Summary
Presentert her er en protokoll for å samle og analysere tredimensjonale kinematikk av quadrupedal bevegelse i gnagere for prekliniske studier.
Abstract
Nytten av tredimensjonale (3D) Kinematisk bevegelsesanalyse systemer er begrenset i gnagere. En del av grunnen til dette utilstrekkelighet er bruk av komplekse algoritmer og matematiske modellering som følger 3D datainnsamling og analyse prosedyrer. Denne arbeide skaffer en enkel, bruker-vennlig, steg-av-steg detaljert metodikk for 3D Kinematisk gang analyse i løpet av tredemølle bevegelse inne rask og neurotraumatic rotter benytter en seks-kameraet forslag fange system. Også gitt er detaljer om 1) kalibrering av systemet i en eksperimentell oppsett tilpasset for quadrupedal bevegelse, 2) datainnsamling for tredemølle bevegelse i voksen rotter ved hjelp av markører plassert på alle fire lemmer, 3) alternativer tilgjengelig for video sporing og prosessering, og 4) grunnleggende 3D Kinematisk data generering og visualisering og kvantifisering av data ved hjelp av den innebygde datainnsamling programvare. Til slutt, det er en foreslo det hjelpemidlet av denne forslag fange system være expanded å studere en variasjon av motorisk opptreden tidligere og etter Biografiske filmer.
Introduction
I gnagere, forlemen og hindlimb bentap Locomotor underskudd etter nevrologiske lidelser er vanligvis vurdert ved hjelp av subjektive scoring systemer1. Automatiserte systemer2,3,4,5 har blitt vedtatt for gange analyse men lider av ulemper, fordi den primære utfall er basert på fotavtrykk analyse og unnlater å fange avgjørende segmental og felles Kinematisk variabler som ellers kan avsløre ekte kinematikk av lem bevegelser2. Siden de fleste gange parametere er korrelert, en samling av gange parametere er nødvendig for å forstå kompensasjoner vedtatt av rotter for å fullstendig vurdere motor underskudd.
I det siste tiåret har flere 3D bevegelsesanalyse systemer6 blitt utviklet for biomedisinsk forskning hos mennesker. Disse systemene har vært vellykket og vist seg å være effektive i å fange underskudd i bevegelse i friske mennesker voksne, samt endret kinematikk av walking6,7. Inne Red, aktuelle anvendelig 3D Kinematisk forslag systemer oppta innviklet algoritmer og modellering for bevegelsen opptreden og anvende sofistikert dataanalyse teknikker8,9,10,11 , som til slutt begrense sin allsidighet. Videre er metodene som brukes for å samle inn data med de fleste 3D-motion capture-systemer ikke tilstrekkelig forklart i litteraturen. Detaljene om datainnsamling og analyse prosedyrer, begrensninger og teknikker involvert i effektivt å bruke systemet mangler.
Følgelig er en av de vanligste begrepene blant forskerne at 3D bevegelsessporing Kinematisk vurderinger er ganske effortful og tidkrevende prosedyrer som trenger teknisk ekspertise og forseggjort dataanalyse. Hensikten med dette arbeidet er å bryte ned protokollene for datainnsamling og analyse og beskrive metodikken gjennom en trinnvis prosess, slik at den er objektiv, lett å lære og kan bli systematisk kontaktet. I dag er det en ny vekt på å vurdere funksjonell motorisk adferd på en mer helhetlig og systematisk måte etter nevrologiske skader og intervensjoner i prekliniske studier.
I riket av quadrupedal bevegelse, presenteres her er bruken av en 3D-motion tracking system som kan gi ytterligere informasjon som kroppsholdning, pote rotasjon med hensyn til kroppen akser, inter-relasjoner i leddene, og mer nøyaktig informasjon om koordinering, samtidig visualisere hele dyret fra alle fly. Dette i sin tur kan avdekke kritiske forskjeller i motorisk atferd innenfor og mellom sunne og skadde rotter gjennom flere utfall. Med en mer raffinert Kinematisk analyse som er nøyaktig og objektiv, er risikoen for feilaktig inferring virkningene av en intervensjon minimert. De genererte data fra denne Motion Capture-programvaren er visualisere frame-by-frame for kvaliteten på bevegelsen og kan spores automatisk, og datainnsamling eller kvantifisering krever ikke noen ekstra algoritmer eller modellering. Målet med dette arbeidet er å gi metodisk informasjon og betraktninger involvert i datainnsamling og analyse av 3D gange kinematikk under tredemølle bevegelse i sunne og spinal ledningen-skadde rotter. Denne protokollen er beregnet for bruk av prekliniske forskere som utnytter nevrologiske rotte modeller i eksperimenter.
Protocol
Denne studien ble utført i samsvar med anbefalingene fra National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av Laboratoriedyr. Protokollen ble godkjent av Stony Brook University Chancellor ' s Animal Research Committee.
1. oppsett av bevegelses opptakssystem
- Oppsett
- Monter seks kameraer på veggen (eller stativer) ved hjelp av fint justerbare gir hoder. Plasser tre kameraer over på hver side av tredemøllen, med hvert kamera vinklet 20 °-45 ° under horisonten, ca 2,0 m unna tredemøllen og ca 0,5 m unna tilstøtende kameraer for maksimal dekning av markører (figur 1).
- Utstyre hvert kamera med en ring lys for visualisering av retroreflektive markører.
- Start motion capture-systemet.
- Under prosjekt | Spesifikasjon, definere de ønskede markører for eksperimentet.
