Summary
في هذه الطريقة، نقوم بتحديد التقارب الملزم للبروتينات الملزمة الحمض النووي الريبي (RBPs) إلى مواقع ربط الكُونات وغير الكونيات باستخدام اختبار مراسل بسيط ومباشر في الخلايا البكتيرية. ويستند هذا القول على قمع جين مراسل.
Abstract
في خطوة بدء ترجمة البروتين، يرتبط الريبوسم بمنطقة بدء mRNA. يمكن حظر بدء الترجمة عن طريق ربط بروتين ملزم الحمض النووي الريبي (RBP) إلى منطقة بدء mRNA، الذي يتداخل مع ربط ريبوسم. في الطريقة المعروضة، نستخدم هذه الظاهرة حجب لتحديد مدى التقارب ملزمة من RBPs إلى مواقعها ملزمة cognate وغير cognate. للقيام بذلك، نقوم بإدراج موقع ربط اختبار في منطقة بدء mRNA مراسل والحث على التعبير عن RBP الاختبار. وفي حالة ربط RBP-RNA، لاحظنا قمعاً السينياً للتعبير الصحفي كدالة لتركيز الممارسات التجارية التقييدية. وفي حالة عدم وجود تقارب أو تقارب منخفض جداً بين الموقع الملزم والممارسات التجارية التقييدية، لم يلاحظ أي قمع كبير. يتم تنفيذ هذه الطريقة في الخلايا البكتيرية الحية، ولا تتطلب آلات مكلفة أو متطورة. ومن المفيد تحديد الخصائص والمقارنة بين أوجه التقارب الملزمة لمختلف الممارسات التجارية التقييدية التي تعمل في البكتيريا إلى مجموعة من مواقع الربط المصممة. قد يكون هذا الأسلوب غير مناسب للمواقع الملزمة ذات التعقيد الهيكلي العالي. ويرجع ذلك إلى إمكانية قمع بدء ريبوسومال من قبل هيكل MRNA معقدة في غياب RBP، مما يؤدي إلى التعبير الجيني مراسل القاعدية أقل، وبالتالي قمع مراسل أقل ملاحظة على ربط RBP.
Introduction
وقد تمت دراسة اللوائح القائمة على البروتين الملزم للRNA (RBP) بعد النسخ، وعلى وجه التحديد توصيف التفاعل بين الممارسات التجارية التقييدية والحمض النووي الريبي، على نطاق واسع في العقود الأخيرة. هناك أمثلة متعددة من التنظيم أسفل الترجمة في البكتيريا الناشئة من RBPs تثبيط،أو تتنافس مباشرة مع، الريبوسم ملزمة 1،2،3. في مجال البيولوجيا التركيبية، تظهر تفاعلات RBP-RNA كأداة هامة لتصميم الدوائر الوراثية المستندة إلى النسخ4و5. ولذلك، هناك زيادة في الطلب على توصيف هذه التفاعلات بين الممارسات التجارية التقييدية والحمض النووي الريبي في سياق خلوي.
الطرق الأكثر شيوعا لدراسة التفاعلات البروتين الحمض النووي الريبي هي تحويل التنقل الكهربائي (EMSA)6، والذي يقتصر على إعدادات المختبر ، ومختلف الاختبارات المنسدلة7، بما في ذلك طريقة CLIP8،9 . في حين أن هذه الأساليب تمكن من اكتشاف مواقع الربط الحمض النووي الريبي دي نوفو, أنها تعاني من عيوب مثل بروتوكولات كثيفة العمالة وردود الفعل التسلسل العميق مكلفة وقد تتطلب جسم اضدي معين لRBP المنسدلة. بسبب الطبيعة القابلة للتأثر من الحمض النووي الريبي لبيئتها، يمكن أن تؤثر عوامل كثيرة على تفاعلات RBP-RNA، مع التأكيد على أهمية استجواب RBP-RNA ملزمة في السياق الخلوي. على سبيل المثال، لقد أظهرنا نحن وآخرون اختلافات كبيرة بين هياكل الحمض النووي الريبي في الجسم الحي وفي المختبر10،11.
استنادا ً إلى نهج دراسة سابقة12، أظهرنا مؤخرا10 أنه عند وضع مواقع ملزمة مصممة مسبقا للRBPs كابسيد من البكتيريا GA13، MS214، PP715، وQβ16 في ترجمة بداية منطقة من مراسلة [مرنا], مراسلة قمعت تعبير بقوّة. نحن نقدم طريقة بسيطة وكمية نسبيا، استنادا إلى هذه الظاهرة القمع، لقياس التقارب بين RBPs وما يقابلها RNA موقع ملزمs في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد النظام
- تصميم بلازميدات الموقع الملزم
- تصميم شريط كاسيت موقع الربط كما هو موضح في الشكل 1. كل المينيجين يحتوي على الأجزاء التالية (5' إلى 3'): Eagl موقع تقييد، و40 قواعد من 5 ' نهاية كانامايسين (كان) الجينات المقاومة، pLac-Ara المروج، موقع ربط ريبوسم (RBS)، AUG من الجين mCherry، فاصل (δ)، موقع ربط RBP، 80 قواعد من نهاية 5 ' من الجين mCherry، وموقع تقييد ApaLI.
ملاحظة: لزيادة معدل نجاح الاختبار، قم بتصميم ثلاثة أشرطة فيديو موقع ربط لكل موقع ربط، مع فواصل تتكون من قاعدة واحدة واثنين وثلاث قواعد على الأقل. راجع قسم النتائج التمثيلية للحصول على مزيد من المبادئ التوجيهية.
