Summary
В этом методе мы количественно связываем связывающее сродство связывающих белков РНК (RBPs) к cognate и неcognate связывающих сайтов с помощью простой, живой, репортер анализ в бактериальных клетках. Ассем основан на подавлении гена репортера.
Abstract
В шаге начала перевода протеина, ribosome связывает к зоне начала mRNA. Инициация перевода может быть заблокирована путем привязки связывающего белка РНК (RBP) к области инициации мРНК, которая мешает рибосомной связывания. В представленном методе мы используем это блокирующее явление для количественной оценки связывающей близости РБП к их cognate и не-cognate связывающих сайтов. Для этого мы вставляем тестовый узел связывания в область инициации репортера mRNA и индуцируем выражение теста RBP. В случае связывания RBP-РНК мы наблюдали сигмоидальные репрессии в отношении выражения репортера как функции концентрации РБП. В случае несродности или очень низкого сродства между связывающим сайтом и РБП не наблюдалось никаких существенных репрессий. Метод проводится в живых бактериальных клетках и не требует дорогостоящего или сложного оборудования. Это полезно для количественной оценки и сравнения связывающих сходств различных RBPs, которые функционируют в бактериях, чтобы набор разработанных мест связывания. Этот метод может быть неподходящим для связывающих сайтов с высокой структурной сложностью. Это должно к возможности репрессии ribosomal инициации сложной структурой mRNA в отсутствии RBP, которое привело бы к в более низком базальном экспрессии гена репортера, и таким образом более менее-наблюдаемых репрессиях репортера на связывании RBP.
Introduction
В последние десятилетия широко изучалась регулировка после транскрипционного регулирования, основанного на РНК-связывающем белке (RBP), в частности, характеристика взаимодействия между РСП и РНК. Есть несколько примеров переводного вниз регулирования бактерий, происходящих из RBPs ингибирования, или непосредственно конкурировать с, рибосома связывания1,2,3. В области синтетической биологии, RBP-РНК взаимодействия становятся важным инструментом для разработки транскрипции на основе генетических схем4,5. Таким образом, растет спрос на характеристику таких взаимодействий RBP-RNA в клеточном контексте.
Наиболее распространенными методами для изучения белково-РНК взаимодействий являются электрофоретические передвижные переплет анализа (EMSA)6, который ограничивается в настройках пробирки, и различные выдвижные анализы7, в том числе метод CLIP8,9 . Хотя такие методы позволяют обнаружить de novo РНК связывания сайтов, они страдают от недостатков, таких как трудоемкие протоколы и дорогие глубокие реакции секвенирования и может потребовать конкретного антитела для вытягивания RBP. Из-за восприимчивого характера РНК к окружающей среде, многие факторы могут повлиять на взаимодействие RBP-РНК, подчеркивая важность допроса РБП-РНК связывания в клеточном контексте. Например, мы и другие продемонстрировали значительные различия между структурами РНК in vivo и in vitro10,11.
Основываясь на подходе предыдущего исследования12, мы недавно продемонстрировали10, что при размещении предварительно разработанных обязательных сайтов для капсида RBPs от бактериофагов GA13, MS214, PP7,иNo 16 в перевод инициации области репортера мРНК, репортер выражение сильно репрессированных. Мы представляем относительно простой и количественный метод, основанный на этом феномене репрессий, для измерения сродства между RBPs и их соответствующим ими связывающим сайтом РНКs in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка системы
- Дизайн обязательно-участок плазмиды
- Дизайн связывающей кассеты сайта, как показано на рисунке 1. Каждый миниген содержит следующие части (5' до 3'): Место ограничения Eagl, 40 оснований 5' конца гена сопротивления канамицина (Кан), промоутер pLac-Ara, место связывания рибосом (RBS), AUG гена mCherry, прокладка (я), место связывания RBP, 80 оснований 5' конца гена mCherry и места ограничения ApaLI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы увеличить частоту асссея, разработай три связывающих кассеты для каждого связывающего участка, с помощью прокладок, состоящих по крайней мере из одной, двух и трех баз. Дополнительные рекомендации по результатам работы с представителями.
- Дизайн связывающей кассеты сайта, как показано на рисунке 1. Каждый миниген содержит следующие части (5' до 3'): Место ограничения Eagl, 40 оснований 5' конца гена сопротивления канамицина (Кан), промоутер pLac-Ara, место связывания рибосом (RBS), AUG гена mCherry, прокладка (я), место связывания RBP, 80 оснований 5' конца гена mCherry и места ограничения ApaLI.
- Клонирование связывающих площадок сайта
- Закажите связывающие кассеты в виде двухцепочечных минигенов ДНК (dsDNA). Каждый миниген имеет длину 500 б.п. и содержит место ограничения Eagl и место ограничения ApaLI на концах 5' и 3', соответственно (см. шаг 1.1.1).
