Summary
ここで提示されるプロトコルは、前臨床研究のためのげっ歯類の四足歩行の3次元運動学を収集し、分析するためのプロトコルである。
Abstract
3次元(3D)運動運動解析システムの有用性は、げっ歯類では限られている。この不十分さの理由の一部は、3D データ収集および解析手順に伴う複雑なアルゴリズムと数学的モデリングの使用です。この研究は、6カメラモーションキャプチャシステムを使用して、健康で神経外傷性ラットのトレッドミル移動中の3Dキネマティック歩行分析のためのシンプルで、ユーザーフレンドリーな、ステップバイステップの詳細な方法論を提供します。また、4つの手足すべてに配置されたマーカーを使用して成体ラットのトレッドミル移動のための2)データ収集、3)ビデオトラッキングに利用可能なオプションの1)実験セットアップにおけるシステムのキャリブレーションの詳細も提供されています。4)組み込みのデータ収集ソフトウェアを使用して、データの基本的な3Dキネマティックデータ生成と可視化と定量化。最後に、この運動捕捉システムの有用性は、神経外傷の前後の様々な運動挙動を研究することに拡張されることを示唆する。
Introduction
げっ歯類では、神経障害後の前肢および後肢運動障害は、主観的スコアリングシステム1を用いて一般的に評価される。自動化されたシステム2、3、4、5は歩行分析に採用されているが、主な結果はフットプリント分析に基づいており、重要なキャプチャに失敗しているため、欠点に苦しんでいるそうでなければ、四肢の動き2の真の運動学を明らかにすることができるセグメントおよび関節運動変数。ほとんどの歩行パラメータは相関しているため、運動障害を完全に評価するためにラットが採用した補償を理解するには、歩行パラメータのコレクションが必要です。
過去10年間で、いくつかの3D運動解析システム6は、ヒトの生物医学的研究のために開発されました。これらのシステムは成功しており、健康な人間の成人の移動の欠陥を捕捉するだけでなく、歩行6、7の変化した運動学に有効であることが証明されています。げっ歯類では、現在利用可能な3Dキネマティックモーションシステムは、動きの挙動のための複雑なアルゴリズムとモデリングを採用し、高度なデータ解析技術8、9、10、11を利用しています最終的にその汎用性を制限します。さらに、ほとんどの3Dモーションキャプチャシステムでデータを収集するために使用される方法は、文献で十分に説明されていません。データ収集と分析の手順、制限事項、およびシステムの効果的な使用に関連する手法の詳細は不足しています。
したがって、研究者の間で一般的な概念の 1 つは、3D モーション トラッキング キネマティック評価は、技術的な専門知識と精巧なデータ分析を必要とするかなり手間のかかる手順で、時間のかかる手順です。この作業の目的は、データ収集および分析プロトコルを分解し、客観的で学びやすく、体系的にアプローチできるように、段階的なプロセスを通じて方法論を記述することです。今日、神経学的損傷と前臨床研究への介入に続いて、より包括的かつ体系的な方法で機能的運動行動を評価することに重点が置かれつつある。
四足歩行の領域では、ここに示すのは、体の姿勢、体の軸に関する足の回転、関節の相互関係、より正確な情報などの追加情報を提供できる3Dモーショントラッキングシステムの使用です。コーディネーションに関しては、すべての飛行機から動物全体を同時に視覚化しながら。これは、順番に、複数の結果を通じて健康なラットと負傷したラットの間の運動行動の重大な違いを明らかにすることができます。正確で客観的なより洗練された運動分析により、介入の影響を誤って推測するリスクが最小限に抑えられる。このモーションキャプチャソフトウェアから生成されたデータは、移動の品質のためにフレームごとに視覚化され、自動的に追跡することができ、データ収集や定量化は、追加のアルゴリズムやモデリングを必要としません。本研究の目的は、健康な脊髄損傷ラットにおけるトレッドミル移動中の3D歩行運動学のデータ収集と分析に関する方法論的詳細と考慮事項を提供することです。このプロトコルは、実験で神経学的ラットモデルを利用する前臨床研究者による使用を目的としています。
Protocol
本研究は、実験動物のケアと使用に関する国立衛生ガイドの勧告に従って実施された。このプロトコルは、ストーニーブルック大学首相の動物研究委員会によって承認されました。
1. モーションキャプチャシステムの設定
- セットアップ
- 細かく調整可能なギアヘッドを使用して、壁(または三脚)に6台のカメラを取り付けます。トレッドミルの両側に3台のカメラを配置し、各カメラが水平線の下に20°-45°傾斜し、トレッドミルから約2.0m、隣接するカメラから約0.5m離れた場所にマーカーを最大にカバーします(図1)。
- レトロ反射マーカーの視覚化のためのリングライトを各カメラに装備します。
- モーション キャプチャ システムを起動します。
- プロジェクトの下|仕様は、実験に必要なマーカーを定義する。
注:デモンストレーションの目的では、両側四足歩行を評価するために、前肢と後肢の両方に合計22個のマーカー(両側に11個のマーカー)が使用されます。または、特定のマーカー ID オプションを使用してマーカーをインポートし、ソフトウェア内で事前に設定された計算を行うことができます。