- تصميم شريط كاسيت موقع الربط كما هو موضح في الشكل 1. كل المينيجين يحتوي على الأجزاء التالية (5' إلى 3'): Eagl موقع تقييد، و40 قواعد من 5 ' نهاية كانامايسين (كان) الجينات المقاومة، pLac-Ara المروج، موقع ربط ريبوسم (RBS)، AUG من الجين mCherry، فاصل (δ)، موقع ربط RBP، 80 قواعد من نهاية 5 ' من الجين mCherry، وموقع تقييد ApaLI.
- استنساخ بلازميدات الموقع الملزمة
- اطلب أشرطة الكاسيت الملزمة كجينات صغيرة مزدوجة التقطعت بالحمض النووي (dsDNA). كل الجين المصغر هو 500 نقطة أساس طويلة ويحتوي على موقع تقييد Eagl وموقع تقييد ApaLI في 5' و 3' ينتهي، على التوالي (انظر الخطوة 1.1.1).
ملاحظة: في هذه التجربة، أمرت الجينات الصغيرة مع نصف جين كانامايسين لتسهيل الكشف عن المستعمرات الإيجابية. مهما, [جبسن] اجتماع17 أيضا مناسبة هنا, [إين وهيش يس] ال [كنفيك ستب] يستطيع كنت أمرت كاثنان قصيرة تكميليّة [سنغل-تّف] [دنا] [أوليغوس]. - مزدوجة هضم كل من الجينات المصغرة وناقلات الهدف مع Eagl-HF وApaLI من قبل بروتوكول تقييد18، وتنقية العمود19.
- يُحَمِّل الجينات الصغيرة المُهضمة إلى العمود الفقري في الموقع المُلزم الذي يحتوي على بقية جين مراسل mCherry، المنهي، وجين مقاومة كانامايسين20.
- تحويل محلول الربط إلى خلايا TOP10 القولونية الإشريكية 21.
- تحديد التحولات الإيجابية عن طريق تسلسل Sanger.
- تصميم التمهيدي 100 قواعد المنبع إلى المنطقة ذات الأهمية (انظر الجدول 1 للاطلاع على تسلسلات التمهيدي).
- Miniprep عدد قليل من المستعمرات البكتيرية22.
- إعداد 5 ميكرولتر من محلول 5 mM من التمهيدي و 10 ميكرولتر من الحمض النووي في تركيز 80 نانوغرام /ميكرولتر.
- إرسال الحل الثاني إلى منشأة مريحة لتسلسل Sanger23.
- تخزين بلازميدات تنقية في -20 درجة مئوية، وسلالات البكتيرية كما أسهم الجلسرين24،وكلاهما في شكل 96 جيدا. ثم سيتم استخدام الحمض النووي للتحول إلى خلايا E. coli TOP10 التي تحتوي على واحدة من أربعة بلازميدات الانصهار RBP (انظر الخطوة 1.3.5).
- اطلب أشرطة الكاسيت الملزمة كجينات صغيرة مزدوجة التقطعت بالحمض النووي (dsDNA). كل الجين المصغر هو 500 نقطة أساس طويلة ويحتوي على موقع تقييد Eagl وموقع تقييد ApaLI في 5' و 3' ينتهي، على التوالي (انظر الخطوة 1.1.1).
- تصميم وبناء بلازميد RBP
ملاحظة: الأحماض الأمينية وتسلسل النيوكليوتيد اتّباعاً لبروتينات المعطف المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في الجدول2.- طلب تسلسل RBP المطلوبة تفتقر إلى codon وقف كجين مصغر dsDNA أمر مخصص تفتقر إلى codon وقف مع مواقع تقييد في نهايات (الشكل 1).
- استنساخ RBP اختبار تفتقر إلى codon وقف المصب على الفور من المروج اللاإحتياج والمنبع من بروتين الفلورسنت تفتقر إلى codon بداية (الشكل1)،على غرار الخطوات 1.2.2-1.2.4. تأكد من أن بلازميد RBP يحتوي على جين مقاومة المضادات الحيوية مختلفة من بلازميد الموقع ملزمة.
- تحديد التحولات الإيجابية عن طريق تسلسل Sanger، على غرار الخطوة 1-2-5 (انظر الجدول 1 للاطلاع على التسلسلات التمهيدية).
- اختيار واحد تحويل إيجابي وجعلها كيميائيا المختصة25. تخزين كما بلازميدات نقية الجلسرين في -20 درجة مئوية ومخزونات الجلسرين من سلالات البكتيرية24 في -80 درجة مئوية في لوحات 96 جيدا.
- تحويل بلازميدات الموقع الملزم (من الخطوة 1.2.6) المخزنة في لوحات 96-well إلى خلايا بكتيرية مختصة كيميائيا تحتوي بالفعل على بلازميد RBP-mCerulean21. لتوفير الوقت، بدلا من طلاء الخلايا على أطباق بيتري، لوحة لهم باستخدام pipettor 8 قناة على لوحات 8 حارة تحتوي على لوريا بيرتاني (LB)26 أجار مع المضادات الحيوية ذات الصلة (كان وأمبير). المستعمرات يجب أن تظهر في 16 ح.
- حدد مستعمرة واحدة لكل تحويل مزدوج وتنمو بين عشية وضحاها في وسط LB مع المضادات الحيوية ذات الصلة (كان وأمبير) وتخزينها كما أسهم الجلسرين24 في -80 درجة مئوية في لوحات 96 جيدا.