Merk: for demonstrasjonsformål brukes totalt 22 markører for både forelimbs og hindlimbs (11 markører på hver side) for å vurdere bilateral quadrupedal bevegelse. Alternativt kan import markør settet med spesifikke markør-ID- alternativer brukes for forhåndsinnstilte beregninger i programvaren.
- Under prosjekt | Spesifikasjon, definere de ønskede markører for eksperimentet.
2. kalibrering av motion capture-systemet
- Opptak av kalibrerings video
- Plasser den L-formede kalibrerings RAM men (heretter referert til som "L-Frame") ortogonalt på tredemøllen, med den lange delen av L-rammen som peker i Rat ' s walking retning (figur 2).
- Åpne Motion Capture-programvaren og velg Record for å ta opp kalibrerings videoen.
- Flytt Trident formet kalibrering ramme (heretter referert til som "wand") i hele tredemølle området i rommet slik som å dekke alle områder som rotte skal gå i.
Merk: L-rammen inneholder fire markører som etablerer det globale koordinatsystemet og tryllestaven inneholder tre markører som vil kalibrere 3D walking plass av rotte. - Spille inn minst 1 min av opptakene for å sikre tilstrekkelig wand datapunkter er til stede for riktig kalibrering på 120 rammer/s.
- Lagre videoene som 3D-kalibrerings filer.
- L-Frame-sporing
- Høyreklikk kamera gruppen, og velg 3D-sporing. Under rullegardinvinduet velger du 3D-kalibrerings videoer, og deretter alle kalibrerings kameraene.
- Ved hjelp av den faste punkt funksjonen, spor L-Frame opprinnelse, L-Frame kort, L-Frame midten, og L-ramme lang på hver av de seks kalibrering videoer. Definer alle punkter, og velg Søk automatisk -knappen.
Merk: L-Frame posisjon må være konsistent i forhold til tredemøllen under hele eksperimentet for å hindre at koordinatsystemet skifter.
- Sporing av tryllestaven
- Høyreklikk på kameraet gruppen og velg automatisk 3D-wand Tracking.
- Velg alle kameraene i kamera valget. Nederst til høyre i vinduet velger du Alternativer, de-velger Finn L-rammenog velger Start sporing.
- Etter automatisk sporing velger du Tildel kort, wand mid og wand Long markører for alle seks kameraer.
- Velg Eksporter til rådatai 3D-sporing -vinduet, og velg deretter Overskriv eksisterende tryllestav data for å lagre sporingen.
- Velg Ja i vinduet som vises etter det siste trinnet for å lagre de mest nøyaktige dataene.
Merk: denne nye sporing vil bli lagret som sporing under automatisk sporing tab i venstre sidebar. Lagret sporing kan åpnes og redigeres senere.
- Beregne kalibrering
- Høyreklikk kamera kalibrerings grupper og velg ny tryllestav kalibrerings gruppe.
- Velg alle kameraer og hold nede CTRL -tasten (Control) mens du velger OK.
- Endre wand lengde til 100,00 mm, L-Frame gulv offset til 7,00 mm, gjentakelser for avvikende-deteksjon til 4, og tillot wand lengde-avvik til 0,300.
- Endre kameraet at tryllestaven må være synlig i alternativ til 4, og slå på følgende: Fix størrelsesforhold, fikse skew parameter, og fikse rektor punkt (tabell 1).
Merk: disse innstillingene ble eksperimentelt bestemt på å være optimale for dette oppsettet. - Godta kalibreringer med standardavvik på tryllestav lengde mindre enn 3 mm og restverdi på mindre enn 0,004.
Merk: Hvis kameraene eller tilknyttet utstyr flyttes forbi dette punktet, må du kalibrere systemet på et senere tidspunkt.
3. opplæring og forberede dyret for tredemølle bevegelse
- Trening rotter for tredemølle bevegelse
- Akklimatisere seg rotter på tredemøllen i 5 minutter før en treningsøkt12.
- Tog rottene å gå med i sin helhet vekt holdning opp på deres lemmer for 13 cm/s for 15 min/samling inne morgen for 1 uke. Tog alle rotter til de er dugelig av forenlig gåing (minst mulig av 10 sammenhengende skritt) på tredemølle12.
- Fullstendig lærer opp møter i nærheten det likt tid av dagen for hver rotten.
- Tidligere å datainnsamling av bedøve rotta av sted rotta inne en inkubasjons kammeret.
- Levere isoflurane gass (1,0%-2,5%) og 0,4 L av oksygen i ca 5 min. knip foten av rotte for å se etter dybden av anestesi.
- Fortsette når rotta reagerer ikke å det pote hugge (negativ pote tilbaketrekking refleks).
- Barbere rotta inne områder der hvor markører ville være oppstilt å unngå det fur fra gripe inn med merke oppsporer (skikkelsen 1).
- Palpate huden for bein landemerket for å plassere markørene. Bruk pennemarkører for skjøter som kan brukes til albuen og kneet (Figur 3).
Merk: retroreflektive markører er plast halvkuler 0,5 cm i diameter dekket med retroreflektive tape. - Plasser markørene som ønsket på bein landemerker før datainnsamlingen (Figur 3).
Merk: i friske, ikke-neurotraumatic rotter, retroreflektive markører plassert over fjernt ledd er ofte fjernet av rotter. For demonstrasjonsformål, er retroreflektive markører plassert over proksimale bein landemerker (iliaca kam, hofte, kneleddet for hindlimbs, skulder og albue ledd for forlemen), og penn markører brukes for de mer tette landemerkene. I våre hender har dette gitt reproduserbar resultater mellom og innen rotter (upubliserte data).
- Palpate huden for bein landemerket for å plassere markørene. Bruk pennemarkører for skjøter som kan brukes til albuen og kneet (Figur 3).
