Summary
I denna metod, vi kvantifiera bindningen affiniteten av RNA bindande proteiner (RBPs) till besläktat och icke-kognate bindningsställen med hjälp av en enkel, levande, reporter assay i bakterieceller. Analysen bygger på förtryck av en reporter gen.
Abstract
I inlednings steget av protein omräkning binder ribosom binds till initierings regionen av mRNA. Initiering av översättningen kan blockeras genom bindning av ett RNA-bindande protein (RBP) till initierings regionen för mRNA, som stör ribosom bindning. I den presenterade metoden använder vi detta blockerande fenomen för att kvantifiera bindningsaffiniteten hos RBPs till deras besläktat och icke-kognate bindningsställen. För att göra detta infogar vi en test bindnings plats i initierings regionen för en reporter mRNA och inducerar uttrycket för test-RBP. När det gäller RBP-RNA-bindning, observerade vi en sigmodala förtryck av reportern uttryck som en funktion av RBP koncentration. I fråga om ingen affinitet eller mycket låg affinitet mellan bindningsstället och RBP observerades inget signifikant förtryck. Metoden utförs i levande bakterieceller och kräver inte dyra eller sofistikerade maskiner. Det är användbart för att kvantifiera och jämföra mellan de bindande tillhörighet av olika RBPs som är funktionella i bakterier till en uppsättning utformade bindnings platser. Denna metod kan vara olämplig för bindningsställen med hög strukturell komplexitet. Detta är tack vare möjligheten av repression av ribosomal påbörjande vid komplex mRNA strukturerar i frånvaroen av RBP, som skulle resultat i lägre basal reporter genuttryck, och thus mindre-observable reporter repression på RBP-bindning.
Introduction
RNA-bindande protein (RBP)-baserad post-transkriptionell reglering, särskilt karakterisering av samspelet mellan RBPs och RNA, har studerats i stor utsträckning under de senaste decennierna. Det finns flera exempel på translationell Down-reglering hos bakterier som härstammar från RBPs-hämmande, eller direkt konkurrerar med, ribosom bindning1,2,3. Inom området syntetisk biologi, RBP-RNA interaktioner växer fram som ett viktigt verktyg för utformningen av transkription-baserade genetiska kretsar4,5. Därför finns det en ökning av efterfrågan på karakterisering av sådana RBP-RNA interaktioner i en cellulär kontext.
De vanligaste metoderna för att studera protein-RNA interaktioner är den elektroforetiska Mobility Shift assay (EMSA)6, som är begränsad till in vitro-inställningar, och olika pull-down-analyser7, inklusive Clip metod8,9 . Även om sådana metoder möjliggör upptäckten av de Novo RNA bindningsställen, de lider av nackdelar såsom arbetsintensiva protokoll och dyra djupsekvensering reaktioner och kan kräva en specifik antikropp för RBP pull-down. På grund av den mottagliga karaktären av RNA till sin omgivning, många faktorer kan påverka RBP-RNA interaktioner, betonar vikten av förhör RBP-RNA bindning i cellulära sammanhang. Till exempel har vi och andra visat signifikanta skillnader mellan RNA-strukturer in vivo och in vitro-10,11.
Baserat på tillvägagångssättet i en tidigare studie12, visade vi nyligen10 att när du placerar på förhand utformade bindningsställen för kapsid RBPs från bakteriophages ga13, MS214, PP715, och qβ16 i översättnings initiering region för en reporter mRNA, reporter uttryck är starkt nedtryckt. Vi presenterar en relativt enkel och kvantitativ metod, baserad på detta förtryck fenomen, för att mäta affinitet mellan RBPs och deras motsvarande RNA-bindningsställes in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. system förberedelse
- Konstruktion av bindplatplasmider
- Utforma kassetten för bindnings platsen enligt figur 1. Varje minigene innehåller följande delar (5 ' till 3 '): Eagl begränsning webbplats, ∼ 40 baser av 5 ' slutet av kanamycin (kan) Resistance Gene, pLac-Ara promotor, Ribosomen bindnings plats (RBS), AUG av mCherry genen, en spacer (δ), en RBP bindnings plats, 80 baser av 5 ' End av mCherry-genen och en ApaLI-restriktionsssida.
Anmärkning: För att öka framgången för analysen, designa tre bindnings plats kassetter för varje bindningsställe, med distansen som består av minst en, två och tre baser. Se representativa resultat avsnitt för ytterligare riktlinjer.
- Utforma kassetten för bindnings platsen enligt figur 1. Varje minigene innehåller följande delar (5 ' till 3 '): Eagl begränsning webbplats, ∼ 40 baser av 5 ' slutet av kanamycin (kan) Resistance Gene, pLac-Ara promotor, Ribosomen bindnings plats (RBS), AUG av mCherry genen, en spacer (δ), en RBP bindnings plats, 80 baser av 5 ' End av mCherry-genen och en ApaLI-restriktionsssida.