2. إعداد التجربة
ملاحظة: تم تنفيذ البروتوكول المعروض هنا باستخدام نظام روبوتي للتعامل مع السوائل مع حاضنة وقارئ لوحة. وقد أُجري كل قياس لـ 24 تركيزات محفزة، مع نسختين مكررتين لكل سلالة + تركيبة محفزة. وباستخدام هذا النظام الروبوتي، جُمعت بيانات عن 16 سلالات في اليوم مع 24 تركيزات محفزة. ومع ذلك، إذا كان مثل هذا الجهاز غير متوفر، أو إذا كان عدد أقل من التجارب اللازمة، يمكن أن يتم ذلك بسهولة باليد باستخدام 8 قنوات متعددة الماصة وتكييف البروتوكول وفقا لذلك. فعلى سبيل المثال، تم الحصول على نتائج أولية لأربع سلالات في اليوم مع 12 تركيز محفز وأربع نقاط زمنية بهذه الطريقة.
- إعداد، مقدما، 1 لتر من المخزن المؤقت اختبار حيوي (BA) عن طريق خلط 0.5 غرام من التربتون، 0.3 مل من الجلسرين، 5.8 غرام من حمض الهيدروكلوريك، 50 مل من 1 م غ سو4،1 مل من 10X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) العازلة pH 7.4، و 950 مل من الماء المقطر المزدوج (DDW). الأوتوكلاف أو معقمة تصفية المخزن المؤقت مكتبة الإسكندرية.
- تنمو سلالات مزدوجة التحويل في 37 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة تهتز في 1.5 مل رطل مع المضادات الحيوية المناسبة (كانامايسين في تركيز نهائي من 25 ميكروغرام / مل وampicillin في تركيز نهائي من 100 ميكروغرام / مل)، في لوحات 48 جيدا، على مدى فترة 18 ساعة (بين عشية وضحاها).
-
في الصباح، قم بالاستعدادات التالية.
- لوحة محفز. في لوحة نظيفة 96 جيدا، وإعداد الآبار مع المتوسطة شبه الفقيرة (SPM) تتكون من 95٪ BA و 5٪ LB26 في الحاضنة في 37 درجة مئوية. عدد الآبار يتوافق مع العدد المطلوب من تركيزات الحث. إضافة C4-HSL إلى الآبار في لوحة الحث التي سوف تحتوي على أعلى تركيز محفز (218 nM).
- برنامج الروبوت لتخفيف متوسط تسلسليا من كل من الآبار أعلى تركيز في 23 تركيزات أقل تتراوح بين 0 إلى 218 nM. يجب أن يكون حجم كل تخفيف محفز كافية لجميع السلالات (بما في ذلك التكرارات).
- في حين يجري إعداد تخفيف الحث، دافئ 180 درجة مئوية من SPM في الحاضنة في 37 درجة مئوية، في لوحات 96 جيدا.
- تخفيف سلالات بين عشية وضحاها من الخطوة 2.2 بعامل من 100 بواسطة التخفيف التسلسلي: تخفيف أولا بعامل من 10 عن طريق خلط 100 ميكرولتر من البكتيريا مع 900 ميكرولتر من SPM في لوحات 48 جيدا، ومن ثم تخفيف مرة أخرى بعامل 10 عن طريق أخذ 20 ميكرولتر من الحل المخفف في 180 ميكرولتر من SPM قبل تسخينها، في لوحات 96 جيدا مناسبة لقياسات الفلورسنت.
- إضافة الحث المخفف من لوحة الحث إلى لوحات 96 جيدا مع سلالات مخففة وفقا لتركيزات النهائي.
- هز لوحات 96 جيدا في 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعة، في حين أخذ قياسات الكثافة البصرية في 595 نانومتر (OD595)،mCherry (560 نانومتر/ 612 نانومتر) ومسيرولانس (460 نانومتر/ 510 نانومتر) الفلورة عن طريق قارئ لوحة كل 30 دقيقة. لأغراض التطبيع، قياس نمو SMP مع عدم إضافة الخلايا.
3- التحليل الأولي للنتائج
- لكل يوم من أيام التجربة، اختر فاصل زمني للنمو اللوغاريتمي وفقا لمنحنيات النمو المقاسة، بين مرحلة النمو الخطي والثابتة (T0،Tfinal). خذ حوالي 6-8 نقاط زمنية، مع تجاهل القياسات الأولى والأخيرة لتجنب الخطأ الناتج عن عدم دقة الكشف عن النمو الأسي (انظر الشكل 2A،اللوحة العليا).
ملاحظة: تجاهل السلالات التي تظهر منحنيات النمو غير طبيعية أو سلالات حيث لا يمكن الكشف عن مرحلة النمو اللوغاريتمي وتكرار التجربة. -
حساب متوسط الفلورة تطبيع من mCerulean ومعدل إنتاج mCherry، من البيانات الخام لكل من mCerulean وmCherry الفلورة لكل تركيز محفز (الشكل2A).
- حساب mCerulean التسوية كما يلي:
حيث فارغة (mCerulean) هو مستوى mCerulean [a.u.] للمتوسط فقط، فارغة (OD) هو الكثافة البصرية للمتوسط فقط، وmCerulean وOD هي الفلورة mCerulean وقيم الكثافة البصرية، على التوالي. - متوسط mCerulean على نقاط زمنية مختلفة (الشكل2B،أعلى اثنين من لوحات) على النحو التالي:
حيث #Time نقطة هو عدد نقاط البيانات الزمنية التي تؤخذ في الاعتبار، T0 هو الوقت الذي تبدأ فيه مرحلة النمو الأسي، وTالنهائي هو الوقت الذي تنتهي فيه مرحلة النمو الأسي. - حساب معدل mCherry من الإنتاج (الشكل2B،أسفل اثنين من لوحات) على النحو التالي:
حيث mCherry(t) هو مستوى mCherry [a.u.] في الوقت t، OD هو قيمة الكثافة البصرية، T0 هو الوقت الذي تبدأ فيه مرحلة النمو الأسي، وTالنهائي هو الوقت الذي تنتهي فيه مرحلة النمو الأسي.