4. Motion fangst
- Velge det rød kameraet knapp på topp stang av bevegelsen fange programvare å fortegnelse en prøve. Angi lagringsplasseringen på datamaskinen, og velg Start innspilling for å spille inn med 120 rammer/s.
- Sette en bruker-definerte tredemølle fart og tillate rotta å gå for ca 30 s, eller et minimum av 10 sammenhengende skritt.
- Stopp opptaket og kontroller at opptaket inneholder minst ~ 10 kontinuerlige trinn før du fortsetter.
- Opprett en ny kamera gruppe for hvert prøveabonnement etter at du har lagret den innspilte videoen.
5. Motion sporing
- Velg « +»-tegnet ved siden av den lagrede kamera gruppen. Dette vil vise en liste over alle seks kameraer.
- Tilordne 3D-kalibrering til kamera filen
- Gå til kamera kalibrering gruppe og høyreklikk på beregnet kalibrering. Velg Tilordne parametere for 3D-kamera. Tilordne kalibrerings filen til de riktige kamera filene i den lagrede kamera gruppen. Hold pekeren over kamera filen for å bekrefte kalibreringen (leser som 3D-kalibrering gyldig).
- Individuelt kamera 2D-sporing
- Høyreklikk kamera gruppen for bevegelsessporing. Velg 2D-sporing.
- Velg sju til ti beste kontinuerlige og konsekvente trinn for sporing. Ta opp ramme nummeret ved første kontakt av referanse lem på tredemøllen for hvert trinn.
Merk: for demonstrasjonsformål ble venstre bakben valgt som referanse lem.
- Ulike sporingsalternativer er tilgjengelige.
- Høyreklikk på markør av interesse og velg automatisk sporing, som vil oppdage lyse sirkulære flekker opprettet av retroreflektive markører (Figur 4).
- Alternativt kan du spore markører ved hjelp av mønstergjenkjenning, som vil bruke en algoritme som er innebygd i programvaren, til å spore markører basert på størrelse og farge (Figur 4).
- Spor og rett undetectable markører eller feil i sporing manuelt.
- Bruk svarte markører når det ikke er mulig å gjøre skjøter retroreflektive markører.
- Spor svarte markører ved hjelp av avansert bildebehandling ved å invertere svarte markører til lyse punkter for automatisk sporing.
Merk: alternativet for bildebehandling kan brukes til å hjelpe med å spore markører som er vanskelige å oppdage eller se. - Høyreklikk på rotte videoen i 2D Tracking-vinduet. Velg bildebehandling.
- Velg Avansert visning , og Legg til en kombinasjon av de fire filtrene (lysstyrke, kontrast, gamma) for å gjøre den svarte markøren så mørk som mulig i forhold til omgivelsene. Til slutt, Legg inverter, og den svarte markøren vil bli en lys markør som kan spores automatisk (figur 5).
- Spor svarte markører ved hjelp av avansert bildebehandling ved å invertere svarte markører til lyse punkter for automatisk sporing.
- Korreksjon av markørplassering
- Spor og rett undetectable markører eller feil i sporing manuelt.
- Hvis du vil spore videoen manuelt, velger du ønsket markør på høyre Sidepanel. Høyreklikk og velg manuell sporing. Begynn å spore valgt markør på Rat-videoen som vises som bilde for bilde.
- Hvis du vil rette opp eventuelle feil, går du til rammen der sporings feilen oppstod. Rett-falle i staver på spesifikk merke tab inne retten side og falle i staver fjerne punkt. Retrack punktet manuelt i nøyaktig posisjon.
- Bruk fremgangsmåten ovenfor til å fullføre 2D-sporing for alle kameraer som brukes for alle ønskede markører i ramme området med kontinuerlige trinn.
- Klikk på Lagre gjennom sporings prosessen.
6. Kinematisk analyse
- Fase tildelinger
- Høyreklikk faser , og velg Rediger fase modell.
- Tilpass gange syklus faser for hver lem i henhold til underskudd man velger å studere (f. eks, tillegg av drag faser, tå Curl faser, etc.) innenfor den tradisjonelle holdning og swing faser av en trinn syklus. Definer fasene for eksperimentet (figur 6).
Merk: for demonstrasjonsformål vises tre faser her, og venstre hindlimb bentap brukes som referanse lem for de sju til ti gange syklusene. - Høyreklikk kameraet i kamera gruppen, og velg Vis video.
- Tildel faser av gange syklusen for hver lem i programvaren ved hjelp av Legg til fase-knappen eller F11 hurtigtast.
- Velg riktig lem under analyse og utpeke den første rammen av sporing som starten av holdning fase.
- Progress videoen til rammen der holdning fase ender og sving fase starter. Angi denne rammen som starten på sving fasen.
- Progress videoen til den første rammen der foten begynner å stige. Angi denne rammen som starten på den midtre sving fasen.
Merk: heri, holdning fase av en trinn syklus for hver Lem er definert som den første rammen der lem kontakter tredemøllen overflaten. Swing fase er definert som den første rammen der lem forlater tredemøllen overflaten. Mid swing fase er rammen der lem oppnådde maksimal klaring og begynner å stige. En komplett gange syklus er definert fra utbruddet av første holdning til holdning fase tildeling av neste gang syklus. - Gjenta disse trinnene til oppgavene i lem fasene er fullført for hvert trinn. Gjenta for de tre andre lemmer.
- 3D-koordinat beregninger
- Utfør 3D-beregninger etter å ha sporet alle seks kameraene.
- Høyreklikk på kamera gruppen og velg ny 3D-beregning, klikk på alle for kamera valg og velg deretter OK.