- プロジェクトの下|仕様は、実験に必要なマーカーを定義する。
2. モーションキャプチャシステムの校正
- キャリブレーションビデオのキャプチャ
- L字口径測定フレーム(以下「Lフレーム」といいます)をトレッドミル上に直立し、Lフレームの長い脚をラットの歩行方向を指します(図2)。
- モーション キャプチャ ソフトウェアを開き、[記録] を選択してキャリブレーション ビデオをキャプチャします。
- ラットが歩くすべての領域をカバーするように、宇宙のトレッドミル領域全体でトライデント形状のキャリブレーションフレーム(以下「杖」と呼ばれる)を移動します。
注:Lフレームにはグローバル座標系を確立する4つのマーカーが含まれており、杖にはラットの3D歩行スペースを校正する3つのマーカーが含まれています。 - 120 フレーム/秒で適切なキャリブレーションを行うために、適切な杖データ ポイントが存在するように、1 分以上のフッテージを記録します。
- ビデオを 3D キャリブレーション ファイルとして保存します。
- Lフレームトラッキング
- カメラグループを右クリックし、3Dトラッキングを選択します。ドロップダウンウィンドウの下で、3Dキャリブレーションビデオを選択し、[すべてのキャリブレーションカメラ]を選択します。
- 固定点機能を使用して、6 つのキャリブレーション ビデオのそれぞれで、L フレームの原点、L フレームの短い、L フレームの中間、および L フレームの長さを追跡します。すべてのポイントを定義し、[自動的に検索]ボタンを選択します。
注:Lフレーム位置は、座標系のシフトを防ぐために、実験全体でトレッドミルに対して一貫性を保つ必要があります。
- ワンドトラッキング
- カメラグループを右クリックし、[自動 3D-ワンドトラッキング] を選択します。
- カメラ選択ですべてのカメラを選択します。ウィンドウの右下で、[オプション]を選択し、[Lフレームの検出] を選択解除し、[トラッキングの開始] を選択します。
- 自動トラッキングの後、6 台のカメラすべてに[ワンド ショート]、[ワンド ミッド]、[ワンド ロング] マーカーを割り当てるを選択します。
- 3D トラッキングウィンドウで、[生データにエクスポート]を選択し、[既存の杖データを上書き]オプションを選択してトラッキングを保存します。
- 最も正確なデータを保存するには、最後の手順の後に表示されるウィンドウで [はい]を選択します。
注:この新しいトラッキングは、左側のサイドバーの[自動トラッキング]タブでトラッキングとして保存されます。保存されたトラッキングは、後でアクセスおよび編集できます。
- キャリブレーションの計算
- カメラキャリブレーショングループを右クリックし、[新しい杖キャリブレーショングループ]を選択します。
- [すべてのカメラ] を選択し、[OK] を選択しながらCtrl (コントロール) キーを押したままにします。
- 杖の長さを 100.00 mm に、L フレームの床オフセットを 7.00 mm に変更し、外れ値検出の反復を 4 に変更し、杖の長さ偏差を 0.300 に変更します。
- オプションで杖が表示されるカメラを 4 に変更し、アスペクト比の修正、スキュー パラメータの修正、およびプリンシパル ポイントの修正 (表1) をオンにします。
注: これらの設定は、実験的にこの設定に最適であると判断されました。 - 杖の長さが3 mm未満、残差値が0.004未満の標準偏差でキャリブレーションを受け入れます。
注: カメラまたは関連機器がこのポイントを超えて移動した場合は、システムの再調整が必要になります。
3. トレッドミル移動のための動物の訓練と準備
- トレッドミル移動のためのトレーニングラット
- トレーニングセッション12の前に5分間トレッドミルにラットを順化します。
- ラットを訓練し、13 cm/sで手足に全重量を負担して15分間、午前中に1週間歩きます。彼らはトレッドミル12上で一貫して歩くことができるまですべてのラットを訓練する(最低10連続ステップ)。
- 各ラットの1日の同じ時間にトレーニングセッションを完了します。
- データ収集の前に、ラットをインキュベーション室に入れることでラットを麻酔する。
- イソファランガスの供給(1.0%-2.5%)約5分間の酸素の0.4 L.は、麻酔の深さを確認するためにラットの足をつまみます。
- ラットが足のピンチ(負の足の引き出し反射)に反応しないときに進みます。
- 毛皮がマーカートラッキングに干渉するのを防ぐためにマーカーが配置される領域でラットを剃ります(図1)。
- マーカーを配置するために骨のランドマークのための皮膚を触診します。肘と膝に向かう関節にはペンマーカーを使用します(図3)。
注:レトロ反射マーカーは、レトロ反射テープで覆われた直径0.5センチメートルのプラスチック半球です。 - データ収集の前に、必要に応じてマーカーを骨のランドマークに配置します (図3)。
注:健康な、非神経外傷性ラットでは、遠位関節の上に置かれたレトロ反射マーカーは、しばしばラットによって除去される。デモンストレーションの目的で、近位骨のランドマーク(イリアッククレスト、ヒップ、後肢の膝関節、前肢の肩と肘の関節)の上にレトロ反射マーカーが配置され、ペンマーカーはより遠位のランドマークに使用されます。私たちの手の中では、これはラット(未発表のデータ)の間と内で再現可能な結果をもたらしました。