- حساب mCerulean التسوية كما يلي:
- وأخيرا، رسم معدل mCherry من الإنتاج كدالة mCerulean، وخلق منحنيات استجابة الجرعة كدالة للفلورة الانصهار RBP-mCerulean (الشكل2C). مثل هذه المؤامرات تمثل إنتاج الجين مراسل كدالة لوجود RBP في الخلية.
4. جرعة استجابة وظيفة تركيب الروتينية وKRBP استخراج
- تحت افتراض أن معدل الريبوسم للترجمة مع ربط RBP ثابت، نموذج معدل إنتاج mCherry على النحو التالي (انظر الشكل 2D،الخط الأخضر):
حيث [x] هو متوسط الفلورة mCerulean المعدلة حسب مكافئ 2، معدل إنتاج mCherry هو القيمة المحسوبة وفقا لEq. 3، KRBP هو التقارب ملزمة نسبيا [a.u.]، Kغير منضم هو معدل الريبوسوسوم من الترجمة مع RBP غير منضم، ن هو عامل التعاون، وC هو الفلورة الأساسية [a.u.]. تم العثور على C, n, Kunbound,و KRBP عن طريق تركيب بيانات معدل إنتاج mCherry إلى النموذج (Eq. 4). - باستخدام برنامج تحليل البيانات، إجراء إجراء مناسب على قطع الأراضي التي تصور معدل إنتاج mCherry كدالة لمتوسط mCerulean (الخطوة 3.3)، واستخراج المعلمات صالح وفقا للصيغة في Eq. 4.
ملاحظة: يتم أخذ النتائج المناسبة فقط مع R2 > 0.6 في الاعتبار. بالنسبة لتلك النوبات، يكون الخطأ في KRBP في الغالب في نطاق 0.5% إلى 20% من قيمK RBP، لفترة ثقة 0.67، في حين يمكن أيضًا التحقق من أولئك الذين يعانون من خطأRBP K أعلى عن طريق العين. - تطبيع قيمK RBP حسب القيمة القصوى لكل من متوسط mCerulean لكل وظيفة الجرعة استجابة.
حيث KRBP في [a.u.] هي القيمة المستخرجة من إجراء التركيب في Eq. 4، والحد الأقصى (متوسط mCerulean) هو متوسط أقصى إشارة mCerulean [a.u] لوحظ للسلالة الحالية.
ملاحظة: وييسر التطبيع المقارنة الصحيحة بين الأثر التنظيمي عبر السلالات عن طريق القضاء على الاعتماد على مستويات التعبير القصوى الخاصة بالممارسات التجارية التقييدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تستخدم الطريقة المعروضة المنافسة بين RBP والريبوسوم لربط جزيءmRNA (الشكل 1). وتنعكس هذه المنافسة من خلال انخفاض مستويات mCherry كدالة لزيادة إنتاج RBP-mCerulean، وذلك بسبب زيادة تركيزات المحفز. في حالة زيادة الفلورة mCerulean، مع عدم وجود تغييرات كبيرة في mCherry، يتم استنتاج عدم وجود ربط RBP. ويبين الشكل 2النتائج التمثيلية لكل من السلالة الإيجابية والسلبية. في الشكل 2A، يتم تقديم OD، mCherry، وmCerulean القنوات كوظيفة من الوقت ومحفز على مدى مجموعة من أربع ساعات، مع T0 = 1 ح و Tالنهائي = 3.5 ساعة. في الشكل 2B، يتم عرض متوسط الفلورة mCerulean (أعلى) ومعدل mCherry الإنتاج (أسفل) كدالة لتركيز المحفز ، لسلالات المثالين. كما يمكن أن نرى، فإن نتائج سلالة إيجابية تظهر تأثير واضح أسفل التنظيمية في معدل mCherry من الإنتاج (الشكل2B،C)، والذي يترجم إلى قيمة كبيرة غير الصفر من KRBP (الشكل2D). وفيما بالنسبة للإجهاد الإيجابي، أسفر الإجراء المناسب عن القيم التالية: KRBP = 394.6 a.u., Kunbound = 275.6, n = 2.1, C = 11.2 a.u., and R2 = 0.93. بعد التطبيع من قبل الفلورة mCerulean القصوى، كانت قيمةالممارسات التجارية التقييدية K 0.24. وبالنسبة للإجهاد السلبي، لوحظ عدم وجود استجابة متميزة (الشكل2C)،ولم تستخرج قيمة KRBP (الشكل2D).