Merk: en ny mappe vises. Denne mappen inneholder alle 3D-koordinat data for alle markørene som spores. Hvis du vil vise og/eller redigere faser, høyreklikker du på 3D-koordinater i venstre sidepanel og velger Rediger faser (figur 7). - Generer data av interesse som felles høyde eller hastighet diagrammer med datapunkter ved å dra ut markør av interesse å vise side om side med de tildelte gange faser. (f.eks. felles kinematikk i Figur 8).
- 3D-diagram
- Klikk 3D-diagram for å generere en 3D-figur av rettssaken.
- Eksporter rådata ved å høyreklikke på 3D-koordinater/Eksporter.
- Høyreklikk 3D- koordinat filen , og velg Eksporter.
- Åpne filen i et regnearkprogram og Importer dataene til MATLAB.
- Lag et program for å lage tomter av lem trinnhøyde koordinering.
Merk: 3D koordinere data kan eksporteres til analyseprogramvare eller egendefinerte definerte makroskript for å generere mer data, utover hva programvaren funksjoner tilbyr.
Representative Results
Denne protokollen demonstrerer en metodikk for kvantitativ 3D Kinematisk datainnsamling og analyse for tredemølle bevegelse i gnagere ved hjelp av en enkel, innebygd programvare. Resultatene viser at protokollen er gjennomførbart i å samle inn og analysere quadrupedal bevegelse kinematikk i sunne og spinal ledningen-skadde rotter. Forskning med rotten handling erfaring må sted markører opp på rotter, så kalibrering og bruk bevegelsen fange system uten alle betenkelig utgaver. Data er lett genereres uten bruk av komplekse algoritmer.
Her protokollen ble implementert i sunne og ryggmargen skadde (C5 høyre hemisection) rotter. For hensikten med dette manuskriptet vises bare representative resultater. Overall, ulike kinematikk av Joint og lem segment bevegelse var lett oppnåelig fra 3D-koordinatene til hver markør. Det ble lett å oppdage kritiske forskjeller mellom unormal gange og sunn gange med flere utfall, inkludert (men ikke begrenset til) trinnhøyde målinger, felles hastighet, felles vinkel (figur 9), trinn syklus fase varigheter for alle fire lemmer, og lem koordinering (Figur 10). Analyse av kvalitative data i form av tomter og Stick diagrammer kan veilede fastsettelse av kvantitative verktøy som brukes til å gjennomføre for de endelige resultatene av denne analysen tilnærming (Figur 11).
Inne en Distinguished rask rotten, det albue innfallsvinkel profil bevist glatte, enkelt toppene med gjennomført nærliggende gang kretsløpene det vist en fullstendig omfang av forslag (skikkelsen 9). Den vekslende holdning fase og sving fase varigheter av sporene foreslått konsistent intralimb koordinering. I kontrast til albue vinkel profil av en representativ ryggmargen skadet rotte demonstrert flere forvrengte topper, som var mindre konsistent og av mindre områder av bevegelse. I tillegg til endringer i forlenget holdning fase og forkortet swing fase varigheter, var det en mangel i intralimb koordinering for RFL.
I den presenterte representative data plottet for koordinering, ble det funnet at koordinering tomter (Figur 10) generert fra representative friske rotter viste veldefinert, vekslende rytmisk koordinering i ipsilateral lemmer under gange sykluser (L-formet mønster) og i-fase D-formet mønster med kontralateral lemmer. Til sammenligning viste en representant spinal Cord-skadde (C5 høyre hemisection) rotte dårlig ikke-vekslende og ikke-rytmisk koordinering i ipsilateral lemmer og en uvanlig vekslende rytmisk koordinering (L-formet mønster) i en av kontralateral lemmer (Figur 10). Gitt den synlige underskuddet i riktig forlemen i den innspilte motion video, tyder dette på at RFL og LHL var ute av stand til å bære full vekt uten støtte fra enten LFL eller RHL til enhver tid. Denne trenden antyder en kompenserende mekanisme for å takle den tvungne walking hastighet på en tredemølle.
Målbare data ble lett generert fra bruk av 3D-systemet, men dette innebar tilgang til separate faner og velge fra en rekke alternativer tilgjengelig i programvaren. Det er nåværende arbeid på å utvikle en automatisert mal som vil generere kvantitative og kvalitative data i en enkelt rapport for de mest åpenbare utfall av interesse (uten behov for å individuelt generere ulike utfall), som rutinemessig gjøres med kinematikk systemet benyttet for kliniske studier. Dermed kan flere endepunkter kompileres og eksporteres i et rapportformat som lett kan vises umiddelbart etter en prøveversjon.