- マーカーを配置するために骨のランドマークのための皮膚を触診します。肘と膝に向かう関節にはペンマーカーを使用します(図3)。
4. モーションキャプチャ
- モーション キャプチャ ソフトウェアの上部バーの赤いカメラ ボタンを選択して、試用版を録画します。コンピュータ上の保存場所を指定し、[録画を開始] を選択して 120 フレーム/秒で録画します。
- ユーザー定義のトレッドミル速度を設定し、ラットが約 30 s、または最低 10 回の連続ステップで歩くようにします。
- 録画を停止し、続行する前に、フッテージに少なくとも ~10 の連続ステップが含まれていることを確認します。
- 録画したビデオを保存した後、トライアルごとに新しいカメラ グループを作成します。
5. モーショントラッキング
- 保存したカメラグループに隣接する "+" 記号を選択します。これにより、6 台のカメラの一覧が表示されます。
- カメラ ファイルに 3D キャリブレーションを割り当てる
- カメラキャリブレーショングループに移動し、計算されたキャリブレーションを右クリックします。[3D カメラ パラメータを割り当てる]を選択します。キャリブレーション ファイルを、保存したカメラ グループ内の適切なカメラ ファイルに割り当てます。カメラファイルにカーソルを合わせると、キャリブレーションが確認できます(3Dキャリブレーションが有効です)。
- 個々のカメラ2Dトラッキング
- モーション トラッキングのカメラ グループを右クリックします。2D トラッキングを選択します。
- トラッキングのための7から10の最高の連続的で一貫性のあるステップを選択します。各ステップのトレッドミル上の参照リムの最初の接触でフレーム番号を記録します。
注: デモンストレーションの目的で、左後肢が参照リムとして選択されました。
- さまざまな追跡オプションを使用できます。
- 目的のマーカーを右クリックし、[自動トラッキング]を選択すると、反射マーカーによって作成された明るい円形のスポットが検出されます (図4)。
- または、パターンマッチングを使用してマーカーを追跡し、ソフトウェアに組み込まれたアルゴリズムを使用して、サイズと色に基づいてマーカーを追跡します (図4)。
- トラッキングの検出不能なマーカーやエラーを手動で追跡して修正します。
- 遠位ジョイントの逆反射マーカーが不可能な場合は、黒いマーカーを使用します。
- 自動トラッキングのための明るいスポットに黒いマーカーを反転することにより、高度な画像処理を使用して黒のマーカーを追跡します。
注:画像処理オプションを使用すると、検出や表示が困難なマーカーを追跡できます。 - 2D トラッキング ウィンドウのラット ビデオを右クリックします。[画像処理]を選択します。
- [詳細ビュー]を選択し、4 つのフィルタ(明るさ、コントラスト、ガンマ)の組み合わせを追加して、黒いマーカーを周囲と比較して可能な限り暗くします。最後に、反転を追加すると、黒いマーカーが自動的に追跡できる明るいマーカーになります(図5)。
- 自動トラッキングのための明るいスポットに黒いマーカーを反転することにより、高度な画像処理を使用して黒のマーカーを追跡します。
- マーカー配置修正
- トラッキングの検出不能なマーカーやエラーを手動で追跡して修正します。
- ビデオを手動で追跡するには、右側のサイドバーで目的のマーカーを選択します。右クリックして[手動追跡]を選択します。フレームごとに表示されるラットビデオで選択したマーカーの追跡を開始します。
- エラーを修正するには、トラッキング エラーが発生したフレームに移動します。右側のサイドバーにある特定のマーカータブを右クリックし、[ポイントを削除] をクリックします。正確な位置で手動でポイントを再トラッキングします。
- 上記の方法を使用して、連続ステップのフレーム範囲内のすべての目的のマーカーに使用されるすべてのカメラの2Dトラッキングを完了します。
- トラッキングプロセス全体を通して[保存]をクリックします。
6. キネマティック解析
- フェーズの割り当て
- [フェーズ] を右クリックし、[フェーズ モデルの編集] を選択します。
- ステップサイクルの従来のスタンスとスイングフェーズ内で、各四肢の歩行サイクルフェーズを、従来のスタンスとスイングフェーズ内で検討することを選択した赤字に応じてカスタマイズします。.実験のフェーズを定義します (図6)。
注:デモンストレーションのために、3つのフェーズがここに示され、左後肢は7〜10歩行サイクルの基準リムとして使用されます。 - カメラ グループのカメラを右クリックし、[ビデオを表示] を選択します。
- フェーズの追加ボタンまたは F11 ショートカット キーを使用して、ソフトウェア内の各リムの歩行サイクルのフェーズを割り当てます。
- 分析の下で適切な四肢を選択し、追跡の最初のフレームをスタンスフェーズの開始として指定します。
- スタンスフェーズが終了し、スイングフェーズが開始されるフレームにビデオを進めます。このフレームをスイング フェーズの開始として指定します。