- Kloning av plasmider för bindningsställe
- Beställ bindnings plats kassetter som dubbelsträngade DNA (dsDNA) minigener. Varje minigene är ∼ 500 BP lång och innehåller en Eagl begränsning webbplats och en ApaLI begränsning webbplats vid 5 ' och 3 ' ändar, respektive (se steg 1.1.1).
Anmärkning: I detta experiment, mini-gener med hälften av kanamycin genen beordrades att underlätta screening för positiva kolonier. Dock är Gibson Assembly17 också lämplig här, i vilket fall bindningsstället kan beställas som två kortare kompletterande enda STRANDSATTA DNA oligos. - Dubbel-smälta både mini-gener och målvektorn med eagl-HF och Apali av begränsnings protokollet18, och kolumn rena19.
- Ligate den smälta minigenes till bindning-plats stamnät som innehåller resten av mCherry reporter genen, Terminator, och en kanamycin Resistance Gene20.
- Omvandla ligeringslösningen till Escherichia coli topp-celler21.
- Identifiera positiva transformanter via Sanger-sekvensering.
- Designa en primer 100 baser uppströms till den region av intresse (se tabell 1 för primer sekvenser).
- Miniprep några bakteriella kolonier22.
- Bered 5 μL av en 5 mM lösning av primern och 10 μL av DNA vid 80 ng/μL koncentration.
- Skicka de två lösningen till en bekväm anläggning för Sanger-sekvensering23.
- Förvara renade plasmider vid-20 ° c, och bakteriestammar som glycerol lager24, både i 96-well format. DNA kommer sedan att användas för omvandling till E. coli -topp-celler som innehåller en av fyra fusion-RBP-plasmider (se steg 1.3.5).
- Beställ bindnings plats kassetter som dubbelsträngade DNA (dsDNA) minigener. Varje minigene är ∼ 500 BP lång och innehåller en Eagl begränsning webbplats och en ApaLI begränsning webbplats vid 5 ' och 3 ' ändar, respektive (se steg 1.1.1).
- Design och konstruktion av RBP plasmid
Anmärkning: Aminosyran och nukleotidsekvenser av de skikt proteiner som används i denna studie listas i tabell 2.- Beställ den nödvändiga RBP-sekvensen som saknar stopp kodon som en skräddarsydd dsDNA-minigen som saknar stopp kodon med begränsnings platser i ändarna (figur 1).
- Klona den testade RBP saknar en stop kodon omedelbart nedströms en inducerbar promotor och uppströms ett fluorescerande protein som saknar en start kodon (figur 1), liknande steg 1.2.2-1.2.4. Se till att RBP plasmid innehåller en annan antibiotikaresistensgen än bindningsstället plasmid.
- Identifiera positiva transformanter via Sanger-sekvensering, liknande steg 1.2.5 (se tabell 1 för primer-sekvenser).
- Välj en positiv transformant och göra den kemiskt kompetenta25. Förvara som glycerol renad plasmider vid-20 ° c och glycerol lager av bakteriestammar24 vid-80 ° c i 96-bra tallrikar.
- Omvandla bindningsstället plasmider (från steg 1.2.6) lagras i 96-väl plattor i kemiskt kompetenta bakterieceller som redan innehåller en RBP-mCerulean plasmid21. För att spara tid, istället för att plätera cellerna på petriskålar, platta dem med en 8-kanals multikanalspipettor på 8-Lane plattor som innehåller Luria-Bertani (LB)26 agar med relevanta antibiotika (kan och amp). Kolonier bör förekomma i 16 h.
- Välj en enda koloni för varje dubbel transformant och växa över natten i LB medium med relevanta antibiotika (kan och amp) och lagra som glycerol lager24 vid-80 ° c i 96-bra tallrikar.
2. inställning av experiment
Anmärkning: Det protokoll som presenteras här utfördes med hjälp av ett robotsystem för vätskehantering i kombination med en inkubator och en Plattläsare. Varje mätning utfördes för 24 inducerare koncentrationer, med två dubbletter för varje stam + inducerare kombination. Med hjälp av detta robotsystem samlades data för 16 stammar per dag med 24 inducerare-koncentrationer. Men om en sådan enhet inte är tillgänglig, eller om färre experiment är nödvändiga, kan dessa enkelt göras för hand med hjälp av en 8-kanals multipipett och anpassa protokollet därefter. Till exempel, preliminära resultat för fyra stammar per dag med 12 inducerare koncentrationer och fyra tidspunkter förvärvades på detta sätt.
- Förbered, i förväg, 1 L bioassay buffert (BA) genom att blanda 0,5 g Tryptone, 0,3 mL glycerol, 5,8 g av NaCl, 50 mL 1 M MgSO4, 1 ml av 10X fosfatbuffrad SALTLÖSNING (PBS) buffert pH 7,4, och 950 ml dubbeldestillerat vatten (DDW). Autoklav eller sterilt filtrera BA-bufferten.