Figur 1 : Eksperimentell oppsett. (A) skjematisk av en seks-kamera Kinematisk datainnsamling satt opp for en tredemølle walking oppgave. Et sett med tre kameraer er plassert på begge sider av tredemøllen for å fange (frame-by-frame) venstre og høyre markørbevegelser under bevegelse. (B) diagram som viser markørplassering over bein landemerker på gnager ' s forelimbs og hindlimbs å fange quadrupedal bevegelse kinematikk. I alt 11 markører er plassert på hver side av rotte. Det skyggen områder viser arealet der hvor rotta er barbere. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Markører for kalibrering. (A) markør sett oppgaver for tryllestav kalibreringssystemet, ved hjelp av to kalibrerings RAM mer: l-Frame og wand (B) koordinatsystemet er definert av l-rammen, der l-Frame opprinnelse (skjæringspunktet mellom to Ben av rammen) er definert som (0,0). De to lemmer av L-Frame, L-ramme kort, og L-Frame lang definere x-og y-akser, henholdsvis, og z-aksen er definert som vinkelrett på XY flyet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Markerings typer. (A) fotografi av rotte nedre stammen viser de to typer markører brukes. B Fotografiet demonstrerer en retroreflektive markør plassert på iliaca kam med dobbeltsidig tape som er designet for å følge huden (sirkel rød). C Fotografiet demonstrerer plasseringen av en Penne markør over høyre metatarsophalangeal skjøt (rød sirkel). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Bevegelsessporing. (A) bilde viser bevegelses sporings grensesnittet der flere markører kan spores samtidig ved hjelp av funksjonene "spor automatisk" og "spor ved hjelp av mønstergjenkjenning". (B) forstørret visning av en retroreflektive markør oppdages som en lys hvit sirkulær flekk i "Track automatisk" funksjon under markør oppdraget. Programvaren gjenkjenner dette stedet som en lys blå sirkulær spot. Den røde prikken er til slutt anerkjent som sentrum av foreskrevet markør. En sentrert rød flekk innenfor den sirkulære markøren reduserer sjansene for eksperimentelle feil under data sporing. Avvik fra midten tyder på at påfølgende måling og analyser sannsynligvis vil være unøyaktige. C Forstørret visning av en retroreflektive markør valgt for mønstergjenkjenning. Basert på størrelsen, formen og fargen på den valgte markøren, identifiserer programvaren automatisk markører som samsvarer med beskrivelsen i de etterfølgende videobildene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Grunnleggende og avanserte sporingsalternativer. (A) videoer kan behandles i programvaren ved å høyreklikke på videoen under analysen, slik at uklare eller uklare markører er klart å visualisere for å tillate automatisk sporing. For demonstrasjonsformål vises to typer bildebehandlings innstillinger som justeres for å imøtekomme ulike omgivelseslys forhold under datainnsamlingen for enkel sporing. (B) en representativ videoramme før bildebehandling. (C) for grunnleggende bildebehandling (behandlingstype I), lysstyrke og kontrastinnstillinger justeres for en klarere visning. (D) ved hjelp av avansert bildebehandling innstillinger (PROSESSERING type II), høyre metatarsophalangeal felles markør (svart markør) er invertert og kan deretter spores automatisk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Fase tildelinger. Gange syklus for hvert lem kan deles inn i diskrete faser i henhold til eksperimentell design. For demonstrasjonsformål vises tre gange syklus faser. (A) holdning fase er definert som det første bildet der lem kontakter tredemøllen overflaten. (B) swing fase er definert som den første rammen der lem forlater tredemøllen overflaten (C) mid swing fase er det første bildet etter lem klaring der labben begynner å stige. I (D), en komplett gang syklus er definert fra utbruddet av den opprinnelige holdning til holdning fase tildeling av neste gang syklus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Avanserte alternativer for trinn fase analyse. Dette alternativet gir en detaljert visning av sporings-og fase tilordninger, i tillegg til muligheten til å endre fase tildelinger. (A) valgboks for markering for å vise og velge ønsket markør. (B) koordinat valg vindu: utheve koordinaten av interesse (i dette tilfellet, z-koordinater) vil vises som rødt i hovedvinduet i diagrammet. (C) fase valg vindu: tildelte faser for et lem kan sees med hensyn til markører og koordinater valgt i (a) og (B). Du kan også redigere faser gjennom dette vinduet. (D) diagram-vindu: koordinater for en bestemt markør kan sammenlignes samtidig under individuelle gange syklus faser. Den grønne og gule representerer holdning og swing faser henholdsvis for høyre hindlimb bentap under quadrupedal bevegelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 : Eksempel på 3D-Kinematisk data. (A) ulike utfall fra hver felles markør kan være pictorially fra 3D-koordinat datasettet etter video sporing (B) representative data generert for holdning og sving fase sykluser for hver forlemen og hindlimb bentap under quadrupedal går i en rotte. Farger representerer holdning og swing faser av påfølgende trinn sykluser. Rød og grønn svarer til høyre forlemen og hindlimb bentap holdning faser hhv. Blå og turkis tilsvarer henholdsvis venstre forlemen og hindlimb bentap holdning. Gult tilsvarer sving fasen til hver lem. (C) flere datagrupper (diskrete markører eller utfall) kan sammenlignes samtidig med letthet. Z-koordinat hastighet data av venstre og høyre kneleddet markører er vilkårlig valgt å demonstrere den vertikale hastigheten av kneleddet markør fra tredemøllen overflaten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9 : Representative felles kantete kinematikk data fra friske og cervical ryggmargen skadet rotter under tredemølle bevegelse. (A) albueleddet vinkel profil i en sunn representant rotte demonstrerer glatte, enkelt topper av felles vinkel spor med konsekvent tilstøtende gang sykluser som viser komplett spekter av bevegelse. Røde og gule striper betegner holdning og sving faser henholdsvis av forlemen trinn syklus. (B) i kontrast, sporene i en representativ ryggmargen skadet rotte er relativt mer forvrengt og viser inkonsekvent flere topper med en samlet mindre utvalg av felles bevegelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10 : Representative lem koordinering data fra en sunn og cervical ryggmargen skadet rotte under tredemølle bevegelse. (A) z-koordinat verdier for METACARPOPHALANGEAL (MCP) og METATARSOPHALANGEAL (MTP) som viser trinnhøyde målinger, tegnes inn i seks forskjellige kombinasjoner mellom lemmer fra ca. 10 trinn under quadrupedal gange. Vist er representative demonstrasjon av alle de seks mulige lem koordinering parene. (B) en sunn rotte viser klare vekslende rytmisk koordinering (L-formet mønster) for alle parene (i, II, III, IV). Når lemmer er i fase (v, vi), samordning parene følger et D-formet mønster. (C) i en cervical ryggmargen skadet rotte, note (i) dårlig koordinering mellom de to forelimbs, (III) høyre ipsilateral sammenkobling og (IV) uvanlig koordinering for en av de kontralateral lem parene. Vær oppmerksom på at koordinerings plott (B, C) ikke deler samme skala. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11 : Animert 3D Stick Figur. Eksempel på en 3D Stick Figur generert fra sporede data. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
| Parameter for kalibrering | Kalibrering innganger |
| Tryllestav lengde [mm] | 100 |
| L-Frame gulv forskyvning [mm] | 7 |
| Gjentakelser for avvikende-gjenkjenning | 4 |
| Tillatt wand-lengde-avvik | 0,3 |
| Tryllestaven må være synlig i minst _-kameraer | 4 |
| Fiks størrelsesforhold | Sjekket |
| Fix skew parameter | Sjekket |
| Fix viktigste punkt | Sjekket |
Tabell 1: avanserte innstillinger for kalibrering. Tabellen oppsummerer parametrene vi brukte for å nøyaktig kalibrere seks-kameraet satt opp. Disse innstillingene ble eksperimentelt testet og funnet optimalt for vårt oppsett.
