgene plasmid 27121 |
MASNFTQFVVVV DNGGTGDVTV APSNFANGIA (en anglais seulement) EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ (en) SSAQNRKYTI KVEVPKG AWRSYLNMEL (En) TIPIFATNSD CELIVKAMQG LLKDGNPIPS (en) AIAANSGIY (EN) |
ATGGCTTCTA ACTTTACTCA ACTTTACTCA GTTCGTTCTCC GTCGACAATG GTCGACAATG GTCGACAATG GTCG GCGGAACTGG GCGGAACTGG CGACGTGACT GTCGCCCCAA GTCGCAA GCAACTTCGC (en) TAACGGGATC (en) GCTGAATGGA (en) TCAGCTCTAA CTCGCGTTCA CAGGCTTACA CAGGCTTACA CAGGCTTACA CAGG AAGTAACCTG (en anglais seulement) TAGCGTTCGT CAGAGCTCTG CGCAGAATCG CAAATACACC ATCAAAGTCG (en anglais seulement) AGGTGCCTAA AGGCGCCTGG (en) CGTTCGTACT CGT TAAATATGGA (en) ACTAACCATT ACTAACCATT ACTAACCATT CCAATTTTCG CCACGAATTC (en) CGACTGCGAG CTTATTGTTA AGGCAATGCA (en) AGGTCTCCTA AAAGATGGAAA AAAGATGGAAA AAAGATGGAA ACCCGATTCC (en anglais seulement) CTCAGCAATC (en) GCAGCAAACT GCAGCAAACT CCGGCATCTAC |
| PCP (PCP) | Pseudomonas phage PP7 | cf | NC 001628.1 | MSKTIVLSVGEA (en) TRTLTEIQST (en) ADRQIFEEKV (en) GPLVGRLRLT ASLRQNGAKT AYRVNLKLDQ (en) CSTSVC ADVVD GELPKVRYTQ VWSHDVTIVA NSTEASRKSL YDLTKSLVAT (en) SQVEDLVVNL VPLGR (en) |
delF-G [2] tiré de addgene plasmid 40650 |
MLASKTIVLSVG EATRTLTEIQ EATRTLTEIQ EATRTLTEIQ STADRQIFEE (en) KVGPLVGRLR (en) LTASLRQNGA KTAYRVNLKL K DQADVVDSG LPKVRYTQVW SHDVTIVANS (En) TEASRKSLYD (en) LTTKSLVATSQ (en) VEDLVVNLVP Lgr |
ATGCTAGCCTC (en anglais seulement) CAAAACCATC (EN) GTTCTTTCGG TCGGCGAGGC (en) TACTCGCACT (en) CTGACTGAGA (en) TCCAGTCCAC CGCAGACCGT CAGATCTTCG AAGAGAAGGT AAGAGAAGGT CGGGCCTCTG GTGGGTCGGC TGCGCCTCAC GGCTTCGCTC GGCTT CGTCAAAACG GAGCCAAGAC GAGCCAAGAC CGCGTATCGC GTCAACCTAA GTCAACCTAA GTCAACCTAA GTCA AACTGGATCA (En) GGCGGACGTC GGCGGACGTC GTTGATTCCG GTTGATTCCG GACTTCCGAA (en anglais seulement) AGTGCGCTAC (en anglais seulement) ACTCAGGTAT ACTCAGGTAT GGTCGCACGA GGTCGCACGA GGTCGCACGA CGTGACAATC CGTGACAATC CGTGACAATC GTTGCGAATA GTTGCGAATA GTTGCGAATA GTT GCACCGAGGC GCACCGAGGC GCACCGAGGC CTCGCGCAAAA TCGTTGTACG TCGTTGTACG ATTTGACCAA (en anglais seulement) GTCCCTCGTC GTCCCTCGTC GCGACCTCGC (en) AGGTCGAAGA TCTTGTCGTC TCTTGTCGTC AACCTTGTGC (en anglais seulement) CGCTGGGCCGT |
| Références: | |||||||
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Tableau 2 : Séquences RBP. Séquences d'acide aminé et de nucléotide des protéines de couche utilisées dans cette étude.
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Discussion
La méthode décrite dans cet article facilite la mesure in vivo quantitative de l'affinité de liaison RBP-ARN dans les cellules de E. coli. Le protocole est relativement facile et peut être effectué sans l'utilisation de machines sophistiquées, et l'analyse des données est simple. En outre, les résultats sont produits immédiatement, sans le temps d'attente relativement long associé aux résultats du séquençage de la prochaine génération (NGS).