- Odla dubbelomvandlande stammar vid 37 ° c och 250 rpm skakning i 1,5 mL LB med lämplig antibiotika (kanamycin vid en slutlig koncentration av 25 μg/mL och ampicillin vid en slutlig koncentration av 100 μg/mL), i 48-väl plattor, under en period av 18 h (över natten).
-
På morgonen, gör följande förberedelser.
- Inducerare plattan. I en ren 96-brunn platta, förbereda brunnar med halv fattiga medium (SPM) bestående av 95% BA och 5% LB26 i inkubatorn vid 37 ° c. Antalet brunnar motsvarar det önskade antalet inducerare koncentrationer. Tillsätt C4-HSL till brunnarna i inducerare plattan som kommer att innehålla den högsta inducerare koncentrationen (218 nM).
- Program mera roboten till seriellt utspädd medium från var och en av de högsta koncentrationsbrunnarna till 23 lägre koncentrationer mellan 0 och 218 nM. Volymen av varje inducerare utspädning bör vara tillräcklig för alla stammar (inklusive dubbletter).
- Medan inducerare spädningar förbereds, varm 180 μL av SPM i inkubatorn vid 37 ° c, i 96-bra tallrikar.
- Späd över natten stammar från steg 2,2 med en faktor 100 genom seriella utspädningar: först spädas med en faktor 10 genom att blanda 100 μL av bakterier med 900 μL av SPM i 48-väl plattor, och sedan späda igen med en faktor 10 genom att ta 20 μL från den utspädda lösningen till 180 μL förvärmda SPM, i 96-bra plattor som lämpar sig för fluorescerande mätningar.
- Tillsätt den utspädda inducerare från inducerare plattan till 96-brunnen plattor med de utspädda stammarna enligt de slutliga koncentrationerna.
- Skaka 96-brunnen plattor vid 37 ° c för 6 h, medan du tar mätningar av optisk densitet vid 595 nm (OD595), mcherry (560 nm/612 nm) och mCerulean (460 Nm/510 nm) fluorescens via en tallrik läsare var 30 min. För normaliserings ändamål, mäta tillväxten av SMP med inga celler till.
3. preliminär resultatanalys
- För varje försöks dag, Välj ett tidsintervall för logaritmisk tillväxt enligt de uppmätta tillväxtkurvorna, mellan den linjära tillväxtfasen och den stationära (T0, t-finalen). Ta cirka 6 − 8 tidspunkter, medan de första och sista mätningarna kasseras för att undvika fel som härrör från felaktigheter i exponentiell tillväxt (se figur 2A, övre panelen).
Anmärkning: Kassera stammar som uppvisar onormala tillväxtkurvor eller stammar där logaritmisk tillväxtfas inte kunde upptäckas och upprepa experimentet. -
Beräkna den genomsnittliga normaliserade fluorescensen av mcerulean och produktionstakten för mcherry, från rådata från både mcerulean och mcherry fluorescens för varje inducerare koncentration (figur 2A).
- Beräkna normaliserade mCerulean enligt följande:
där blank (mCerulean) är mCerulean-nivån [a.u.] för endast medium är blank (OD) den optiska densiteten för endast medium, och mCerulean och OD är värdena för mCerulean-fluorescens och optisk densitet. - Genomsnittlig mCerulean under de olika tids punkterna (figur 2b, de två översta panelerna) enligt följande:
om #Time Poäng är antalet data tidspunkter beaktas, är T0 den tid då den exponentiella tillväxtfasen börjar, och tFinal är den tid då den exponentiella tillväxtfasen slutar. - Beräkna mCherry produktionstakt (figur 2b, botten två paneler) enligt följande:
där mCherry (t) är mCherry-nivån [a.u.] vid tiden t är OD det optiska densitetsvärdet, T0 är den tidpunkt då den exponentiella tillväxtfasen börjar, och t-finalen är den tidpunkt då den exponentiella tillväxtfasen slutar.
- Beräkna normaliserade mCerulean enligt följande:
- Slutligen, rita mCherry produktionstakten som en funktion av mCerulean, skapa dos svar kurvor som en funktion av RBP-mCerulean fusion fluorescens (figur 2C). Sådana tomter representerar produktion av reportern gen som en funktion av RBP närvaro i cellen.
4. dosering respons funktion montering rutin och KRBP extraktion
- Under antagandet att Ribosomen klassar av översättningen med den RBP destinerade är konstant, modellera den mCherry produktionen klassar som följer (se figurera 2D, gräsplan fodrar):
där [x] är den normaliserade genomsnittliga mCerulean-fluorescensen beräknad enligt EQ. 2, är mCherry produktionstakt det värde som beräknas enligt EQ. 3, KRBP är den relativa bindningsaffiniteten [a.u.], kobunden är ribosinsatsen av översättning med RBP obunden, n är kooperativitet faktorn, och C är basen fluorescens [a.u.]. C, n, Kobunden, och kRBP hittas genom att montera mcherry produktionstakt data till modellen (EQ. 4). - Använda dataanalysprogram vara, genomföra en passande procedur på tomter som skildrar mCherry produktionstakt som en funktion av medelvärdet mCerulean (steg 3,3), och extrahera lämpliga parametrar enligt formeln i EQ. 4.