Discussion
Denne protokollen artikkelen demonstrerer bruken av en Motion tracking system for innsamling og analyse av 3D Kinematisk data under quadrupedal tredemølle bevegelse i gnagere. Viktige funksjoner i 3D Kinematisk Motion analysesystem inkluderer detaljerte kvantifisering av kinematikk av felles bevegelse (trinn fase kinematikk, felles vinkler, spekter av bevegelse, trinn hastigheter) fra flere ledd og lemmer samtidig, påvisning av motor underskudd unmeasurable av det blotte øye, eliminering av subjektive bias i datainnsamling og analyse, og enkel visualisering av hele lem og postural kinematikk som kan sammenlignes med samtidige sidestilling av hele rotte i bevegelse. Uten behov for ekstra algoritmer og modellering, viser metodene programvaren evne til å kvantitativt analysere kinematikk av gange med stor detaljrikdom, effektivitet, letthet, presisjon og reproduserbarhet.
I gnagere, forlemen og hindlimb bentap Locomotor underskudd etter en ryggmargsskade (SCI) er ofte vurdert ved hjelp av subjektive og standardiserte Locomotor scoring systemer som BBB scoring system1. Subjektive scoring systemer generelt innføre tester bias fordi ulike forskere kan tildele ulike score for samme motor underskudd eller samme poengsum for ulike motoriske underskudd, noe som resulterer i redusert reproduserbarhet og følsomhet av testen13 . Videre bærer manglende evne til å oppdage subtile underskudd risikoen for feilaktig inferring på virkningene av en intervensjon.
For å bekjempe disse problemene, automatiserte systemer2,3,4,5 og systemer med eller uten bruk av komplekse algoritmer14,15 har blitt vedtatt av noen etterforskere. Disse prøvene utføre steg syklus analyse det avsløre vekt holdning profiler og steg orden mønstre avledet fra pote plasseringen bevegelser av rotter gåing vannrett en rullebane. Imidlertid er en stor ulempe med ventrale Plane video gange analyse at faget kroppen i seg selv er ikke direkte synlig2,3. Disse dataene blir begrenset til informasjon innhentet fra visninger av føtter og pote bevegelser, spørsmålstegn ved utvelgelse og tolkning av gange parametre for å vurdere underskudd (se Chen et al.16). Detaljer om bevegelse som avslører dynamisk segmental kinematikk av lem bevegelse og posisjonering er ikke nøyaktig oppnåelig for bevegelse analyse3,5. Kritiske avvik av felles vinkel data (dvs. spekter av bevegelser, hastighet av bevegelser, etc.), forholdet mellom leddene med hensyn til hverandre i et lem og mellom lemmer, og underliggende kroppen mekanikk som endrer gange mønstre er umulig å få. Som sådan, om eventuelle synlige funksjonshemninger er påfølgende endringer i enkelt-og/eller flere segmental ledd bevegelser (dvs. proksimale intralimb koordinering, postural forhold av stammen med hensyn til posisjon og gange syklus av lemmer, etc.) forbli maskert.
Få aktuelle anvendelig systemer fange gange kinematikk og vurdere motoriske dysfunksjon kvalitativt og kvantitativt bortsett fra er færre vidt anvendt. En full-body høyhastighets video-sporing gange analysesystem filmer spontan gange sykluser fra tre sider (en ventrale og to laterale fly) og spore bein landemerker å sende ut en rekke gange utfall17,18. Sagittal Plane Kinematisk gange analyse er ansatt av noen forskere for å få 2D Motion data av interesserte hindlimb bentap19,20. Imidlertid er en tredje dimensjon av bevegelse som oppstår ortogonale til visning Planet (lateral eller sagittal) undetectable i analysene11,18,19.
Annet flere sofistikert, 3D, tre kropp-avsnitt gnager kropp postural datainnsamling systemer anvende 3D matematisk modellering av datainnsamling samt analysesystem å bane og Kvantifisere det 3D forslag av det gnager ' kropp-avsnitt stund inkluderer leder Bevegelsesmønster8. Madete et al.9 har utviklet en markør basert Optoelektronisk motion capture system for å kvantifisere 3D kroppen postural kinematikk under Overground bevegelse på walking bjelker med en syv kamera system. De viktigste resultatene studert i de to sistnevnte arbeider primært fokusere på den generelle holdningen til gnager snarere enn gange analyse. 3D motion capture-systemer gir høy gjennomstrømming 3D Kinematisk gange data ved hjelp av flere kameraer og forseggjort programvaresystemer, som gjennomgått av Bhimani et al.21. Eldre versjoner av de presenterte 3D motion Analysis system har også blitt brukt i tidligere arbeid i rotter med og uten Biografiske filmer12,22,23.