- ビデオを、足が降下し始める最初のフレームに進みます。このフレームをミッド スイング フェーズの開始として指定します。
注:本明細書では、各四肢のステップサイクルのスタンスフェーズは、四肢がトレッドミル表面に接触する第1フレームとして定義される。スイングフェーズは、四肢がトレッドミル表面から離れる最初のフレームとして定義されます。ミッドスイングフェーズは、四肢が最大クリアランスを達成し、降下を開始するフレームです。完全な歩行サイクルは、最初のスタンスの開始から次の歩行サイクルのスタンスフェーズ割り当てまで定義されます。 - 各ステップに対して四肢フェーズの割り当てが完了するまで、これらの手順を繰り返します。他の 3 つの四肢についても同じ手順を繰り返します。
- 3D 座標計算
- 6 台のカメラをすべて追跡した後、3D 計算を実行します。
- カメラグループを右クリックし、新しい3D計算を選択し、[すべて]をクリックして[カメラ選択]を選択し、[OK]を選択します。
注: 新しいフォルダが表示されます。このフォルダには、追跡されるすべてのマーカーのすべての 3D 座標データが含まれています。フェーズを表示または編集するには、左側のサイドバーの3D 座標を右クリックし、[フェーズの編集] (図7) を選択します。 - 対象のマーカーをドラッグして、割り当てられた歩行フェーズと並べて表示することで、データ ポイントを使用したジョイントの高さや速度図などの関心のあるデータを生成します。(例えば、図8の関節運動学)。
- 3D ダイアグラム
- 3D ダイアグラムをクリックして、試用版の 3D 図形を生成します。
- 3D 座標を右クリックして生データをエクスポート/エクスポートします。
- 3D 座標ファイルを右クリックし、[エクスポート]を選択します。
- スプレッドシートソフトウェアでファイルを開き、MATLABにデータをインポートします。
- 四肢ステップの高さの調整のプロットを作成するプログラムを作成します。
注:3D座標データは、分析ソフトウェアまたはカスタム定義マクロスクリプトにエクスポートして、ソフトウェア機能が提供するデータを超えて、より多くのデータを生成することができます。
Representative Results
このプロトコルは、単純な組み込みソフトウェアを使用してげっ歯類のトレッドミル移動のための定量的な3Dキネマティックデータ収集と分析のための方法論を示す。この結果は、健康な脊髄損傷ラットおよび脊髄損傷ラットにおける四重ペダル移動運動運動運動を収集および分析する際に、このプロトコルが実現可能であることを示している。ラットの取り扱い経験を持つ研究者は、ラットにマーカーを配置し、その後、重大な問題なしにモーションキャプチャシステムを校正し、使用する必要があります。複雑なアルゴリズムを使用せずにデータを簡単に生成できます。
ここで、プロトコルは、健康な脊髄損傷(C5右ヘミセクション)ラットに実施された。この原稿の目的のために、代表的な結果のみが表示されます。全体的に、関節および四肢セグメントの動きの様々な運動学は、各マーカーの3D座標から容易に得ることができた。異常な歩行と健康な歩行周期の間の重大な違いは、ステップの高さ測定、関節速度、関節角度(図9)、4つの四肢すべてに対するステップサイクル位相持続時間を含む(これらに限定されない)複数の結果で容易に検出された。と四肢のコーディネーション(図10)。プロットおよびスティック図の形での定性データの分析は、この分析アプローチの最終的な結果のために実装するために使用される定量的ツールの決定を導くことができる(図11)。
代表的な健康なラットでは、肘の角度プロファイルは、運動の完全な範囲を表示した一貫した隣接する歩行サイクルを持つ滑らかな、単一のピークを示しました(図9)。トレースの交互のスタンスフェーズとスイングフェーズ期間は、一貫したリム内調整を示唆した。対照的に、代表的な脊髄損傷ラットの肘角度プロファイルは、より一貫性がなく、運動範囲が小さい複数の歪んだピークを示した。長引くスタンスフェーズの変更とスイングフェーズ期間の短縮に加えて、RFLのリム内調整に欠乏がありました。
コーディネーション用にプロットされた代表的なデータでは、代表的な健康なラットから生成された協調プロット(図10)は、歩行中に一方の四肢において明確に定義された、交互にリズミカルな協調を示すことがわかった。サイクル(L字型パターン)と反対四肢を持つ位相D字型パターン。対照的に、代表的な脊髄損傷(C5右半角切除)ラットは、異性四肢における非交互および非リズム協調性の寄与性が低下し、反対方の1つで異常な交互のリズム調整(L字型パターン)を示した。四肢の組み合わせ (図 10)。記録されたモーションビデオの右前肢の観察可能な赤字を考えると、これはRFLおよびLHLが任意の時点でLFLまたはRHLのいずれかのサポートなしで完全な重量を負担することができなかったことを示唆しています。この傾向は、トレッドミル上の強制的な歩行速度に対処するための補償メカニズムを示唆しています。
定量化可能なデータは3Dシステムの使用から簡単に生成されましたが、これには別々のタブにアクセスし、ソフトウェア内で利用可能な多数のオプションから選択する必要がありました。定量的および定性的なデータを単一のレポートに生成する自動化されたテンプレートの開発に関する現在の作業は、(個別に異なる結果を生成する必要がなく)、最も明白な結果を得るために、日常的に行われています。臨床研究のために利用される運動学のシステム。したがって、複数のエンドポイントをコンパイルしてレポート形式でエクスポートし、試用後すぐに簡単に視覚化できます。