Anmärkning: Endast passande resultat med R2 > 0,6 tas med i beräkningen. För de passar, är KRBP fel mestadels i intervallet 0,5% till 20% av KRBP värden, för en 0,67 konfidensintervall, medan de med högre kRBP fel kan också verifieras av ögat. - Normalisera KRBP -värdena med respektive maximal värde för medelvärdet av mCerulean för varje dos-responsfunktion.
där KRBP i [a.u.] är det värde som extraheras från monterings proceduren i EQ. 4, och Max (i genomsnitt mcerulean) är den maximala genomsnittliga mcerulean-signalen [a. u] som observerats för den aktuella stammen.
Anmärkning: Normaliseringen underlättar en korrekt jämförelse av reglerings effekten över stammar genom att eliminera beroendet av de särskilda maximala RBP-uttrycksnivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den presenterade metoden utnyttjar konkurrensen mellan en RBP och ribosom för bindning till mRNA-Molekylen (figur 1). Denna konkurrens återspeglas genom att minska mCherry nivåer som en funktion av ökad produktion av RBP-mCerulean, på grund av ökande koncentrationer av inducerare. När det gäller att öka mCerulean fluorescens, utan betydande förändringar i mCherry, är en brist på RBP bindning härledas. Representativa resultat för både en positiv och en negativ stam avbildas i figur 2. I figur 2Apresenteras kanalerna OD, Mcherry och mCerulean som en funktion av tid och inducerare under ett intervall på fyra timmar, med t0 = 1 h och tFinal = 3,5 h. I figur 2bpresenteras medelvärdet för mCerulean fluorescens (Top) och mcherry produktionstakt (botten) som en funktion av inducerare koncentration, för de två exempel stammarna. Som framgår av resultaten för en positiv stam visar en tydlig ned-reglerande effekt i mcherry produktionstakt (figur 2b, C), vilket leder till ett betydande icke-nollvärde av KRBP (figur 2D). För den positiva stammen gav monterings proceduren följande värden: KRBP = 394,6 A.u., Kobunden = 275,6, n = 2,1, C = 11,2 a.u. och R2 = 0,93. Efter normalisering av maximal mCerulean-fluorescens var KRBP -värdet 0,24. För den negativa stammen observerades en brist på distinkt respons (figur 2C), och inget KRBP -värde extraherades (figur 2D).
I figur 3presenterar vi resultaten av denna analys för två Fagcoat RBPS, PP7 och MS2, på flera muterade bindningsställen, på olika platser inom initierings regionen av Mcherry mRNA. Resultaten är grovt indelade i tre typer av svar (figur 3a): stammar som uppvisar en nedåtreglerande effekt vid en låg mCerulean-nivå, vilket återspeglar ett lågt KRBP -värde (hög bindningsaffinitet). stammar som uppvisar reglerande effekt på antingen mellanliggande eller höga mCerulean-nivåer, vilket återspeglar ett högt KRBP -värde (intermediär eller låg affinitet). och stammar uppvisar inget distinkt svar på stigande nivåer av mCerulean, vilket återspeglar ett högre KRBP -värde än den maximala RBP koncentrationen i cellen (ingen detekerbar bindningsaffinitet). Figur 3b visar det minimala KRBP -värde som beräknats för varje kombination av RBP − bindning-plats baserat på alla kombinationer av de två RBPs och tio bindnings platser på olika positioner. Bindnings platserna innehåller en negativ kontroll (ingen bindnings plats), icke-matchande bindnings platser och en positiv kontroll ― den ursprungliga bindnings platsen för varje RBP (PP7-WT för PP7 Coat protein [PCP] och MS2-WT för MS2 Coat protein [MCP]). Resultaten matchar förutsägelser, eftersom båda RBPs presentera en hög affinitet för sina positiva kontroller och en icke-identifierbar bindning tillhörighet för negativa kontroller. Dessutom, tidigare studier med dessa två RBPs27,28 har observerat att de är ortogonala, som tydligt förmedlas i heatmap presenteras: både MCP och PCP binder inte den inhemska platsen för den andra RBP. De muterade bindnings platserna uppvisar dessutom varierande resultat, där vissa bindnings platser uppvisade en liknande nivå av samhörighet som den för den inhemska webbplatsen, till exempel PP7-Mut-1, PP7-Mut-2 och MS2-Mut-3, medan andra uppvisade en signifikant lägre affinitet, såsom PP7-Mut-3 och MS2-Mut-2. Analysen presenterade således en kvantitativ in vivo-mätning av bindningsaffiniteten hos RBPs, vilket ger resultat som är jämförbara med tidigare experiment med dessa RBPs.