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте, мини-гены с половиной гена канамицина было приказано облегчить скрининг для положительных колоний. Тем не менее, Гибсон сборки17 также подходит здесь, и в этом случае связывание сайт может быть заказан в качестве двух коротких дополнительных одноцепочечных олигоДНК ДНК. - Двойной переваривание как мини-генов и целевой вектор с Eagl-HF и ApaLI по протоколу ограничения18, и столбец очистить19.
- Ligate переваренных minigenes к связывающей-сайт позвоночника, содержащего остальную часть гена репортера mCherry, терминатор, и ген анамицин устойчивости20.
- Преобразуйте раствор перевязки в клетки Escherichia coli TOP1021.
- Определите положительные трансформанты с помощью секвенирования Sanger.
- Дизайн грунтовки 100 баз вверх по течению к региону интереса (см. таблицу 1 для грунтовых последовательностей).
- Miniprep несколько бактериальных колоний22.
- Приготовьте 5 мкм раствора грунтовки и 10 л ДНК при концентрации 80 нг/Л.
- Отправить два решения на удобный объект для Секне секвенирования23.
- Храните очищенные плазмиды при -20 градусах по Цельсию, а также бактериальные штаммы в виде глицерола24,как в 96-хорошем формате. ЗАТЕМ ДНК будет использоваться для преобразования в клетки E. coli TOP10, содержащие одну из четырех плазмид слияния-RBP (см. шаг 1.3.5).
- Закажите связывающие кассеты в виде двухцепочечных минигенов ДНК (dsDNA). Каждый миниген имеет длину 500 б.п. и содержит место ограничения Eagl и место ограничения ApaLI на концах 5' и 3', соответственно (см. шаг 1.1.1).
- Проектирование и строительство плазмида РБП
ПРИМЕЧАНИЕ: Аминокислоты и нуклеотидные последовательности белков пальто, используемых в этом исследовании, перечислены в таблице 2.- Заказать требуемую последовательность RBP не хватает остановки кодон как заказ dsDNA minigene не хватает остановки кодон с ограничения сайтов на концах (Рисунок 1).
- Клон испытания RBP не хватает остановки кодон сразу вниз по течению индуцируемых промоутер и вверх по течению флуоресцентного белка не хватает начала кодон (Рисунок 1), похож на шаги 1.2.2-1.2.4. Убедитесь, что плазмида RBP содержит другой ген устойчивости к антибиотикам, чем обязательная плазмида.
- Определите положительные трансформанты с помощью секвенирования Sanger, аналогичного шагу 1.2.5 (см. таблицу 1 для последовательностей грунтовки).
- Выберите один положительный трансформатор и сделать его химически компетентным25. Хранить в качестве глицерола очищенные плазмиды при -20 градусах по Цельсию и глицерол запасы бактериальных штаммов24 при -80 градусах По цельсию в 96-колодцах пластин.
- Преобразуйте пласмиды связывающего участка (от шага 1.2.6), хранящиеся в 96-колодцах, в химически компетентные бактериальные клетки, уже содержащие плазмид RBP-mCerulean21. Чтобы сэкономить время, вместо того, чтобы накрывать клетки на чашках Петри, наклеиваем их на 8-канальный пипетки на 8-полосные тарелки, содержащие Лурию-Бертани (LB)26 агар агар агар асоответствующих антибиотиков (Kan и Amp). Колонии должны появиться в 16 ч.
- Выберите одну колонию для каждого двойного трансформанта и расти на ночь в среде LB с соответствующими антибиотиками (Кан и Amp) и хранить как глицерол запасов24 при -80 градусов по Цельсию в 96-колодцепластины.
2. Эксперимент настройки
ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный здесь протокол был выполнен с использованием робототехнической системы обработки жидкостей в сочетании с инкубатором и считывателем пластин. Каждое измерение проводилось для 24 концентраций индуктора, с двумя дубликатами для каждого штамма и индуктора комбинации. С помощью этой роботизированной системы были собраны данные по 16 штаммам в день с 24 концентрациями индуктора. Однако, если такое устройство недоступно, или если требуется меньше экспериментов, их можно легко сделать вручную с помощью 8-канальной мультипипетки и соответствующим образом адаптировать протокол. Например, таким образом были получены предварительные результаты по четырем штаммам в день с 12 концентрациями индуктора и четырьмя тайм-пойнтами.
- Приготовьте заранее 1 л биоасса-буфера (BA) путем смешивания 0,5 г триптона, 0,3 мл глицерола, 5,8 г NaCl, 50 мл 1 M MgSO4, 1 мл 10x фосфат-буферный солен (PBS) буфер рН 7,4 и 950 мл двойной дистиллированной воды (DD). Автоклав или стерильный фильтр буфер BA.