図 1:実験的なセットアップ。(A) トレッドミルウォーキングタスク用の6カメラキネマティックデータ収集設定の回路図。トレッドミルの両側に3台のカメラを設置し、移動中に左右のマーカーモーションをキャプチャします。(B) げっ歯類の前肢と後肢の骨のランドマーク上のマーカーの配置を示す図。合計11個のマーカーがラットの両側に配置されます。シェーディングされた領域は、ラットが剃られた領域を示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: キャリブレーション用マーカー。(A) Wand キャリブレーションシステムのマーカー セット割り当ては、L フレームと杖 (B)の 2 つのキャリブレーション フレームを使用して、L フレームの原点(フレームの 2 本の脚の交点)が (0,0) として定義される L フレームによって定義されます。L フレーム、L フレーム ショート、および L フレームの 2 つの四肢はそれぞれ X 軸と Y 軸を定義し、Z 軸は XY 平面に対して垂直として定義されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: マーカーの種類。(A) 使用した2種類のマーカーを示すラットの下幹の写真。(B)写真は、皮膚に付着するように設計された両面テープで腸の紋章に置かれたレトロ反射マーカーを示しています(赤い丸で囲まれた)。(C)写真は、右中足座咽頭関節(赤い丸で囲まれた)の上にペンマーカーを配置する方法を示しています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4:モーショントラッキング。(A) 画像は、「自動的にトラック」と「パターンマッチングを使用してトラック」機能を使用して複数のマーカーを同時に追跡できるモーショントラッキングインターフェースを示しています。(B) レトロ反射マーカーの拡大図は、マーカー割り当て時に「自動的に追跡」機能で明るい白色の円形スポットとして検出される。ソフトウェアは、明るい青色の円形スポットとしてこのスポットを認識します。赤い点は、最終的に所定のマーカーの中心として認識されます。円形マーカー内の中央の赤いスポットは、データ追跡中に実験エラーが発生する可能性を減少します。中心からの偏差は、その後の測定と解析が不正確である可能性が高いことを示唆しています。(C)パターンマッチング用に選択されたレトロ反射マーカーの拡大図。選択したマーカーのサイズ、形状、および色に基づいて、ソフトウェアは後続のビデオフレームの説明に一致するマーカーを自動的に識別します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5:基本的な追跡オプションと高度なトラッキングオプション。(A) ビデオは、分析中にビデオを右クリックすることでソフトウェア内で処理できるため、マーカーの不明確な表示やぼやけたマーカーが明確に視覚化され、自動トラッキングが可能になります。デモンストレーションの目的で、データ収集中に異なる周囲照明条件に合わせて調整された 2 種類の画像処理設定が表示され、追跡が容易になります。(B) 画像処理前の代表的なビデオフレーム。(C) 基本的な画像処理(処理タイプI)では、明るさとコントラストの設定が鮮明に調整されます。(D) 高度な画像処理設定(処理タイプII)を使用して、右中足骨咽頭ジョイントマーカー(黒マーカー)が反転し、自動的に追跡することができます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: フェーズの割り当て。各四肢の歩行サイクルは、実験計画に従って離散相に分けることができる。デモンストレーションの目的で、3 つの歩行サイクル フェーズが表示されます。(A) スタンスフェーズは、四肢がトレッドミル表面に接触する最初のフレームとして定義されます。(B) スイング位相は、四肢がトレッドミル表面を離れる最初のフレーム(C)中間スイングフェーズは、足が下降し始める四肢クリアランス後の最初のフレームである。(D)では、最初のスタンスの開始から次の歩行サイクルのスタンスフェーズ割り当てまで、完全な歩行サイクルが定義されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: ステップフェーズ分析の高度なオプション。このオプションを使用すると、追跡とフェーズの割り当ての詳細なビューと、フェーズの割り当てを変更できます。(A) マーカー選択ボックスを表示し、目的のマーカーを選択します。(B) 座標選択ウィンドウ: 対象の座標を強調表示すると(この場合、Z 座標)、メインダイアグラム ウィンドウに赤で表示されます。(C) 位相選択ウィンドウ:四肢に割り当てられた位相は、(A)と(B)で選択されたマーカーと座標に対して表示することができます。フェーズは、このウィンドウを使用して編集することもできます。(D) ダイアグラムウィンドウ:特定のマーカーの座標は、個々の歩行サイクルフェーズ中に同時に比較することができます。