Eftersom analysen är baserad på förtryck av mCherry genen, en livskraftig mCherry signal krävs. Därför, vid utformningen av bindnings plats kassetten, finns det två designregler att tänka på. För det första bör den öppna avläsnings ramen (ORF) i mCherry hållas. Eftersom bindnings platsens längd kan variera, kan det leda till en förskjutning av en eller två baser från den ursprungliga mCherry ORF. Därför, om det behövs (figur 4a), sätt in en eller två baser omedelbart nedströms till bindningsstället. Till exempel, en bindnings plats som är 20-bas lång, med en δ av två baser, kommer att ge ett tillägg av 22 baser till mCherry genen. För att hålla ORF, måste vi lägga till två baser, för totalt 24 baser. Den andra konstruktionen regeln är att undvika införanden av stopp kodons i mCherry ORF. Vissa bindningsställen, som MS2-Mut-2 (figur 4b, infällbara), innehåller stoppkodon när de placeras i en eller flera av de tre möjliga ORFS. Ett sådant exempel illustreras i figur 4a, där bindnings platsen innehöll en stoppkodon som är i bildruta med MCHERRY ORF endast när inga baser tillsätts. Som kan ses i dos-responskurvan för den positionen (figur 4b), var mcherry produktionstakten omöjlig att upptäcka, vilket innebär att bindningsaffiniteten inte kunde mätas.
En närmare titt på figur 4b visar effekten av avståndet δ på mcherry produktion. Till exempel, för δ = 4, var basal produktionen en faktor på sex mer än de för δ = 5, vilket ger en högre Fold-repression effekt. För δ = 14 var dock de basala produktionsnivåerna för låga för att iaktta en ned-reglerande effekt.
Figur 1: översikt över system design och klonings steg. Illustration av kassett designen för bindningsstället plasmid (vänster) och RBP-mCerulean plasmid (höger). Nästa steg är konsekutiva transformationer av båda plasmiderna till kompetenta E. coli -celler, med RBP-plasmider först. Dubbel-transformanter testas sedan för deras mCherry uttrycks nivåer i ökande inducerare koncentrationer; om RBP binder till bindningsstället, mCherry nivåer sjunka som en funktion av mCerulean (grå bubbla). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Diagram 2: analyssystem. (A) tredimensionella (3D) tomter som SKILDRAR råa OD-nivåer (överst), mCerulean-fluorescens (mitten) och mcherry-fluorescens (botten) som en funktion av tid och inducerare koncentration, för en positiv stam. (B) Top: mcerulean steady-state uttrycks nivåer för varje inducerare koncentration beräknas genom att dividera varje fluorescens nivå av respektive OD och genomsnitt över alla värden i 2 − 3 h exponentiell tillväxt tid fönstret för både den positiva (vänster) och negativa (höger) stammar. Nederst: mCherry produktionstakt beräknad enligt EQ. 3 för tidspunkter 2 − 3 h efter induktion. C) mcherry-produktionshastigheten plottas som en funktion av medelvärdet för mCerulean-fluorescens i genomsnitt över två biologiska dubbletter för två stammar. Felstaplar är standardavvikelsen för både mCherry-produktionshastigheten och den genomsnittliga mCerulean-fluorescensen som erhållits från minst två replikat. (D) passar för KRBP med hjälp av Tillpassnings formeln i EQ. 4 som visas för den positiva stammen (vänster) och uppvisar ett specifikt bindnings svar. För den negativa stammen (till höger) extraherades inget KRBP -värde. Data visas i två exemplar. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Katz et al.10. Copyright 2018 amerikanska kemiska sällskapet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa slutresultat. (A) normaliserade dos-responskurvor för trettio olika stammar baserade på två RBPs och tio bindningsställen på olika platser. Tre typer av svar observeras: hög affinitet, låg affinitet och ingen tillhörighet. B) kvantitativa KRBP -resultat för två RBPs (MCP och PCP) med fem olika kassetter för bindningsstället (listade). Alla RBP − bindning-site stammar mättes i två exemplar. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Katz et al.10. Copyright 2018 amerikanska kemiska sällskapet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: exempel design och resultat för MCP med en mutant bindnings plats. A) illustration av bindnings platsens kassetter på fyra olika platser. Kassett inklusive ribosom bindningsstället, börja kodon för mCherry, δ spacer baser, bindningsstället testas, en eller två baser för att bibehålla ORF, och resten av mCherry genen. Röda stjärnor indikerar en stoppkodon. (B) dos-responskurvor för MCP med en mutant bindnings plats på fyra olika platser. Infälld: sekvensen för den testade muterade bindnings platsen. Resultat som presenteras är för dubbletter av varje stam. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn | Binidng plats, A i augusti = 1 | Sekvens för bindnings plats (RBS för kontroller) | Plats: ATG till andra mcherry kodon GTG Kontroller: RBS till andra mcherry kodon GTG |
Källkod |
| MS2_wt_d5 | 5 | acatgaggattacccatgt | Mer från atgcacatgaggattacccatgtcgtg | Gen9 Inc. |
| MS2_wt_d6 | 6 | acatgaggattacccatgt | Mer från atggcacatgaggattacccatgtgtg | Gen9 Inc. |
| MS2_wt_d8 | 8 | acatgaggattacccatgt | atggcgcacatgaggattacccatgt cgtg |
Gen9 Inc. |
| MS2_wt_d9 | 9 | acatgaggattacccatgt | atggcgccacatgaggattacccatg tgtg |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) C_d8 | 8 | acatgaggatcacccatgt | atgcacatgaggatcacccatgtgg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) C_d9 | 9 | acatgaggatcacccatgt | Mer från atggcacatgaggatcacccatgtg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) C_d8 | 8 | acatgaggatgacccatgt | atgcacatgaggatgacccatgtgg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_U (-5) G_d9 | 9 | acatgaggatgacccatgt | Mer från atggcacatgaggatgacccatgtg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_struct_d9 | 9 | cacaagaggttcacttatg | atggccacaagaggttcacttatgg Tg |
Gen9 Inc. |
| MS2_struct_d8 | 8 | cacaagaggttcacttatg | atgccacaagaggttcacttatggg Tg |
Gen9 Inc. |
| PP7wt_d5' | 5 | Mer från taaggagtttatatggaaaccctta | atgctaaggagtttatatggaaacc cttacgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7wt_d6' | 6 | Mer från taaggagtttatatggaaaccctta | atgaataaggagtttatatggaaac ccttagtg |
Twist Bioscience |
| PP7wt_d8' | 8 | Mer från taaggagtttatatggaaaccctta | atgaacataaggagtttatatggaa acccttacgtg |
Twist Bioscience |
| PP7wt_d9' | 9 | Mer från taaggagtttatatggaaaccctta | atgaacaataaggagtttatatgga aacccttagtg |
Twist Bioscience |
| PP7_USLSBm_d6 | 6 | Mer från taaccgctttatatggaaagggtta | atggctaaccgctttatatggaaag ggttagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_USLSBm_d15 | 15 | Mer från taaccgctttatatggaaagggtta | atgggcgccggcgctaaccgcttta tatggaaagggttagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_nB_d5 | 5 | Mer från taagggtttatatggaaaccctta | atgctaagggtttatatggaaaccc ttagcgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_nB_d6 | 6 | Mer från taagggtttatatggaaaccctta | atggctaagggtttatatggaaacc cttatgtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_USs_d5 | 5 | taaggagttatatggaaccctta | atgctaaggagttatatggaaccct tagtg |
Gen9 Inc. |
| PP7_USs_d6 | 6 | taaggagttatatggaaccctta | atggctaaggagttatatggaaccc ttagcgtg |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d1 | - | - | ttaaagaggagaaaggtacccatgg Tg |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d4 | - | - | ttaaagaggagaaaggtacccatgg gcgtg |
Gen9 Inc. |
| No_BS_d10 | - | - | ttaaagaggagaaaggtacccatgg gcgccggcgtg |
Gen9 Inc. |
| Ordningsföljd primer för bindnings plats kassetter | gcatttttatccataagattagcgg | Idt | ||
| Sekvenserings primer för RBP-kassetter | gcggcgctgggtctcatctaataa | Idt | ||
Tabell 1: bindnings platser och sekvenseringprimrar. Sekvenser för bindnings platserna och kassetter för bindningsstället som används i denna studie, liksom primers för de sekvenserings reaktioner som beskrivs i protokollet (steg 1.2.5.1 och 1.3.3).