- Выращивайте двойные трансформанты при 37 градусах Цельсия и 250 об/мин, встряхивая в 1,5 мл ЛТ с соответствующими антибиотиками (канамицин при конечной концентрации 25 мкг/мл и ампициллин при конечной концентрации 100 мкг/мл), в 48-ну колодцев, в течение 18 л.с.
-
Утром сделайте следующие приготовления.
- Индуктора пластины. В чистой 96-хорошо пластины, подготовить скважины с полубедной среде (SPM), состоящей из 95% BA и 5% LB26 в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию. Количество скважин соответствует желаемому количеству концентраций индуктора. Добавьте C4-HSL к скважинам в пластине индуктора, которая будет содержать самую высокую концентрацию индуктора (218 нм).
- Программа робота, чтобы последовательно разбавить среду от каждой из скважин с высокой концентрацией в 23 нижних концентраций, начиная от 0 до 218 нм. Объем разбавления каждого индуктора должен быть достаточным для всех штаммов (включая дубликаты).
- В то время как разбавления индуктора готовятся, тепло 180 л SPM в инкубаторе при 37 градусах Цельсия, в 96-колодцах пластин.
- Разбавить ночные штаммы со ступени 2,2 в 100 раз серийными разбавлениями: сначала разбавить в 10 раз, смешивая 100 л бактерий с 900 л SPM в 48-ну хорошо пластины, а затем разбавить снова в 10 раз, взяв 20 qL от разбавленного раствора в 180 л предварительно разогретого SPM, в 96-хорошо пластин, пригодных для флуоресцентных измерений.
- Добавьте разбавленный индуктор из индуктора в 96-колодцы пластины с разбавленными штаммами в соответствии с окончательными концентрациями.
- Встряхните 96-колодственные пластины при температуре 37 градусов по Цельсию на 6 ч, при измерении оптической плотности на уровне 595 нм (OD595),mCherry (560 нм/612 нм) и mCerulean (460 нм/510 нм) флуоресценции через плиту читателя каждые 30 минут. Для целей нормализации измеряйте рост СМП без добавления ячеек.
3. Предварительный анализ результатов
- Для каждого дня эксперимента выбирайте временной интервал логарифмического роста в соответствии с измеренными кривыми роста, между фазой линейного роста и стационарной (T0, Tfinal). Возьмите примерно 6-8 временных точек, отбрасывая первые и последние измерения, чтобы избежать погрешности, полученной из неточности экспоненциального обнаружения роста (см. рисунок 2A, верхняя панель).
ПРИМЕЧАНИЕ: Откажитесь от штаммов, которые показывают аномальные кривые роста или штаммы, где логарифмическая фаза роста не может быть обнаружена, и повторите эксперимент. -
Рассчитайте среднюю нормализованную флуоресценцию мцерулеана и скорость производства mCherry, из необработанных данных как mCerulean, так и mCherry флуоресценции для каждой концентрации индуктора(рисунок 2A).
- Рассчитайте нормализованный mCerulean следующим образом:
где пустой (mCerulean) является mCerulean уровнем (a.u.) для среднего только, пустой (OD) является оптическая плотность только для среднего только, и mCerulean и OD являются mCerulean флуоресценции и оптической плотности значения, соответственно. - Средний mCerulean над различными точками времени(рисунок 2B, верхние 2 панели) следующим образом:
где #Time точками является количество данных тайм-точек, принятых во внимание, T0 это время, в котором начинается экспоненциальная фаза роста, и Tfinal это время, в котором экспоненциальная фаза роста заканчивается. - Рассчитайте скорость производства mCherry(рисунок 2B,две нижние панели) следующим образом:
где mCherry(t) является уровнем mCherry в то время т, OD является значением оптической плотности, T0 это время, в котором начинается экспоненциальная фаза роста, а Tfinal – это время, в которое заканчивается экспоненциальная фаза роста.
- Рассчитайте нормализованный mCerulean следующим образом:
- Наконец, участок mCherry скорость производства в качестве функции mCerulean, создавая кривые реакции дозы в качестве функции RBP-mCerulean фьюжн(Рисунок 2C). Такие участки представляют собой производство гена репортера как функцию присутствия RBP в клетке.