Une limitation à cette méthode est qu'elle ne fonctionne que dans les cellules bactériennes. Cependant, une étude précédente12 a démontré un effet de répression en utilisant une approche similaire pour le RBP L7AE dans les cellules de mammifères. Une limitation supplémentaire de la méthode est que l'insertion du site de liaison dans la région d'initiation mCherry peut réprimer les niveaux basaux mCherry. La complexité structurelle ou la stabilité élevée du site de liaison peut interférer avec l'initiation ribosomal même en l'absence de RBP, ayant pour résultat des niveaux basaux de mCherry diminués. Si les niveaux de base sont trop bas, la répression supplémentaire provoquée par l'augmentation des concentrations de RBP ne sera pas observable. Dans un tel cas, il est préférable de concevoir la cassette du site de liaison avec le site de liaison encore dans la région d'initiation, mais sur le point de la transition de la région d'initiation à la région d'allongement (dans la gamme de 12-15 bp10,29). Nous avons montré que pour de telles valeurs, un effet de répression peut encore être observé. Afin d'augmenter les chances que l'analyse fonctionne, quelle que soit la complexité structurelle, nous conseillons d'effectuer l'analyse sur au moins trois positions différentes pour un site de liaison donné.
Le principal inconvénient de la méthode par rapport aux méthodes in vitro, telles que l'EMSA, est que l'affinité de liaison RBP-ARN n'est pas mesurée en unités absolues de concentration de RBP, mais plutôt en termes de fluorescence fusion-RBP. Ce désavantage est une conséquence directe de l'arrangement in vivo, qui limite notre capacité de lire les concentrations réelles de RBP. Cet inconvénient est compensé par les avantages de la mesure dans le cadre in vivo. Par exemple, nous avons constaté des différences dans les affinités contraignantes en comparant les résultats de notre analyse in vivo aux essais in vitro et in situ précédents. Ces différences peuvent provenir de divergences dans la structure des molécules d'ARNm in vivo qui émergent de leur présence à l'intérieur des cellules10,11,30,31. De telles différences structurelles peuvent conduire à des changements dans la stabilité des états pliés in vivo qui, à leur tour, stabilisent ou déstabilisent la liaison RBP.
Étant donné que la méthode est relativement simple et peu coûteuse, nous vous conseillons d'exécuter plusieurs contrôles parallèlement à l'expérience réelle. Exécution d'un contrôle négatif, c'est-à-dire, une séquence qui n'a aucune affinité avec le RBP mais a des caractéristiques structurelles similaires, peut aider à éviter les faux positifs découlant d'interactions non spécifiques avec l'ARNm. Dans les résultats représentatifs montrés, les deux contrôles négatifs étaient le gène mCherry seul (aucun site de liaison) et le site de liaison indigène de l'autre RBP (c.-à-d., PP7-wt pour MCP et MS2-wt pour PCP). De plus, nous proposons d'incorporer un contrôle positif (comme un RBP et son site de liaison indigène). Un tel contrôle aidera à quantifier l'affinité contraignante en présentant un point de référence, et à éviter les faux négatifs découlant d'une faible répression des plis.
Enfin, pour ceux qui souhaitent obtenir une perspective structurelle de liaison RBP-ARN, nous proposons la réalisation d'une acylation sélective de 2-hydroxyl analysée par séquençage d'extension d'amorce (SHAPE-Seq)11,32,33 expérience. SHAPE-Seq est une approche NGS combinée avec le sondage chimique de l'ARN, qui peut être utilisé pour estimer la structure secondaire de l'ARN ainsi que les interactions de l'ARN avec d'autres molécules, telles que les protéines. Dans nos travaux précédents, nous avons mené une expérience SHAPE-Seq sur une souche représentative dans des conditions in vivo34 et in vitro avec la protéine recombinante purifiée10,35. Dans notre cas, les résultats ont indiqué que RBP-contraignant a affecté un segment beaucoup plus large de l'ARN que précédemment rapporté pour ces RBPs in vitro36.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce projet a reçu un financement du programme I-CORE du Comité de planification et de budget et de la Fondation des sciences israéliennes (Grant no 152/11), Marie Curie Reintegration Grant No. PCIG11-GA- 2012-321675, et du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne dans le cadre de l'accord de subvention no 664918 - MRG-Grammar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8-lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| Glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| Incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| Ligase | NEB | B0202S | |
| Liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| Multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| Platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| Sodium Chloride (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
References
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