| RBP namn i detta arbete | källorganismens namn, protein | källorganism-genen | källorganism RefSeq | WT AA SEQ | ändringar från WT (och referenser) | AA SEQ används i detta arbete | NT SEQ används i detta arbete |
| Mcp | Escherichia virus MS2 | Cp | NC_001417.2 | MASNFTQFVLV DNGGTGDVTV APSNFANGVA EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI KVEVPKVatqt VGGVELPVA AWRSYLNMEL TIPIFATNSD CELIVKAMQG LLKDGNPIPS AIAANSGIY |
Delf-G 1 V29I [1] tagen från addgene plasmid 27121 |
MASNFTQFVLV DNGGTGDVTV APSNFLÄKTGIA EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI (Gökçen) AWRSYLNMEL TIPIFATNSD CELIVKAMQG LLKDGNPIPS AIAANSGIY |
ATGGCTTCTA ACTTTACTCA GTTCGTTCTC GTCGACAATG GCGGAACTGG CGACGTGACT GTCGCCCCAA GCAACTTCGC TAACGGGATC GCTGAATGGA TCAGCTCTAA CTCGCGTTCA CAGGCTTACA AAGTAACCTG TAGCGTTCGT CAGAGCTCTG CGCAGAATCG CAAATACACC ATCAAAGTCG AGGTGCCTAA AGGCGCCTGG CGTTCGTACT TAAATATGGA ACTAACCATT CCAATTTTCG CCACGAATTC CGACTGCGAG CTTATTGTTA AGGCAATGCA AGGTCTCCTA AAAGATGGAA ACCCGATTCC CTCAGCAATC GCAGCAAACT CCGGCATCTAC |
| Pcp | Pseudomonas phage PP7 | Cp | NC_001628.1 | MSKTIVLSVGEA TRTLTEIQST ADRQIFEEKV GPLVGRLRLT ASLRQNGAKT AYRVNLKLDQ ADVVDCstsvc GElpkvrytq VWSHDVTIVA NSTEASRKSL YDLTKSLVAT SQVEDLVVNL VPLGR |
delF-G [2] tagen från addgene plasmid 40650 |
MLASKTIVLSVG EATRTLTEIQ STADRQIFEE KVGPLVGRLR LTASLRQNGA KTAYRVNLKL DQADVVDSG LPKVRYTQVW SHDVTIVANS TEASRKSLYD LTKSLVATSQ VEDLVVNLVP LGR |
ATGCTAGCCTC CAAAACCATC GTTCTTTCGG TCGGCGAGGC TACTCGCACT CTGACTGAGA TCCAGTCCAC CGCAGACCGT CAGATCTTCG AAGAGAAGGT CGGGCCTCTG GTGGGTCGGC TGCGCCTCAC GGCTTCGCTC CGTCAAAACG GAGCCAAGAC CGCGTATCGC GTCAACCTAA AACTGGATCA GGCGGACGTC GTTGATTCCG GACTTCCGAA AGTGCGCTAC ACTCAGGTAT GGTCGCACGA CGTGACAATC GTTGCGAATA GCACCGAGGC CTCGCGCAAA TCGTTGTACG ATTTGACCAA GTCCCTCGTC GCGACCTCGC AGGTCGAAGA TCTTGTCGTC AACCTTGTGC CGCTGGGCCGT |
| Referenser: | |||||||
| 1. Peabody, D.S., Ely, K.R. kontroll av translationell förtryck av protein-protein interaktioner. Nukleinsyror forskning. 20 (7), 1649 – 1655 (1992). | |||||||
| 2. Chao, J.A., Patskovsky, Y., Almo, S.C., sångare, R.H. strukturell grund för Samevolutionen av en viral RNA – proteinkomplex. Natur struktur &Amp; molekylärbiologi. 15 (1), 103 – 105, Doi: 10.1038/nsmb1327 (2008) | |||||||
Tabell 2: RBP-sekvenser. Aminosyran och nukleotidsekvenser av de päls proteiner som används i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs i denna artikel underlättar kvantitativ in vivo-mätning av RBP-RNA-bindningsaffinitet i E. coli -celler. Protokollet är relativt enkelt och kan genomföras utan användning av sofistikerade maskiner, och dataanalys är enkel. Dessutom resultaten produceras omedelbart, utan den relativt långa väntetiden i samband med nästa generations sekvensering (NGS) resultat.
En begränsning av denna metod är att det fungerar endast i bakterie-celler. Men en tidigare studie12 har visat en repressiva effekt med hjälp av en liknande metod för L7AE RBP i däggdjursceller. En ytterligare begränsning av metoden är att införandet av bindningsstället i mCherry Initiation region kan pressa basal mCherry nivåer. Strukturell komplexitet eller hög stabilitet hos bindningsstället kan interferera med ribosomal initiering även i avsaknad av RBP, vilket resulterar i minskade mCherry basala nivåer. Om basnivåerna är för låga, kommer det ytterligare förtryck som orsakas av ökande koncentrationer av RBP inte att vara observerbart. I ett sådant fall är det bäst att designa bindnings plats kassetten med bindningsstället fortfarande i initierings regionen, men på randen till övergången från Initiation region till tsträckning region (δ i intervallet 12 − 15 BP10,29). Vi har visat att för sådana δ-värden kan en repressionseffekt fortfarande observeras. För att öka chanserna att analysen kommer att fungera, oavsett strukturell komplexitet, rekommenderar vi att utföra analysen på minst tre olika positioner för en viss bindnings plats.
Den största nackdelen med metoden i jämförelse med in vitro-metoder, såsom EMSA, är att RBP-RNA-bindningsaffiniteten inte mäts i absoluta enheter av RBP-koncentrationen, utan snarare i form av fusion-RBP-fluorescens. Denna nackdel är ett direkt resultat av in vivo-inställningen, vilket begränsar vår förmåga att läsa upp de faktiska koncentrationerna av RBP. Denna nackdel kompenseras av fördelarna med att mäta i in vivo-inställningen. Till exempel har vi funnit skillnader i bindande tillhörighet vid jämförelse av resultat från vår in vivo-analys till tidigare in vitro-och in situ-analyser. Dessa skillnader kan bero på avvikelser i strukturen hos mRNA-molekylerna in vivo som framkommer av deras närvaro i cellerna10,11,30,31. Sådana strukturella skillnader kan leda till förändringar i stabiliteten i de vikta tillstånden in vivo, vilka i sin tur antingen stabiliserar eller avstabiliserar RBP-bindningen.