4. Функция реагирования дозы Fitting Routine и KRBP Extraction
- Исходя из предположения, что рибосомная скорость перевода с привязанной РБП постоянна, моделируйте скорость производства mCherry следующим образом (см. рисунок 2D,зеленая линия):
где «x» является нормализованной средней мцерулеановой флуоресценции, рассчитанной в соответствии с Eq. 2, скорость производства mCherry является значением, рассчитанным в соответствии с Eq. 3, KRBP является относительной связывающей сродством ,a.u.), Kunbound является рибосомной скоростью перевод с RBP несвязанным, n является фактором куперативности, а C является базовой флуоресценцией .u. C, n, Kunboundи KRBP можно найти, приспосабливая данные о скорости производства mCherry к модели (Eq. 4). - С помощью программного обеспечения для анализа данных, провести установку процедуры на участках, изображающих скорость производства mCherry в качестве функции усредненного mCerulean (шаг 3.3), и извлечь соответствующие параметры в соответствии с формулой в Eq. 4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Учитываются только соответствующие результаты с R2 и 0,6. Для тех, кто подходит, KRBP ошибка в основном в диапазоне от 0,5% до 20% от KRBP значения, для 0,67 доверительный интервал, в то время как те, с более высокой kRBP ошибка может быть также проверена глазом. - Нормализовать значения KRBP по соответствующей максимальной стоимости усреднения mCerulean для каждой функции реакции дозы.
где KRBP в «a.u.» — это значение, извлеченное из процедуры установки в Eq. 4, а макс (средний mCerulean) — это максимальный усредненный mCerulean сигнал «a.u», наблюдаемый для текущего штамма.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация облегчает правильное сравнение регулирующего эффекта между штаммами, устраняя зависимость от конкретных максимальных уровней выражения RBP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленный метод использует конкуренцию между RBP и ribosome для связывать к молекуле мРНК (рисунок1). Эта конкуренция находит свое отражение в снижении уровня mCherry как функции увеличения производства RBP-mCerulean, в связи с увеличением концентрации индуктора. В случае увеличения мцерулеановой флуоресценции, без каких-либо существенных изменений в mCherry, выводится отсутствие привязки RBP. Представительрезультаты как положительного, так и отрицательного напряжения изображены на рисунке 2. На рисунке 2A, OD, mCherry, и mCerulean каналы представлены как функция времени и индуктор в течение четырех часов, с T0 й 1 ч и Tокончательный 3,5 ч. На рисунке 2B,усредненная мцерулеана флуоресценция (вверху) и mCherry скорость производства (внизу) представлены как функция концентрации индуктора, для двух примеров штаммов. Как видно, результаты положительного штамма отображают явный вниз-регуляторный эффект в mCherry скорость производства(рисунок 2B, C), что приводит к значительным ненулевое значение KRBP (Рисунок 2D). Для положительного напряжения, процедура установки дала следующие значения: KRBP 394.6 a.u., Kunbound 275.6, n 2.1, C 11.2 a.u., и R2 й 0.93. После нормализации максимальной мцеруленовой флуоресценции значение KRBP составило 0,24. Для отрицательного напряжения, отсутствие четкого ответа наблюдалось(Рисунок 2C), и не KRBP значение было извлечено (рисунок2D).
На рисунке 3, мы представляем результаты этого исследования для двух фаговых пальто RBPs, PP7 и MS2, на нескольких мутировавших связывающих участках, в разных местах в пределах области инициации mCherry mRNA. Результаты примерно классифицируются на три вида ответов(рисунок 3A):штаммы, демонстрирующие эффект вниз-регулирования на низком мцерулеайском уровне, отражающие низкое значение KRBP (высокая связывающая близость); штаммы, демонстрирующие вниз-регулятивное воздействие на промежуточных или высоких уровнях mCerulean, отражающие высокое значение KRBP (промежуточное или низкое сродство); и штаммы, не проявляющие четкой реакции на повышение уровня mCerulean, отражающие более высокое значение KRBP, чем максимальная концентрация RBP в клетке (без обнаруживаемой связующей близости). На рисунке 3B представлено минимальное значение KRBP, вычисленный для каждой комбинации RBP-binding-сайта, основанной на всех комбинациях двух RBP и десяти обязательных участках на разных позициях. Сайты связывания включают отрицательный контроль (без связывающего сайта), несоответствующие обязательные участки, а также положительный контроль - родной сайт связывания для каждого RBP (PP7-Wt для белка слоя PP7 (PCP) и MS2-wt для белка ms2 пальто (MCP). Результаты соответствуют прогнозам, так как оба RBP представляют высокое сродство к их положительному контролю, и необнаруживаемое связывающее сродство к отрицательному контролю. Кроме того, предыдущие исследования с использованием этих двух RBPs27,28 отметили, что они являются ортогональными, что четко передается в тепловой карте представлены: как MCP и PCP не связывают родной сайт другого RBP. Кроме того, мутители связывающих сайтов представляют различные результаты, где некоторые привязки сайтов отображаются такой же уровень сродства, как и у родного сайта, таких как PP7-mut-1, PP7-mut-2 и MS2-mut-3, в то время как другие отображаются значительно более низкое сродство, например PP7-mut-3 и MS2-mut-2. Таким образом, в ходе опроса представлено количественное измерение связывающей близости РбОП, что дает результаты, сопоставимые с результатами прошлых экспериментов с этими ОДП.
