Summary
Aquí se presenta un protocolo para recopilar y analizar la cinemática tridimensional de la locomoción cuadrúpeda en roedores para estudios preclínicos.
Abstract
La utilidad de los sistemas de análisis de movimiento cinemático tridimensional (3D) está limitada en roedores. Parte de la razón de esta insuficiencia es el uso de algoritmos complejos y modelado matemático que acompañan a los procedimientos de recopilación y análisis de datos 3D. Este trabajo proporciona una metodología detallada simple, fácil de usar y paso a paso para el análisis de la marcha cinemática 3D durante la locomoción de la cinta de correr en ratas sanas y neuroraumáticas utilizando un sistema de captura de movimiento de seis cámaras. También se proporcionan detalles sobre 1) calibración del sistema en una configuración experimental personalizada para locomoción cuadrúpeda, 2) recopilación de datos para locomoción de la cinta de correr en ratas adultas utilizando marcadores colocados en las cuatro extremidades, 3) opciones disponibles para el seguimiento de vídeo y el procesamiento, y 4) la generación y visualización y cuantificación básica de datos en 3D mediante el software de recopilación de datos integrado. Finalmente, se sugiere que la utilidad de este sistema de captura de movimiento se expanda para estudiar una variedad de comportamientos motores antes y después del neurotrauma.
Introduction
En roedores, los déficits locomotores de las extremidades anteriores y posteriores después de los trastornos neurológicos se evalúan comúnmente utilizando sistemas subjetivos de puntuación1. Los sistemas automatizados2,3,4,5 se han adoptado para el análisis de la marcha pero sufren de desventajas, porque los resultados primarios se basan en el análisis de la huella y no capturan variables cinemáticas segmentales y articulares que de otro modo pueden revelar la verdadera cinemática de los movimientos de las extremidades2. Dado que la mayoría de los parámetros de la marcha están correlacionados, se necesita una colección de parámetros de marcha para entender las compensaciones adoptadas por las ratas para evaluar completamente los déficits motores.
En la última década, se han desarrollado varios sistemas de análisis de movimiento 3D6 para la investigación biomédica en humanos. Estos sistemas han sido exitosos y han demostrado ser eficaces en la captura de déficits en locomoción en adultos humanos sanos, así como cinemática alterada de caminar6,7. En roedores, los sistemas de movimiento cinemático 3D disponibles actualmente adoptan algoritmos complejos y modelado para el comportamiento del movimiento y utilizan sofisticadas técnicas de análisis de datos8,9,10,11 , que finalmente limitan su versatilidad. Además, los métodos utilizados para recopilar datos con la mayoría de los sistemas de captura de movimiento 3D no se explican adecuadamente en la literatura. Faltan los detalles sobre los procedimientos de recopilación y análisis de datos, las limitaciones y las técnicas implicadas en el uso eficaz del sistema.
En consecuencia, una de las nociones comunes entre los investigadores es que las evaluaciones cinemáticas de seguimiento del movimiento 3D son procedimientos bastante laboriosos y lentos que necesitan conocimientos técnicos y análisis de datos elaborados. La intención de este trabajo es desglosar los protocolos de recopilación y análisis de datos y describir la metodología a través de un proceso paso a paso para que sea objetiva, fácil de aprender y pueda abordarse sistemáticamente. Hoy en día, surge el énfasis en evaluar el comportamiento motor funcional de una manera más completa y sistemática después de las lesiones neurológicas y las intervenciones en estudios preclínicos.
En el ámbito de la locomoción cuadrúpeda, que se presenta aquí es el uso de un sistema de seguimiento de movimiento 3D que puede proporcionar información adicional como la postura del cuerpo, rotación de la pata con respecto a los ejes del cuerpo, interrelaciones de las articulaciones, y información más precisa con respecto a la coordinación, todo mientras visualiza simultáneamente todo el animal de todos los planos. Esto, a su vez, puede revelar diferencias críticas en el comportamiento motor dentro y entre ratas sanas y lesionadas a través de múltiples resultados. Con un análisis cinemático más refinado que es preciso y objetivo, se minimiza el riesgo de inferir erróneamente los efectos de una intervención. Los datos generados a partir de este software de captura de movimiento se visualizan fotograma a fotograma para la calidad del movimiento y se pueden realizar un seguimiento automático, y la recopilación o cuantificación de datos no requiere ningún algoritmo o modelado adicional. El objetivo de este trabajo es proporcionar detalles metodológicos y consideraciones involucradas en la recopilación de datos y análisis de la cinemática de la marcha 3D durante la locomoción de la cinta de correr en ratas sanas y lesionadas por la médula espinal. Este protocolo está diseñado para ser utilizado por investigadores preclínicos que utilizan modelos de ratas neurológicas en experimentos.