في الشكل 3، نقدم نتائج هذا التقييم لاثنين من الممارسات التجارية RBPs معطف phage ، PP7 و MS2 ، على عدة مواقع ملزمة متحولة ، في مواقع مختلفة داخل منطقة بدء mCherry mRNA. وتصنف النتائج تقريبا في ثلاثة أنواع من الردود (الشكل3A):سلالات تظهر تأثير أسفل التنظيمية على مستوى مسيرولي منخفض، مما يعكس انخفاض قيمة KRBP (تقارب ملزم عالية)؛ (أ) السلالات التي تظهر تأثيرًا تنظيميًا منخفضًا عند مستويات متوسطة أو عالية من الـ mCerulean، مما يعكس ارتفاع قيمة KRBP (التقارب المتوسط أو المنخفض)؛ والسلالات التي لا تظهر أي استجابة متميزة لمستويات ارتفاع mCerulean، مما يعكس قيمة أعلى KRBP من الحد الأقصى لتركيز الممارسات التجارية التقييدية في الخلية (لا تقارب ملزم قابل للكشف). ويعرض الشكل 3 باء القيمة الدنيا KRBP المحسوبة لكل تركيبة من الممارسات التجارية التقييدية -مجموعة مواقع الربط استناداً إلى جميع مجموعات الممارسات التجارية التقييدية وعشرة مواقع ملزمة في مواقع مختلفة. تتضمن مواقع الربط عنصر تحكم سلبي (لا يوجد موقع ملزم)، ومواقع ربط غير مطابقة، وتحكم إيجابي - موقع الربط الأصلي لكل RBP (PP7-wt لبروتين معطف PP7 [PCP]، وMS2-wt لبروتين معطف MS2 [MCP]). وتتطابق النتائج مع التنبؤات، حيث أن كلا الممارسات التجارية التقييدية تمثل تقارباً كبيراً لضوابطها الإيجابية، وتقارباً ملزماً غير قابل للكشف للضوابط السلبية. وبالإضافة إلى ذلك، لاحظت الدراسات السابقة التي تستخدم هذين الممارسات التجارية التقييدية27و28 أنهما متعامدانان، وهو ما يُنقل بوضوح في خريطة الحرارة المعروضة: فكل من MCP وPCP لا يربطان الموقع الأصلي للممارسات التجارية التقييدية الأخرى. وعلاوة على ذلك، تقدم مواقع الربط المتحولة نتائج متفاوتة، حيث أظهرت بعض المواقع الملزمة مستوى تقارب مماثل لمستوى تقارب الموقع الأصلي، مثل PP7-mut-1 وPP7-mut-2 و MS2-mut-3، في حين أظهرت مواقع أخرى تقارباً أقل بكثير، مثل PP7-mut-3 و MS2-mut-2. وهكذا، قدم الاختبار قياساً كمياً في الجسم الحي للتقارب الملزم للممارسات التجارية التقييدية، مما أسفر عن نتائج مماثلة لنتائج التجارب السابقة على هذه الممارسات التجارية التقييدية.
وبما أن هذا القول يستند إلى قمع جين mCherry، فإن هناك حاجة إلى إشارة كرزية قابلة للحياة. لذلك، عند تصميم شريط كاسيت موقع الربط، هناك قاعدتي تصميم يجب أن نضعها في اعتبارنا. أولاً، يجب الاحتفاظ بإطار القراءة المفتوح (ORF) للكرز. بما أنطول الموقع الملزم يمكن أن يختلف، فإن إدراجه في الجين يمكن أن يسبب تحولاً في قاعدة أو قاعدتين من الـ mCherry ORF الأصلي. لذلك، إذا لزم الأمر (الشكل4A)،إدراج قاعدة واحدة أو قاعدتين مباشرة المتلقين للمعلومات إلى موقع الربط. على سبيل المثال، موقع ملزم الذي هو 20 قاعدة طويلة، مع δ من قاعدتين، وسوف تسفر عن إضافة 22 قواعد إلى الجين mCherry. للحفاظ على ORF، ونحن بحاجة إلى إضافة قاعدتين، لما مجموعه 24 قاعدة. قاعدة التصميم الثاني هو تجنب الإدراج من codons وقف في ORF mCherry. تحتوي بعض مواقع الربط، كـ MS2-mut-2 (الشكل4B، inset)، على توقف codons عند وضعها في واحد أو أكثر من ORFs الثلاثة المحتملة. يتم توضيح مثل هذا المثال في الشكل 4A، حيث يحتوي موقع الربط على codon إيقاف في الإطار مع orF mCherry فقط عند عدم إضافة قواعد. كما يمكن أن نرى في منحنى الجرعة والاستجابة لهذا الموقف (الشكل4B)،وكان معدل إنتاج mCherry غير قابل للكشف، وبالتالي لا يمكن قياس التقارب ملزمة.
نظرة فاحصة على الشكل 4B يوضح تأثير δ التباعد على إنتاج mCherry. على سبيل المثال، بالنسبة لδ = 4، كان معدل الإنتاج القاعدي عامل ستة أكثر من تلك الخاصة بـ δ = 5، مما يضمن تأثير قمع طي أعلى. ومع ذلك، فبالنسبة لـ δ = 14، كانت مستويات الإنتاج القاعدية منخفضة جداً بحيث لا يمكن ملاحظة تأثير هابط تنظيمي.