Так как анализ основан на подавлении гена mCherry, необходим жизнеспособный сигнал mCherry. Таким образом, при проектировании обязательной кассеты сайта, Есть два правила проектирования, чтобы иметь в виду. Во-первых, следует сохранить открытую рамку для чтения (ORF) mCherry. Так как длина привязки участка может варьироваться, вставка в ген может привести к смещению одной или двух оснований от первоначального mCherry ORF. Поэтому, при необходимости(рисунок 4A),вставьте одну или две базы сразу вниз по течению к месту связывания. Например, связывающий участок длиной 20 баз, с двумя основаниями, даст добавление 22 оснований к гену mCherry. Чтобы сохранить ORF, нам нужно добавить две базы, в общей сложности 24 базы. Второе правило проектирования заключается в том, чтобы избежать вставки стоп-кодонов в mCherry ORF. Некоторые связывающие участки, как MS2-mut-2(рисунок 4B,вставка), содержат стоп-кодоны, когда расположены в одном или нескольких из трех возможных ORF. Такой пример иллюстрируется на рисунке 4A, где привязка сайта содержит стоп-кодон, который находится в кадре с mCherry ORF только тогда, когда не добавляются основания. Как видно из кривой доза-реакции для этой позиции(рисунок 4B),скорость производства mCherry была необнаружима, таким образом, связывающее сродство не могло быть измерено.
Пристальный взгляд на рис учёбу 4B демонстрирует влияние интервала на производство mCherry. Например, для No 4, базальная скорость производства была в шесть раз больше, чем для No 5, обеспечивая более высокий эффект складных репрессий. Однако для No 14 уровни базального производства были слишком низкими, чтобы наблюдать эффект снижения регулирования.
Рисунок 1: Обзор системного проектирования и шагов клонирования. Иллюстрация конструкции кассеты для связывающего участка плазмида (слева) и RBP-mCerulean plasmid (справа). Следующим шагом является последовательные преобразования обеих плазмидов в компетентные клетки кишечной палочки, причем плазмиды RBP в первую очередь. Двойные трансформанты затем проверяются на их уровень экспрессии mCherry в увеличении концентраций индуктора; если RBP привязывается к связывающей площадке, уровни mCherry снижаются как функция mCerulean (серый пузырь). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схема анализа. (A) Трехмерные (3D) участки, изображающие сырые уровни OD (вверху), мцерулеан флуоресценции (средний), и mCherry флуоресценции (внизу) в качестве функции времени и индуктор концентрации, для положительного напряжения. (B) Топ: mCerulean устойчивый состояние уровня экспрессии для каждого индуктора концентрации вычисляется путем деления каждого уровня флуоресценции на соответствующие OD и усреднение по всем значениям в 2'3 h экспоненциальный промежуток времени роста для обоих положительных (слева) и отрицательные (справа) штаммы. Внизу: скорость производства mCherry, рассчитанная в соответствии с Eq. 3 для тайм-пойнтов 2'3 h после индукции. (C) скорость производства mCherry построена как функция среднего мцерулеана флуоресценции в среднем более двух биологических дубликатов для двух штаммов. Ошибки баров являются стандартным отклонением как mCherry скорость производства и усредненная мцерулеан флуоресценция, приобретенных по крайней мере два репликации. (D) Подходит для KRBP с использованием подходящей формулы в Eq. 4 показано для положительного штамма (слева), демонстрируя конкретный обязательный ответ. Для отрицательного напряжения (справа) не было извлечено значения KRBP. Данные отображаться в дубликате. Эта цифра была адаптирована с разрешения Каца и др.10. Авторское право 2018 Американское химическое общество. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Представитель окончательные результаты. (A) Нормализованные кривые дозы-реакции для тридцати различных штаммов на основе двух RBPs и десять связывающих сайтов в разных местах. Наблюдаются три типа ответов: высокая близость, низкое сродство и отсутствие сродства. (B) Количественные k результатыRBP для двух RBPs (MCP и PCP) с пятью различными связывающими кассетами сайта (перечислены). Все штаммы RBP-binding-site были измерены в дубликате. Эта цифра была адаптирована с разрешения Каца и др.10. Авторское право 2018 Американское химическое общество. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Пример дизайна и результатов для MCP с местом связывания мутантов. (A) Дизайн иллюстрации связывающих кассет сайта в четырех различных местах. Кассета в том числе рибосомы связывания сайта, начать кодон для mCherry, я spacer базы, связывание сайт испытания, одна или две базы для поддержания ORF, а остальная часть гена mCherry. Красные звезды указывают на стоп-кодон. (B) Кривые дозы-реакции для MCP с местом связывания мутанта на 4 по-разному положениях. Вливание: последовательность проверенного мутировавого сайта связывания. Представленные результаты для дубликатов каждого штамма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Имя | Местоположение сайта Binidng, A в AUG No 1 | Связывание последовательности сайта (RBS для элементов управления) | Сайт: ATG на второй mCherry Кодон GTG Элементы управления: RBS на второй mCherry Кодон GTG |
Источник |
| MS2-wt'd5 | 5 | acatgaggattacccatgt | atgcacatgaggattacccatcgtgg | Gen9 Inc. |
| MS2-wt'd6 | 6 | acatgaggattacccatgt | atggcacatgaggattacccatgtgtg | Gen9 Inc. |
| MS2-wt'd8 | 8 | acatgaggattacccatgt | atggcgcacatgaggattacccatgtgt cgtg |
Gen9 Inc. |
| MS2-wt'd9 | 9 До 9 | acatgaggattacccatgt | atggcgccacatgaggattacccatcatg tgtg |
Gen9 Inc. |
| МС2-У (-5)Кзд8 | 8 | acatgaggatcacccatgt | atgcacatgaggatcacccatgtgg Tg |
Gen9 Inc. |
| МС2-У (-5)КЗД9 | 9 До 9 | acatgaggatcacccatgt | atggcacatgaggatcacccatgtg Tg |
Gen9 Inc. |
| МС2-У (-5)Кзд8 | 8 | acatgaggacccatgt | atgcacatgaggacccatgtgg Tg |
Gen9 Inc. |
| МС2-У (-5)Гёд9 | 9 До 9 | acatgaggacccatgt | atggcacatgaggacccatgtg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2-struct-d9 | 9 До 9 | cacagaggttcacttatg | atggccacaagaggaggttcacttatgg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2-struct-d8 | 8 | cacagaggttcacttatg | atgccacaagaggttcacttattttggg Tg |
Gen9 Inc. |
| PP7wt'd5' | 5 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgctaaggagtttattatggaaacc cttacgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7wt'd6' | 6 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgaataaggagtttatgagggaaaac ccttagtg |
Твист Бионаука |
| PP7wt'd8' | 8 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgaacataaggagtttatgagggaa acccttacgtg |
Твист Бионаука |
| PP7wt'd9' | 9 До 9 | taaggagtttatatggaaaccctta | atgaacaataaggagtttatatggga aacccttagtg |
Твист Бионаука |
| PP7-USLSBm-d6 | 6 | taaccgcttttatggaaagggtta | atggctaaccgcttttatggaag ggttagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7-USLSBm-d15 | 15 лет | taaccgcttttatggaaagggtta | atgggcgcgcggcgcttttta tatggaaagggttagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7'nB'd5 | 5 | taagggtttatatggaaaccctta | atgctaagggtttattatggaaaaccc ttagcgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7'nB'd6 | 6 | taagggtttatatggaaaccctta | atggctaagggtttattaaacc cttatgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7-USs-d5 | 5 | taaggagttatatggaaccctta | atgctaaggagtatatggaaccct tagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7-USs-d6 | 6 | taaggagttatatggaaccctta | atggctaaggagtatattatggaccc ttagcgtg |
Gen9 Inc. |
| Но-БСЗД1 | - | - | ttaaagaggagaaggtacccatgg Tg |
Gen9 Inc. |
| No-BS'd4 | - | - | ttaaagaggagaaggtacccatgg gcgtg |
Gen9 Inc. |
| No-BS'd10 | - | - | ttaaagaggagaaggtacccatgg gcgcgcgcgtg |
Gen9 Inc. |
| Секвенирование грунтовки для связывающих кассет сайта | gcatttttttatatatatagattagcgg | Idt | ||
| Секвенирование грунтовки для кассет RBP | gcggcgctctctctaataaa | Idt | ||
Таблица 1: Связывание сайтов и секвенирование грунтовок. Последовательности для связывающих сайтов и связывающих кассет сайта, используемых в данном исследовании, а также праймеры для последовательности реакций, описанных в протоколе (шаги 1.2.5.1 и 1.3.3).