緑と黄色は、四足歩行中の右後肢のスタンスとスイングフェーズをそれぞれ表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 8: 3D キネマティックデータのサンプル。(A) 各ジョイントマーカーからの様々な結果は、ビデオトラッキング後の3D座標データセットから写真的に視覚化することができます(B)各前肢および後肢のスタンスとスイング位相サイクルのために生成された代表的なデータネズミの中を四足歩行。色は、連続するステップ サイクルのスタンスとスイング フェーズを表します。赤と緑は、それぞれ右前肢と後肢のスタンスフェーズに対応しています。青とティールは、それぞれ左前肢と後肢のスタンスフェーズに対応します。黄色は、各四肢のスイングフェーズに対応します。(C) 複数のデータグループ(不連続マーカーまたは結果)を同時に比較できます。左右の膝関節マーカーのZ座標速度データは、トレッドミル表面から膝関節マーカーの垂直速度を実証するために任意に選択される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 9: トレッドミル移動中の健康で頸椎脊髄損傷ラットからの代表的な関節角運動学データ。(A) 健全な代表的なラットの肘関節角度プロファイルは、動きの完全な範囲を表示する一貫した隣接歩行サイクルを持つ関節角度トレースの滑らかな、単一のピークを示しています。赤と黄色のバーは、前肢ステップサイクルのそれぞれスタンスとスイングフェーズを示します。(B) 対照的に、代表的な脊髄損傷ラットの痕跡は比較的歪み、関節運動の全体的な小さい範囲と一貫性のない複数のピークを示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 10: トレッドミル移動中にラットを傷つ有する健康で頚部脊髄からの代表的な四肢調整データ。(A) 歩数の高さ測定を示すメタカルポパランゲル(MCP)と中足底咽頭(MTP)マーカーのZ座標値は、四足歩行中の約10ステップから四肢間の6つの異なる組み合わせでプロットされる。6つの可能な四肢の調整ペアの代表的なデモンストレーションを示す図を示す。(B) 健康なラットは、すべてのペア(i、ii、iii、iv)に対して明確な交互のリズミカルな調整(L字型パターン)を示す。四肢が位相(v,vi)にある場合、コーディネーションペアはD字型パターンに従います。(C) 頸椎脊髄損傷ラットにおいて、注意(i)2つの前肢間の不十分な協調、(iii)右のイプシラルペアおよび(iv)反対肢対の1つに対する異常な協調。コーディネーション プロット(B,C)は同じスケールを共有しないことに注意してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 11: アニメーション3Dスティックフィギュア.追跡データから生成された 3D スティック図形の例。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
| キャリブレーションパラメータ | キャリブレーション入力 |
| ワンド長さ [mm] | 100人 |
| Lフレームフロアオフセット [mm] | 7 |
| 外れ値検出の反復 | 4 |
| 許可された杖の長さ偏差 | 0.3年 |
| 杖は、少なくとも__ カメラで表示する必要があります | 4 |
| アスペクト比を修正 | チェック |
| スキューパラメータを修正 | チェック |
| プリンシパル ポイントを修正する | チェック |
表 1: キャリブレーションの詳細設定。この表は、6 つのカメラのセットアップを正確に調整するために使用したパラメータをまとめたものです。これらの設定は実験的にテストされ、セットアップに最適なことがわかりました。
Discussion
このプロトコルの記事では、げっ歯類の四足歩行トレッドミル移動中の3Dキネマティックデータの収集と解析のためのモーショントラッキングシステムの使用を示します。3D運動運動解析システムの重要な特徴は、関節運動の運動学(ステップ相運動学、関節角度、運動範囲、ステップ速度)を同時に複数の関節と手足から詳細に定量し、検出を行う。肉眼では測定できない運動不足、データ収集と分析における主観的バイアスの排除、および運動中のラット全体の同時並置と比較できる四肢と姿勢運動学の容易な視覚化。追加されたアルゴリズムとモデリングを必要とせずに、この方法は、歩行のキネマティクスを詳細、効率、容易さ、精度、再現性で定量的に分析するソフトウェアの能力を示しています。
げっ歯類では、脊髄損傷(SCI)後の前肢および後肢運動障害は、一般にBBBスコアリングシステム1のような主観的かつ標準化されたローコモータスコアリングシステムを使用して評価される。主観的なスコアリングシステムは、異なる研究者が異なる運動欠損または異なる運動欠損に対して異なるスコアを割り当て、テスト13の再現性と感度を低下させ、結果としてテスターバイアスを導入します。.さらに、微妙な欠陥を検出することができないと、介入の影響を誤って推測するリスクが生じます。