الشكل 1: لمحة عامة عن تصميم النظام وخطوات الاستنساخ. رسم توضيحي لتصميم الكاسيت لموقع الربط بلازميد (يسار) وبلازميد RBP-mCerulean (يمين). الخطوة التالية هي التحولات المتتالية لكلا بلازميدات إلى خلايا القولونية E. المختصة، مع بلازميدات RBP أولاً. ثم يتم اختبار التحولات المزدوجة لمستويات التعبير mCherry في زيادة تركيزات المحفزات; إذا ربط RBP إلى موقع الربط، تنخفض مستويات mCherry كدالة mCerulean (فقاعة رمادية). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط التحليل. (أ) المؤامرات ثلاثية الأبعاد (3D) التي تصور مستويات OD الخام (أعلى)، الفلورة mCerulean (الأوسط)، والفلورة mCherry (أسفل) كدالة للوقت والتركيز المحفز، لسلالة إيجابية. (B) أعلى: يتم حساب مستويات التعبير ثابت الحالة mCerulean لكل تركيز محفز عن طريق تقسيم كل مستوى الفلورة بواسطة OD المعنية والمتوسط على جميع القيم في 2-3 ح إطار النمو الأسي لكل من الإيجابية (يسار) وسلالات سلبية (يمين). أسفل: معدل إنتاج mCherry محسوب وفقًا لـ Eq. 3 للنقاط الزمنية 2−3 ساعة بعد الحث. (C) mCherry معدل الإنتاج المرسومة كدالة لمتوسط الفلورة mCerulean متوسط أكثر من اثنين من التكرارات البيولوجية لسلالات اثنين. أشرطة الخطأ هي الانحراف المعياري لكل من معدل إنتاج mCherry ومتوسط الفلورة mCerulean المكتسبة من نسختين متماثلتين على الأقل. (D) يصلح لKRBP باستخدام الصيغة المناسبة في Eq. 4 أظهرت للسلالة الإيجابية (اليسار)، مما يظهر استجابة ملزمة محددة. للإجهاد السلبي (إلى اليمين)، لم يتم استخراج قيمةK RBP. يتم عرض البيانات في التكرار. وقد تم تكييف هذا الرقم بإذن من كاتز وآخرون10. حقوق الطبع والنشر 2018 الجمعية الكيميائية الأمريكية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: النتائج النهائية التمثيلية. (أ) المنحنيات الطبيعية للجرعة والاستجابة لثلاثين سلالات مختلفة على أساس اثنين من الممارسات التجارية التقييدية وعشرة مواقع ملزمة في مواقع مختلفة. يتم ملاحظة ثلاثة أنواع من الاستجابات: تقارب عالي، وتقارب منخفض، ولا تقارب. (ب) النتائج الكمية KRBP لاثنين من RBPs (MCP وPCP) مع خمسة أشرطة موقع ملزمة مختلفة (المدرجة). وقد قيست جميع سلالات موقع الممارسات التجارية التقييدية- سلالات مواقع الربط بالتكرار. وقد تم تكييف هذا الرقم بإذن من كاتز وآخرون10. حقوق الطبع والنشر 2018 الجمعية الكيميائية الأمريكية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تصميم مثال ونتائج MCP مع موقع ربط متحولة. (أ) رسم توضيحي لتصميم أشرطة ويب الربط في أربعة مواقع مختلفة. كاسيت بما في ذلك موقع الربط ريبوسوم، بدء codon لmCherry، δ قواعد المسافة، موقع ملزم اختبارها، واحد أو اثنين من القواعد للحفاظ على ORF، وبقية الجين mCherry. النجوم الحمراء تشير إلى توقف كودون. (B) منحنيات الجرعة استجابة لMCP مع موقع ملزم متحولة في أربعة مواقع مختلفة. Inset: تسلسل موقع الربط المتحول الذي تم اختباره. النتائج المعروضة هي لتكرار كل سلالة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم | موقع موقع Binidng، A في AUG = 1 | ربط تسلسل الموقع (RBS لعناصر التحكم) | الموقع: ATG إلى الثاني mCherry codon GTG الضوابط: RBS إلى الثاني mCherry codon GTG |
مصدر |
| محمد الدوسري | 5 | محمد محمد | محمد محمد | Gen9 Inc. |
| محمد الدوسري | 6 | محمد محمد | محمد محمد | Gen9 Inc. |
| محمد الدوسري | 8 | محمد محمد | محمد محمد محمد العلي |
Gen9 Inc. |
| محمد الدوسري | 9 | محمد محمد | محمد محمد محمد العلي |
Gen9 Inc. |
| MS2_U(-5)C_d8 | 8 | محمد محمد | محمد محمد تيراغرام |
Gen9 Inc. |
| MS2_U(-5)C_d9 | 9 | محمد محمد | محمد محمد تيراغرام |
Gen9 Inc. |
| MS2_U(-5)C_d8 | 8 | محمد محمد | محمد محمد تيراغرام |
Gen9 Inc. |
| MS2_U(-5)G_d9 | 9 | محمد محمد | محمد محمد تيراغرام |
Gen9 Inc. |
| محمد الدوسري | 9 | محمد محمد | محمد محمد تيراغرام |
Gen9 Inc. |
| محمد الدوسري | 8 | محمد محمد | محمد محمد تيراغرام |
Gen9 Inc. |
| PP7wt_d5' | 5 | محمد الدوسري | محمد محمد محمد العلي |
Gen9 Inc. |
| PP7wt_d6' | 6 | محمد الدوسري | محمد محمد محمد الدوسري |
تطور العلوم الحيوية |
| PP7wt_d8' | 8 | محمد الدوسري | محمد محمد محمد العلي |
تطور العلوم الحيوية |
| PP7wt_d9' | 9 | محمد الدوسري | محمد محمد محمد الدوسري |
تطور العلوم الحيوية |
| PP7_USLSBm_d6 | 6 | محمد محمد | محمد محمد محمد الدوسري |
Gen9 Inc. |
| PP7_USLSBm_d15 | 15 | محمد محمد | محمد الدوسري محمد محمد |
Gen9 Inc. |
| PP7_nB_d5 | 5 | محمد الدوسري | محمد محمد محمد الدوسري |
Gen9 Inc. |
| PP7_nB_d6 | 6 | محمد الدوسري | محمد محمد محمد العلي |
Gen9 Inc. |
| PP7_US_d5 | 5 | محمد الدوسري | محمد محمد تاجر |
Gen9 Inc. |
| PP7_US_d6 | 6 | محمد الدوسري | محمد محمد محمد الدوسري |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d1 | - | - | محمد الدوسري تيراغرام |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d4 | - | - | محمد الدوسري محمد العلي |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d10 | - | - | محمد الدوسري محمد العلي |
Gen9 Inc. |
| تمهيد تسلسل يُربط أشرطة الموقع | محمد محمد | IDT | ||
| التمهيدي التسلسل لأشرطة RBP | محمد محمد | IDT | ||
الجدول 1: مواقع الربط والتسلسل التمهيدي. تسلسلات لمواقع الربط وأشرطة الموقع الملزمة المستخدمة في هذه الدراسة، فضلاً عن المواد التمهيدية لتفاعلات التسلسل المفصلة في البروتوكول (الخطوتان 1-2-5-1 و1-3-3).