Eftersom metoden är relativt enkel och billig, rekommenderar vi att köra flera kontroller tillsammans med själva experimentet. Kör en negativ kontroll, dvs en sekvens som inte har någon tillhörighet till RBP ännu har liknande strukturella funktioner, kan bidra till att undvika falska positiva som härrör från icke-specifika interaktioner med mRNA. I de representativa resultat som visas var de två negativa kontrollerna enbart mCherry-genen (ingen bindnings plats) och den ursprungliga bindnings platsen för den andra RBP (dvs. PP7-WT för MCP och MS2-WT för PCP). Dessutom föreslår vi att en positiv kontroll (t. ex. en RBP och dess ursprungliga bindnings plats) ska införlivas. En sådan kontroll kommer att bidra till att kvantifiera bindningstillhörigheten genom att lägga fram en referenspunkt och undvika falsk negativ som härrör från lågt vikande förtryck.
Slutligen, för dem som vill få ett strukturellt perspektiv av RBP-RNA-bindning, föreslår vi att genomföra en selektiv 2 ′-hydroxylacylering analyseras med primer förlängning sekvensering (Shape-SEQ)11,32,33 Experiment. SHAPE-SEQ är en NGS-metod kombinerad med kemisk avsökning av RNA, som kan användas för att uppskatta den sekundära strukturen hos RNA samt RNA-interaktioner med andra molekyler, såsom proteiner. I vårt tidigare arbete genomförde vi en form-SEQ experiment på en representativ stam i både in vivo villkor34 och in vitro med renat rekombinant protein10,35. I vårt fall visade resultaten att RBP-bindning påverkade ett mycket bredare segment av RNA än vad som tidigare rapporterats för dessa RBPs in vitro-36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta projekt fick finansiering från i-CORE program för planering och budgetering kommittén och Israel Science Foundation (Grant nr 152/11), Marie Curie återintegrering Grant No. PCIG11-GA-2012-321675, och från Europeiska unionens Horisont 2020 forsknings-och Innovations program enligt bidragsavtal nr 664918-MRG-grammatik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium salt | SIGMA | A9518 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | ALFA AESAR | 33337 | |
| 48 plates | Axygen | P-5ML-48-C-S | |
| 8-lane plates | Axygen | RESMW8I | |
| 96-well plates | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well plates for plate reader | Perkin Elmer | 6005029 | |
| ApaLI | NEB | R0507 | |
| Binding site sequences | Gen9 Inc. and Twist Bioscience | see Table 1 | |
| E. coli TOP10 cells | Invitrogen | C404006 | |
| Eagl-HF | NEB | R3505 | |
| Glycerol | BIO LAB | 071205 | |
| Incubator | TECAN | liconic incubator | |
| Kanamycin solfate | SIGMA | K4000 | |
| KpnI- HF | NEB | R0142 | |
| Ligase | NEB | B0202S | |
| Liquid-handling robotic system | TECAN | EVO 100, MCA 96-channel | |
| Matlab analysis software | Mathworks | ||
| Multi- pipette 8 lanes | Axygen | BR703710 | |
| N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) | cayman | K40982552 019 | |
| PBS buffer | Biological Industries | 020235A | |
| Platereader | TECAN | Infinite F200 PRO | |
| Q5 HotStart Polymerase | NEB | M0493 | |
| RBP seqeunces | Addgene | 27121 & 40650 | see Table 2 |
| Sodium Chloride (NaCL) | BIO LAB | 190305 | |
| SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Tryptone | BD | 211705 |
References
- Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).
- Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. Regulation of translation initiation by RNA binding proteins. Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).
- Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria. Frontiers in Microbiology. 6, 141 (2015).
- Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043 (2018).
- Bendak, K., et al. A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein. Nucleic Acids Research. 40 (14), e105 (2012).
- Strein, C., Alleaume, A. -M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells. RNA. 20 (5), 721-731 (2014).
- Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
- Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
- Katz, N., et al. An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).
- Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Methods. 103, 34-48 (2016).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA. Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).
- Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
- Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
- Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein. Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- NEB. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions. , Available from: https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions (2018).
- Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol. , Available from: https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/ (2018).
- NEB. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202). , Available from: https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202 (2018).
- Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html (2018).
- NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit. , Available from: https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx (2018).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Addgene. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/ (2018).
- NEB. Making your own chemically competent cells. , Available from: https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells (2018).
- Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling. , Available from: https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation (2018).
- Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo. Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).
- Espah Borujeni, A., et al. Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505, (2013).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486 (2015).
- Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq. Nucleic Acids Research. 44 (2), e12 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).
- Bernardi, A., Spahr, P. -F. Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).