これらの問題に対処するために、自動化されたシステム2、3、4、5および複雑なアルゴリズムの使用の有無にかかわらず、システム14、15は、一部の研究者によって採用されている。 これらのテストは、滑走路を横切って歩くラットの足の配置の動きから派生した体重ベアリングプロファイルとステップシーケンスパターンを明らかにするステップサイクル解析を実行します。しかし、腹部平面ビデオ歩行解析の主な欠点は、被験者の身体自体が直接見えない2,3である。これらのデータは、足や足の動きの印象から得られる情報に限定され、赤字を評価する際の歩行パラメータの選択と解釈に疑問を呈する(Chen et al.16参照)。四肢の動きと位置の動的なセグメント運動を明らかにする動きの詳細は、移動解析3,5では正確には得られない。関節角度データの重大な偏差(すなわち、運動の範囲、動きの速度など)、四肢内および四肢間の互いに対する関節の関係、および歩行パターンを変化させる基礎的な身体力学を得ることは不可能である。したがって、観察可能な歩行障害が単一および/または複数のセグメントジョイント運動の変化に起因するかどうか(すなわち、近位遠位内四肢調整、位置および歩行周期に関するトランクの姿勢関係)手足など)マスクされたままです。
現在利用可能なシステムのほとんどは、歩行運動学をキャプチャし、運動機能障害を定性的および定量的に評価しますが、あまり広く使用されています。全身高速ビデオトラッキング歩行解析システムは、3つの側面(1つの腹部と2つの側面面)からの自発的な歩行サイクルをフィルム化し、歩行結果の数を出力するために骨のランドマークを追跡17、18。矢状面運動歩行解析は、一部の研究者によって、興味のある後肢19、20の2Dモーションデータを得るために採用されている。しかしながら、視平面(横または矢状)に直交して起こる第3次元の動きは、分析11、18、19では検出できない。
その他、より洗練された3D、3つのボディセグメントのげっ歯類ボディ姿勢データ収集システムは、データ収集の3D数学的モデリングと解析システムを使用して、頭部を含めながらげっ歯類の身体セグメントの3Dモーションを追跡および定量化します。モーションパターン8.マデテらは9日、7つのカメラシステムを用いて、歩行ビームの地上移動中に3Dボディ姿勢運動を定量化するマーカーベースの光電子モーションキャプチャシステムを開発した。後者の2つの作品で研究された主な結果は、主に歩行分析ではなくげっ歯類の全体的な姿勢に焦点を当てています。3Dモーションキャプチャシステムは、Bhimani et al.21でレビューしたように、複数のカメラと精巧なソフトウェアシステムを使用して、高スループット3Dキネマティック歩行データを提供します。提示された3Dモーション解析システムの古いバージョンは、神経外傷12、22、23の有無にかかわらずラットの以前の研究でも使用されています。
研究のための3Dモーション収集および解析システムの利用可能性にもかかわらず、げっ歯類におけるこの技術の前臨床使用は比較的限られたままである。この問題の理由の一部は、データ収集および分析プロトコルが、歩行中にラットの後肢のキネマティックモデルに適合するキネマティックモデルと複雑なアルゴリズムを使用して、細かい高解像度を生成することに大きく依存していることです。歩行キネマティクス8、9、11、22.ここで示す詳細な方法論は、動物の取り扱い、トレーニング、実験セットアップ、データ収集、分析手順を含む実験プロセス全体に関連する手順の詳細を提供します。
また、プロトコルの基本的な部分であるシステムのキャリブレーションに関する詳細も提供され、被験者間および被験者間の隣接する試験間の再現性を保証します。説明したステップバイステップの手法は、データ収集手順に客観性を導入し、非常に再現性を高めます。このモーションキャプチャソフトウェアから生成されたデータは、動きの質のためにフレームごとに視覚化され、自動的に追跡することができます。さらに説明するこのデータの収集または定量化では、追加のアルゴリズムやモデリングを必要としない方法について説明します。学生、スタッフ、研究者は、特定の技術的専門知識に頼ることなく、単純な統計ソフトウェアを使用して基本的な運動出力を生成することができます。
このシステムは、地上移動、到達と把握、および実験目標に合わせて他の実験的なセットアップにも使用できます。マーカーの数とタイプは、必要に応じて、尾、背中、体幹、または耳に合わせて調整することもできます。システムと比較して提示されたソフトウェアの大きな利点は、被写体の高解像度ビデオデータを収集する能力です。そのため、複雑な計算セット(角度モーション、複数のジョイントを接続するスティックラインなど)を記録されたビデオに重ね合わせることができます。マーカーの配置と生成された3Dデータは、動いているラットの実際の動きで確認することができます。対照的に、他の3Dモーションキャプチャシステムでは、マーカーのみがキャプチャされ、実際の被写体のビデオの代わりにスティック図(骨格フレームワーク)で再解析を行う必要があります。その結果、実際の被写体の動きに対するマーカー配置の検証が不十分である。