| Название RBP в этой работе | название источника, белок | источник гена организма источника | источник организма refseq | wt aa seq | изменения от wt (и ссылки) | аа seq используется в этой работе | nt seq, используемый в этой работе |
| Mcp | Вирус Эшеричия MS2 | Cp | NC-001417.2 | МАСНФТ-ФЛВЛВ DNGGTGDVTV APSNFANGVA EWISSNSRS АЙКВТКСВРЗ САЗННРКИТИ КВВЕВКВАТЗТ ВГГВЕРПВА АВРСИЛНМЕЛ TIPIFATNSD ЦЕЛЕВКАМЗГ LLKDGNPIPS АИААНСГИЯ |
delF-G (1) V29I взятые из адгенной плазмиды 27121 |
МАСНФТ-ФЛВЛВ DNGGTGDVTV АПСНФАНГИЯ EWISSNSRS АЙКВТКСВРЗ САЗННРКИТИ КВВЕВПКГ АВРСИЛНМЕЛ TIPIFATNSD ЦЕЛЕВКАМЗГ LLKDGNPIPS АИААНСГИЯ |
ATGGCTTCTA АКТТАКТКА ГТТКГТТКТКК ГЦКГАКААТГ GCGGAACTGG CGACGTGACT GTCGCCCCAA GCAACTTCGC ТААКГГАЦ GCTGAATGGA TCAGCTCTAA CTCGCGTTCA CAGGCTTACA AAGTAACCTG TAGCGTTCGT КАГАГКТЦГ CGCAGAATCG CAAATACACC ATCAAAGTCG AGGTGCCTAA AGGCGCCTGG CGTCGTACT ТАААТАТГГА АКТАККАТ CCAATTTTCG ЦКАКААТТК CGACTGCGAG CTTATTGTTA AGGCAATGCA АГГГТЦКТА АааГАТГААА ACCCGATTCC КЦКАЧААТК GCAGCAAACT CCGGCATCTAC |
| Pcp | Псевдомонас фаг PP7 | Cp | NC-001628.1 | MSKTIVLSVGEA ТРТЛТЕИЗСТ АДРЗИФеКВ GPLVGRLRLT АСЛРЗНАКТ АИРВНЛЛД ADVVDCSTSVC GELPKVRYT VWSHDVTIVA NSTEASRKSL YDLTKSLVAT СВЕДЛВНЛ VPLGR |
delF-G взятые из адгенной плазмиды 40650 |
МЛСКТИВЛСВГ УАТРТЛТЕИС СТАДРЗИФЕ КВГПЛВГРЛР ЛТАСЛРНГА KTAYRVNLKL ДЗАДВВДСГ LPKVRYT-VW SHDVTIVANS TEASRKSLYD LTKSLVATSQ VEDLVVNLVP Lgr |
ATGCTAGCCTC КААААККК ГТТТТТЦГГ TCGGCGAGGC ТАКТККАКТА КТГАКТАГАГА TCCAGTCCAC CGCAGACCGT CAGATCTTCG ААГАГАГГГТ CGGGCCTCTG ГТГГГГГГК TGCCTCAC GGCTTCGCTC CGTCAAAACG ГАГаКААГАК CGCGTATCGCC GTCAACCTAA АКТГГАЦА GGCGGACGTC ГТТГАТТКГ ГАКТЦГАА АГТГГКСТАК АКТКАГГТАТ GGTCGCACGA CGTGACAATC ГТТГКГААТА GCACCGAGGC CTCGCGCAAA TCGTTGTACG АТТГАККАА GTCCCTCGTC GCGACCTCGC AGGTCGAAGA TCTTGTCGTC ААККТГГГК CGCTGGGCCGT |
| Ссылки: | |||||||
| 1.Пибоди, D.S., Ely, K.R. Контроль трансляционных репрессий белково-белковыми взаимодействиями. Нуклеиновой кислоты исследований. 20 (7), 1649-1655 (1992). | |||||||
| 2. Чао, Я.А., Пацковский, Я., Альмо, S.C., Сингер, R.H. Структурная основа для коэволюции вирусного РНК-белкового комплекса. Природа Структурная и молекулярная биология. 15 (1), 103-105, дои: 10.1038/nsmb1327 (2008) | |||||||
Таблица 2: Последовательности RBP. Аминокислоты и нуклеотидные последовательности белков пальто, используемых в этом исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, описанный в этой статье, облегчает количественное измерение связывания СВЯЗывающей РБП-РНК в клетках кишечной палочки. Протокол относительно прост и может быть проведен без использования сложного оборудования, а анализ данных прост. Кроме того, результаты получаются сразу же, без относительно длительного времени ожидания, связанного с результатами секвенирования следующего поколения (NGS).