Til tross for tilgjengeligheten av 3D motion Collection og analyse systemer for forskning, prekliniske bruk av denne teknikken i gnagere er fortsatt relativt begrenset. En del av grunnen til dette problemet er at datainnsamling og analyse protokoller stole tungt på bruk av bygningen Kinematisk modeller og kompliserte algoritmer som passer en Kinematisk modell av rotte ' s hindlimb bentap under walking å generere fine, høy oppløsning gange kinematikk8,9,11,22. Den detaljerte metodikk som presenteres her gir detaljer om prosedyren involvert i hele den eksperimentelle prosessen inkludert dyr håndtering, opplæring, eksperimentell oppsett, datainnsamling, og analyse trinn.
Også gitt er detaljer om kalibrering av systemet, som er den grunnleggende delen av protokollen, som vil sikre reproduserbarhet mellom tilstøtende studier innenfor og mellom. De beskrevne trinn-for-trinn-teknikkene introduserer objektivitet i datainnsamlings prosedyren og gjør den svært reproduserbar. De genererte data fra denne Motion Capture-programvaren kan bli visualisere ramme-for-Frame for kvaliteten på bevegelsen og automatisk spores. Nærmere beskrevet er hvordan denne datainnsamlingen eller kvantifisering ikke krever noen ekstra algoritmer eller modellering. Studenter, ansatte og forskere kan bruke enkel statistisk programvare for å generere grunnleggende Kinematisk-utdata uten å stole på spesifikk teknisk ekspertise.
Dette systemet kan også brukes til Overground bevegelse, nå og fatte, og andre eksperimentelle set-ups som passer den eksperimentelle mål. Antall og type markører kan også justeres for hale, rygg, stamme eller ører, etter behov. En større fordel med de presenterte programvare i forhold til systemer er dens evne til å samle høyoppløselig video data av faget. Som sådan, komplekse sett av beregninger (dvs. kantete bevegelser, Stick linjer forbinder flere skjøter, etc.) kan legges oppå den innspilte videoen. Markørplassering og de genererte 3D-data kan verifiseres med faktiske bevegelser av en rotte i bevegelse. I kontrast med andre 3D motion capture-systemet, bare markører er fanget, og eventuelle re-analyse må gjøres på pinnen diagrammer (skjelettlidelser rammeverk) i stedet for video av den faktiske faget. Følgelig mangler verifisering av markørplassering på faktisk motivbevegelse.
Basert på erfaring med dette systemet, spiller kalibrering en avgjørende rolle i suksessen til datainnsamlingen. Kalibreringen av systemet er svært følsom for endring. og liten bevegelse av ett kamera kan kompromittere hele 3D-koordinat datainnsamling og analyse prosessen. Bare to kameraer på hver side av en visning flyet er nødvendig for datainnsamling, men det tredje kameraet er sterkt anbefalt å gi mer nøyaktighet ved kryssreferanse plasseringen av hver markør med andre kameraer. Etter hvert som antall sporings kameraer øker, øker nøyaktigheten av 3D-koordinaten for en bestemt markør også. I tilfeller der markører blir skjult på grunn av gange underskudd (for eksempel tå curling eller dra i tilfelle av gange etter Biografiske filmer), kan disse forholdene kreve omfattende manuell sporing. Likevel er mengden data til slutt generert fra sporing verdig den tiden investert i manuelt sporing av markører, noe som gjør det til et uvurderlig verktøy i å oppdage subtile motoriske underskudd.
I vår erfaring ligger enhver tediousness forbundet med bruk av systemet utover bruk av utstyret og teknologien i seg selv. Analog med annet protokoller for vurderingen av motorisk opptreden, metoden med hvilke rotter er håndterte og utdannet for vervet i stor grad beveger resultater. For eksempel, isolere rotter fra deres kohort er betenkelig i løpet av tester; ellers, rotter det er ikke testet bortsett fra er fremdeles gave i løpet av tester viser til slutt forverring av oppgave gjennomførelse. Optimale romtemperaturer, lys og støynivåer er andre faktorer. Fouad et al. publiserte andre utfordringer som følger med funksjonell motor testing på rotter24. Faktisk, blindet brukere fra dette laboratoriet som fulgte metodikken riktig ikke oppleve noen store hekk med datainnsamling, Motion tracking, og dataanalyse.