| اسم RBP في هذا العمل | اسم الكائن الحي المصدر، البروتين | مصدر كائن حي جين | مصدر كائن حي refseq | WT aa seq | التغييرات من الوزن (والمراجع) | aa seq المستخدمة في هذا العمل | nt seq المستخدمة في هذا العمل |
| فى المرة الثانية | فيروس إيتشيرتشيا MS2 | Cp | NC_001417.2 | MASNFTQFVLV DNGGTGDVTV APSNFANGVA اويس ان سرك AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI KVEVPKفاتكت VGGVELPVA في هذا الـ401 تيبفاتنزد CELIVKAMQG فى الفرنسيّة AIAANSGIY |
delF-G [1] [1] V29I [1] مأخوذة من البلازميد أدجين 27121 |
MASNFTQFVLV DNGGTGDVTV في ما يُمكن أن يكون هناك أي ّ اويس ان سرك AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI KVEVPKG في هذا الـ401 تيبفاتنزد CELIVKAMQG فى الفرنسيّة AIAANSGIY |
ATGGCTTCTA ACTTTACTCA GTTCGTTCTC GTCGACAATG GCGGAACTGG CGACGTGACT GTCGCCCCAA GCAACTTCGC TAACGGGATC فى المباراة ال16 TCAGCTCTAA لجنة مكافحة الإرهاب كاجكتيكاكا AAGTAACCTG في هذا الـ10 و100 في هذا الـ4ل CGCAGAATCG فى هذا الهوونك في هذا الـ40من، تم ّ التوصل إلى نتيجة AGGTGCCTAA فى هذا العنونة فى هذا العنونة تااتاغا ACTAACCATT CCAATTTTCG فى الانجليزية CGACTGCGAG CTTATTGTTA AGGCAATGCA فى هذا العنونة AAAGATGGAA فى هذا الهوونش المركز GCAGCAAACT CCGGCATCTAC |
| PCP | الزائفة phage PP7 | Cp | NC_001628.1 | MSKTIVLSVGEA TRTLTEIQST ADRQIFEEKV GPLVGRLRLT في ما يتعلق بـ AYRVNLKLDQ ADVVDCSTSVC جنرالالكفرية LPKVRYTQ فولكسدفيتيفا NSTEASRKSL YDLSLVAT SQVEDLVVNL VPLGR |
delF-G [2] مأخوذة من بلازميد أدجين 40650 |
MLASKTIVLSVG ايترتيق ستادركفي في نهاية الـ1000 LTASLRQNGA KTAYRVNLKL DQADVVDSG في هذا الـ401 SHDVTIVANS تيركسلد في هذا الـ10 متر فيدلفينلفيب LGR |
في هذا الـ4ل فى هذا الهوونك GTTCTTTCGG TCGGCGAGGC TACTCGCACT CTGACTGAGA TCCAGTCCAC CGCAGACCGT كاجيتكت سي جي AAGAGAAGGT في هذا الـ40من، تم ّ التمخص GTGTGTCGGC TGCGCCTCAC في هذا الـ40من فى الانجليزية GAGCCAAGAC في هذا الـ40من GTCAACCTAA AACTGGATCA في هذا الـ15 GTTGATTCCG في هذا الـ40من في هذا الـ15 ACTCAGGTAT GGTCGCACGA CGTGACAATC GTTGCGAATA فى الانماع المركز في هذا الـ40من ATTTGACCAA في هذا الـ10 GCGACCTCGC AGGTCGAAGA في هذا الـ15 فى المباراة التى احتوى عليها هذا CGCTGGGCCGT |
| مراجع: | |||||||
| 1.Peabody, D.S., Ely, K.R. السيطرة على القمع الترجمة عن طريق التفاعلات البروتين البروتين. بحوث الأحماض النووية. 20 (7)، 1649-1655 (1992). | |||||||
| 2. تشاو, J.A., باتسكوفسكي, Y., Almo, S.C., Singer, R.H. الأساس الهيكلي للتطور المشترك لمجمع البروتين الريبي الفيروسي. الطبيعة الهيكلية والبيولوجيا الجزيئية. 15 (1), 103-105, doi: 10.1038/nsmb1327 (2008) | |||||||
الجدول 2: تسلسل RBP. الأحماض الأمينية وتسلسل النيوكليوتيد من البروتينات معطف المستخدمة في هذه الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة الموصوفة في هذه المقالة يسهل القياس الكمي في الجسم الحي من تقارب ربط RBP-RNA في خلايا القولونية E. والبروتوكول سهل نسبيا ويمكن إجراؤه دون استخدام آلية متطورة، وتحليل البيانات واضح. وعلاوة على ذلك، تُنتج النتائج على الفور، دون وقت الانتظار الطويل نسبيا المرتبط بنتائج الجيل التالي من التسلسل.