Одним из ограничений этого метода является то, что он работает только в бактериальных клетках. Однако, предыдущее изучение12 продемонстрировало влияние репрессии используя подобный подход для RBP L7AE в mammalian клетках. Дополнительным ограничением метода является то, что вставка связывающего участка в области инициирования mCherry может подавлять базальные уровни mCherry. Структурная сложность или высокая устойчивость связывающего участка могут помешать рибосомной инициации даже при отсутствии РБП, что приводит к снижению базальных уровней mCherry. Если базальные уровни будут слишком низкими, то дополнительные репрессии, вызванные повышением концентрации РБП, не будут наблюдаться. В таком случае лучше всего спроектировать связывающую кассету сайта с связывающим участком, все еще наделенный областью инициации, но на грани перехода от области посвящения к области удлинения (в диапазоне 12-15 б.п.10,29). Мы показали, что для таких значений все еще можно наблюдать репрессии. Чтобы увеличить вероятность того, что асссс будет работать, независимо от структурной сложности, мы советуем выполнять ассспование по крайней мере на трех различных позициях для данного связывающего сайта.
Основным недостатком метода по сравнению с методами in vitro, такими как EMSA, является то, что связывающая близость RBP-РНК измеряется не в абсолютных единицах концентрации РБП, а скорее с точки зрения флуоресценции флоссома. Этот недостаток является прямым результатом настройки in vivo, что ограничивает нашу способность зачитывать фактические концентрации RBP. Этот недостаток компенсируется преимуществами измерения в настройках in vivo. Например, мы обнаружили различия в связывающей сродства при сравнении результатов нашего анализа in vivo с предыдущими анализами in vitro и in situ. Эти различия могут вытекать из расхождений в структуре молекул мРНК in vivo, которые возникают из их присутствия внутри клеток10,11,30,31. Такие структурные различия могут привести к изменениям в стабильности сложенных состояний in vivo, которые, в свою очередь, либо стабилизируют, либо дестабилизируют связывание RBP.
Поскольку метод является относительно простым и недорогим, мы советуем запустить несколько элементов управления наряду с фактическим экспериментом. Запуск отрицательного контроля, т.е. последовательности, которая не имеет сродства к RBP еще имеет аналогичные структурные особенности, может помочь избежать ложных срабатываний, вытекающих из неспецифических взаимодействий с мРНК. В представленных репрезентативных результатах двумя отрицательными элементами контроля были только ген mCherry (без места связывания) и родной сайт связывания другого RBP (т.е. PP7-wt для MCP и MS2-wt для PCP). Кроме того, мы предлагаем включить положительный контроль (например, RBP и его родной сайт связывания). Такой контроль поможет количественно определить связующую близость, представляя точку отсчета, и избежать ложных негативов, вытекающих из низких складных репрессий.
Наконец, для тех, кто хочет получить структурную перспективу связывания RBP-РНК, мы предлагаем провести селективный 2'гидроксилового акиляции проанализированы грунтовки секвенирования расширения (SHAPE-Seq)11,32,33 Эксперимент. SHAPE-Seq является подходом NGS в сочетании с химическим зондированием РНК, который может быть использован для оценки вторичной структуры РНК, а также взаимодействия РНК с другими молекулами, такими как белки. В нашей предыдущей работе мы провели эксперимент SHAPE-Seq на репрезентативном штамме как в условиях vivo34, так и in vitro с очищенным рекомбинантным белком10,35. В нашем случае, результаты показали, что RBP-связывание повлияло на гораздо более широкий сегмент РНК, чем сообщалось ранее для этих RBPs в пробирке36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Этот проект получил финансирование от Программы I-CORE Комитета по планированию и бюджетированию и Израильского научного фонда (Грант No 152/11), Гранта Марии Кюри по вопросам реинтеграции No. PCIG11-GA- 2012-321675, а также из программы исследований и инноваций Европейского союза Horizon 2020 по грантовому соглашению No 664918 - MRG-Grammar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8-lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| Glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| Incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| Ligase | NEB | B0202S | |
| Liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| Multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| Platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| Sodium Chloride (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
References
- Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).
- Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. Regulation of translation initiation by RNA binding proteins. Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).
- Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria. Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).
- Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).
- Bendak, K., et al. A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein. Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).
- Strein, C., Alleaume, A. -M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells. RNA. 20 (5), 721-731 (2014).
- Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
- Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
- Katz, N., et al. An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).
- Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Methods. 103, 34-48 (2016).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA. Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).
- Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
- Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
- Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein. Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- NEB. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions. , Available from: https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions (2018).
- Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol. , Available from: https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/ (2018).
- NEB. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202). , Available from: https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202 (2018).
- Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html (2018).
- NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit. , Available from: https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx (2018).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Addgene. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/ (2018).
- NEB. Making your own chemically competent cells. , Available from: https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells (2018).
- Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling. , Available from: https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation (2018).
- Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo. Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).
- Espah Borujeni, A., et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505, (2013).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486 (2015).
- Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq. Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).
- Bernardi, A., Spahr, P. -F. Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).