このシステムの経験に基づいて、キャリブレーションはデータ収集の成功に重要な役割を果たします。システムのキャリブレーションは、変更に対して非常に敏感です。1 台のカメラのわずかな動きは、3D 座標データの収集および解析プロセス全体を危険にさらす可能性があります。データ収集には、ビュー プレーンの両側に 2 台のカメラのみが必要ですが、3 台目のカメラでは、各マーカーの位置を他のカメラと相互参照して、より正確な精度を提供することを強くお勧めします。トラッキング カメラの数が増えるにつれて、特定のマーカーの 3D 座標の精度も増加します。歩行不足(神経外傷後の歩行の場合はつま先のカールやドラッグなど)のためにマーカーが不明瞭になる場合、これらの条件は広範な手動追跡を要求する可能性があります。それにもかかわらず、トラッキングから最終的に生成されるデータ量は、マーカーを手動で追跡する時間に相当し、微妙な運動障害を検出する上で非常に貴重なツールです。
私たちの経験では、システムの使用に関連する退屈さは、機器や技術自体の使用を超えています。運動挙動の評価のための他のプロトコルと同様に、ラットがタスクのために処理され、訓練される方法は、結果に大きな影響を与えます。たとえば、ラットをコホートから分離することは、テスト中に重要です。それ以外の場合、テストされていないが、テスト中にまだ存在するラットは、タスクのパフォーマンスの最終的な劣化を示します。最適な室温、照明、騒音レベルは、その他の決定要因です。Fouadらは、ラット24における機能的なモータ試験に伴う他の課題を発表した。実際、この方法論に正しく従ったこの研究室の盲目のユーザーは、データ収集、モーショントラッキング、データ分析に大きなハードルを経験しませんでした。
本論文では、ロコモーターデータを効果的に収集・解析する3Dモーションキャプチャシステムを用いて、研究者が複数のラットから膨大な量の深部運動データを迅速に収集できるようにした。現在、ソフトウェアに組み込むことができ、ヒトで行われているのと同様に、げっ歯類のトレッドミル移動のために数秒以内に事前に決定された結果のレポートを生成できる自動データ分析テンプレートの作成に取り組んでいます。モーションキャプチャと解析システム6、25を使用した研究。このテンプレートの開発は、前臨床研究者がマウスボタンを数回クリックするだけで詳細なげっ歯類の運動データを得ることができます。本研究で提供される方法は、げっ歯類の運動行動をより客観的に評価するために前臨床研究者にとって有用であることが期待される。このシステムの使用は、リーチや把握などの一般的で熟練した前肢の動作中に、高スループットの3D運動データを収集するために行われています。重要なことに、この方法の有用性は、様々な神経外傷および非神経外傷性外傷を伴うラットに拡大することができる。
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
このプロジェクトに対するビデオと知的貢献のための実験的なセットアップに対する彼の支援に対するポーワン・シャルマへの特別な感謝。我々はまた、ビデオプロトコルのデモンストレーションを支援する彼の貢献にクリストファーパラシオに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 camera Basler (Scout scA640-120gu) motion capture system. | Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germany | N/A | Recording device for motion analytics. |
| Calibration Frame and Wand | Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germany | N/A | L-shaped calibration defining the global coordinate sysetem, and the trident shape wand (100 mm) |
| Markers | Shah Lab | N/A | Recording device for motion analytics. Markers are Custom made in our lab from 0.5cm googly-eyes covered with reflective tape. |
| Matlab | Mathworks, Inc, Natic, Ca | N/A | Data analysis software |
| Rodent Cage | Custom Made within Stony Brook. | N/A | Clear plexiglass cage used to keep the rodent on the treadmill. |
| Simi Reality Motion Systems | Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germany | N/A | 3D tracking Software. |
| Treadmill | Mk Automation Inc., Bloomfield, CT 06002 | N/A | Treadmill used for rodent locomotion. |
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