I denne utredningen, en 3D motion capture system for å samle inn og analysere Locomotor data effektivt er beskrevet slik at forskerne kan samle enorme mengder i dybden Locomotor data raskt fra flere rotter. Vi jobber for tiden med å lage en automatisert dataanalyse mal som kan bygges inn i programvaren og bli i stand til å generere en rapport av forhåndsbestemt utfall innen få sekunder for tredemølle bevegelse i gnagere, i likhet med hva som er gjort i menneskelig studier som bruker motion capture og analyse systemer6,25. Utviklingen av denne malen vil tillate prekliniske forskere å få detaljert gnager Locomotor data på bekvemmeligheten av noen få klikk med en museknapp. Det er å håpe at metodene som tilbys i dette arbeidet vil være nyttig for prekliniske forskere å vurdere gnager motor atferd mer objektivt. Vi er nå finessing bruken av dette systemet til å samle høy gjennomstrømming 3D Kinematisk data under vanlige, dyktige forlemen atferd som å nå og gripe. Betydelig, nytten av denne metoden kan expanded å rotter med en variasjon av neurotraumatic og ingen-neurotraumatic skadene.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vår spesielle takk til Pawan Sharma for hans assistanse med eksperimentell oppsett for video og intellektuelle bidrag til dette prosjektet. Vi takker også Christopher Palacio for hans bidrag til hjelp med demonstrasjon av video-protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 camera Basler (Scout scA640-120gu) motion capture system. | Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germany | N/A | Recording device for motion analytics. |
| Calibration Frame and Wand | Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germany | N/A | L-shaped calibration defining the global coordinate sysetem, and the trident shape wand (100 mm) |
| Markers | Shah Lab | N/A | Recording device for motion analytics. Markers are Custom made in our lab from 0.5cm googly-eyes covered with reflective tape. |
| Matlab | Mathworks, Inc, Natic, Ca | N/A | Data analysis software |
| Rodent Cage | Custom Made within Stony Brook. | N/A | Clear plexiglass cage used to keep the rodent on the treadmill. |
| Simi Reality Motion Systems | Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germany | N/A | 3D tracking Software. |
| Treadmill | Mk Automation Inc., Bloomfield, CT 06002 | N/A | Treadmill used for rodent locomotion. |
References
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Beare, J. E., et al. Gait analysis in normal and spinal contused mice using the TreadScan system. Journal of Neurotrauma. 26 (11), 2045-2056 (2009).
- Nakamura, A., et al. Low-cost three-dimensional gait analysis system for mice with an infrared depth sensor. Neuroscience Research. 100, 55-62 (2015).
- Pfister, A., West, A. M., Bronner, S., Noah, J. A. Comparative abilities of Microsoft Kinect and Vicon 3D motion capture for gait analysis. Journal of Medical Engineering & Technology. 38 (5), 274-280 (2014).
- Alt Murphy, M., Murphy, S., Persson, H. C., Bergstrom, U. B., Sunnerhagen, K. S. Kinematic Analysis Using 3D Motion Capture of Drinking Task in People With and Without Upper-extremity Impairments. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Karakostas, T., Hsiang, S., Boger, H., Middaugh, L., Granholm, A. C. Three-dimensional rodent motion analysis and neurodegenerative disorders. Journal of Neuroscience Methods. 231, 31-37 (2014).
- Madete, J. K., et al. Challenges facing quantification of rat locomotion along beams of varying widths. Journal of Engineering in Medicine. 224 (11), 1257-1265 (2010).
- Neckel, N. D., Dai, H. N., Burns, M. P. A novel multidimensional analysis of rodent gait reveals the compensation strategies employed during spontaneous recovery from spinal cord and traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. , (2018).
- Valdez, S. I., et al. Modeling hind-limb kinematics using a bio-inspired algorithm with a local search. Biomedical Engineering Online. 17, (2018).
- Shah, P. K., et al. Use of quadrupedal step training to re-engage spinal interneuronal networks and improve locomotor function after spinal cord injury. Brain: A Journal of Neurology. 136 (Pt 11), 3362-3377 (2013).
- Barros Filho, T. E., Molina, A. E. Analysis of the sensitivity and reproducibility of the Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) scale in Wistar rats. Clinics (Sao Paulo). 63 (1), 103-108 (2008).
- Jacobs, B. Y., Kloefkorn, H. E., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of osteoarthritis). Currend Pain and Headache Reports. 18 (10), 456 (2014).
- Kloefkorn, H. E., et al. Automated Gait Analysis Through Hues and Areas (AGATHA): A Method to Characterize the Spatiotemporal Pattern of Rat Gait. Annals of Biomedical Engineering. 45 (3), 711-725 (2017).
- Chen, H., Du, J., Zhang, Y., Barnes, K., Jia, X. Establishing a reliable gait evaluation method for rodent studies. Journal of Neuroscience Methods. 283, 92-100 (2017).
- Zorner, B., et al. Profiling locomotor recovery: comprehensive quantification of impairments after CNS damage in rodents. Nature Methods. 7 (9), 701-708 (2010).
- Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behavioural Brain Research. 311, 340-353 (2016).
- Fiander, M. D., Chedrawe, M. A., Lamport, A. C., Akay, T., Robertson, G. S. Sagittal Plane Kinematic Gait Analysis in C57BL/6 Mice Subjected to MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
- Fiander, M. D., Stifani, N., Nichols, M., Akay, T., Robertson, G. S. Kinematic gait parameters are highly sensitive measures of motor deficits and spinal cord injury in mice subjected to experimental autoimmune encephalomyelitis. Behavioural Brain Research. 317, 95-108 (2017).
- Bhimani, A. D., et al. Functional gait analysis in a spinal contusion rat model. Neuroscience Biobehavioral Reviews. 83, 540-546 (2017).
- Courtine, G., et al. Transformation of nonfunctional spinal circuits into functional states after the loss of brain input. Nature Neuroscience. 12 (10), 1333-1167 (2009).
- Shah, P. K., et al. Unique Spatiotemporal Neuromodulation of the Lumbosacral Circuitry Shapes Locomotor Success after Spinal Cord Injury. Journal of Neurotrauma. 33 (18), 1709-1723 (2016).
- Fouad, K., Hurd, C., Magnuson, D. S. Functional testing in animal models of spinal cord injury: not as straight forward as one would think. Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 85 (2013).
- Miller, E., et al. Mechanical testing for three-dimensional motion analysis reliability. Gait & Posture. 50, 116-119 (2016).