أحد القيود على هذه الطريقة هو أنه يعمل فقط في الخلايا البكتيرية. ومع ذلك، أظهرت دراسة سابقة12 تأثير القمع باستخدام نهج مماثل للRBP L7AE في خلايا الثدييات. وهناك قيود إضافية على الأسلوب هو أن إدراج موقع الربط في منطقة بدء mCherry قد قمع مستويات mCherry القاعدية. التعقيد الهيكلي أو الاستقرار العالي للموقع ملزمة يمكن أن تتداخل مع بدء ريبوسومال حتى في غياب RBP، مما أدى إلى انخفاض مستويات القاعدية mCherry. وإذا كانت المستويات القاعدية منخفضة جداً، فإن القمع الإضافي الناجم عن زيادة تركيزات الممارسات التجارية التقييدية لن يكون ملحوظاً. في مثل هذه الحالة، من الأفضل تصميم كاسيت الموقع الملزم مع موقع الربط الذي لا يزال في منطقة البدء، ولكن على وشك الانتقال من منطقة البدء إلى منطقة الاستطالة (δ في نطاق 12-15 bp10,29). لقد أظهرنا أنه لمثل هذه القيم δ تأثير القمع لا يزال يمكن ملاحظتها. لزيادة فرص أن الاختبار سوف تعمل، بغض النظر عن التعقيد الهيكلي، ونحن ننصح بإجراء الاختبار على ما لا يقل عن ثلاثة مواقف مختلفة لموقع ملزم معين.
والعيب الرئيسي للطريقة بالمقارنة مع الأساليب المختبرية، مثل EMSA، هو أن التقارب الملزم بين RBP وRNA لا يقاس بالوحدات المطلقة لتركيز الممارسات التجارية التقييدية، بل من حيث الفلورة الانصهارية - RBP. وهذا العيب هو نتيجة مباشرة للوضع في الجسم الحي، مما يحد من قدرتنا على قراءة التركيزات الفعلية للممارسات التجارية التقييدية. ويقابل هذا العيب فوائد القياس في بيئة الجسم الحي. على سبيل المثال، وجدنا اختلافات في الروابط الملزمة عند مقارنة النتائج من اختبارنا في الجسم الحي إلى الاختبارات السابقة في المختبر وفي الموقع. هذه الاختلافات قد تنبع من الاختلافات في بنية جزيئات mRNA في الجسم الحي التي تنشأ من وجودها داخل الخلايا10،11،30،31. وقد تؤدي هذه الاختلافات الهيكلية إلى تغييرات في استقرار الولايات المطوية في الجسم الحي، مما يؤدي بدوره إلى استقرار أو إلغاء استقرار الممارسات التجارية التقييدية الملزمة.
منذ الأسلوب هو بسيط نسبيا وغير مكلفة، ونحن ننصح تشغيل ضوابط متعددة جنبا إلى جنب مع التجربة الفعلية. تشغيل عنصر تحكم سلبي، أي تسلسل لا علاقة له بالممارسات التجارية التقييدية حتى الآن له سمات هيكلية مماثلة، يمكن أن يساعد على تجنب الإيجابيات الخاطئة الناجمة عن تفاعلات غير محددة مع الحمض النووي الريبي. وفي النتائج التمثيلية المبينة، كان الضوابط السلبية هي جين الكرز وحده (لا يوجد موقع ملزم)، وموقع الربط الأصلي للممارسات التجارية التقييدية الأخرى (أي PP7-wt لMCP وMS2-wt للفينول الخماسي الكلور). وعلاوة على ذلك، نقترح إدراج رقابة إيجابية (مثل الممارسات التجارية التقييدية وموقعها الأصلي الملزم). وستساعد هذه السيطرة في تحديد التآلف الملزم كمياً بتقديم نقطة مرجعية، وفي تجنب السلبيات الزائفة الناجمة عن انخفاض القمع المزدوج.
وأخيرا، بالنسبة لأولئك الذين يرغبون في الحصول على منظور هيكلي من RBP-RNA ملزمة، نقترح تنفيذ انتقائية 2′-هيدروكسيل أسيل تحليلها من قبل تسلسل التمديد التمهيدي (SHAPE-Seq)11،32،33 التجربه. SHAPE-Seq هو نهج NGS جنبا إلى جنب مع التحقيق الكيميائي من الحمض النووي الريبي، والتي يمكن استخدامها لتقدير الهيكل الثانوي للRNA وكذلك تفاعلات الحمض النووي الريبي مع جزيئات أخرى، مثل البروتينات. في عملنا السابق أجرينا تجربة SHAPE-Seq على سلالة تمثيلية في كل من في ظروف الجسم الحي34 وفي المختبر مع البروتين المؤتلف النقي10،35. في حالتنا، كشفت النتائج أن RBP ملزمة أثرت على شريحة أوسع بكثير من الحمض النووي الريبي مما سبق الإبلاغ عن هذه RBPs في المختبر36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تلقى هذا المشروع تمويلا ً من برنامج I-CORE التابع للجنة التخطيط والميزنة ومؤسسة العلوم الإسرائيلية (المنحة رقم 152/11)، والمنحة رقم ماري كوري لإعادة الإدماج. PCIG11-GA- 2012-321675، ومن برنامج أبحاث وابتكار أفق 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 664918 - MRG-Grammar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8-lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| Glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| Incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| Ligase | NEB | B0202S | |
| Liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| Multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| Platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| Sodium Chloride (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
References
- Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).
- Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. Regulation of translation initiation by RNA binding proteins. Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).
- Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria. Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).
- Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).
- Bendak, K., et al. A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein. Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).
- Strein, C., Alleaume, A. -M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells. RNA. 20 (5), 721-731 (2014).
- Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
- Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
- Katz, N., et al. An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).
- Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Methods. 103, 34-48 (2016).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA. Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).
- Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
- Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
- Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein. Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- NEB. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions. , Available from: https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions (2018).
- Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol. , Available from: https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/ (2018).
- NEB. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202). , Available from: https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202 (2018).
- Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html (2018).
- NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit. , Available from: https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx (2018).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Addgene. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/ (2018).
- NEB. Making your own chemically competent cells. , Available from: https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells (2018).
- Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling. , Available from: https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation (2018).
- Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo. Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).
- Espah Borujeni, A., et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505, (2013).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486 (2015).
- Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq. Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).
- Bernardi, A., Spahr, P. -F. Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).