Protocol
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El protocolo fue aprobado por el Comité de Investigación Animal del Canciller de la Universidad Stony Brook.
1. Configuración del sistema de captura de movimiento
- Configuración
- Monte seis cámaras en la pared (o trípodes) utilizando cabezales de engranajes finamente ajustables. Coloque tres cámaras arriba a cada lado de la cinta de correr, con cada cámara en ángulo de 20o-45o por debajo del horizonte, aproximadamente a 2,0 m de la cinta de correr y aproximadamente a 0,5 m de las cámaras adyacentes para una cobertura máxima de marcadores (Figura1).
- Equipe cada cámara con una luz de anillo para la visualización de marcadores retrorreflectantes.
- Inicie el sistema de captura de movimiento.
- En Proyecto ( Project) Especificación, defina los marcadores deseados para el experimento.
NOTA: Para fines de demostración, se utiliza un total de 22 marcadores tanto para las extremidades anteriores como para las extremidades posteriores (11 marcadores en cada lado) para evaluar la locomoción cuadrúpeda bilateral. Alternativamente, la opción Importar marcador establecido con ID de marcador específico permite cálculos preestablecidos dentro del software.
- En Proyecto ( Project) Especificación, defina los marcadores deseados para el experimento.
2. Calibración del sistema de captura de movimiento
- Captura del vídeo de calibración
- Coloque el marco de calibración en forma de L (en adelante, el "marco L") ortogonalmente en la cinta de correr, con la pata larga del marco en L apuntando en la dirección de marcha de la rata (Figura 2).
- Abra el software de captura de movimiento y seleccione Grabar para capturar el vídeo de calibración.
- Mueva el marco de calibración en forma de tridente (en adelante, la "varita") por toda el área de la cinta de correr en el espacio para cubrir todas las áreas en las que la rata caminará.
NOTA: El marco L contiene cuatro marcadores que establecen el sistema de coordenadas global y la varita contiene tres marcadores que calibrarán el espacio de marcha 3D de la rata. - Grabe un mínimo de 1 minuto de material de archivo para asegurarse de que hay puntos de datos de varita adecuados para una calibración adecuada a 120 fotogramas/s.
- Guarde los vídeos como archivos de calibración 3D.
- Seguimiento de L-Frame
- Haga clic con el botón derecho en el grupo de cámaras y seleccione Seguimiento 3D. En la ventana desplegable, seleccione Vídeos de calibración 3Dy, a continuación, Todas las cámarasde calibración .
- Usando la función de punto fijo, realice un seguimiento del origen del marco L, el short de fotograma L, el medio de fotograma L y el fotograma l de largo en cada uno de los seis vídeos de calibración. Defina todos los puntos y seleccione el botón Buscar automáticamente.
NOTA: La posición del marco L debe permanecer constante en relación con la cinta de correr durante todo el experimento para evitar que el sistema de coordenadas se desplace.
- Seguimiento de la varita
- Haga clic con el botón derecho en el grupo de cámaras y seleccione Seguimiento automático de 3D-Wand.
- Seleccione todas las cámaras en la selección de cámara. En la parte inferior derecha de la ventana, seleccione Opciones, anule la selección de Detectar fotograma Ly seleccione Iniciar seguimiento.
- Después del seguimiento automático, seleccione Asignar marcadores De la varita corta, Media de vara y Varita larga para las seis cámaras.
- En la ventana de seguimiento 3D, seleccione Exportar a datos sin procesary, a continuación, seleccione la opción Sobrescribir datos de varita existentes para guardar el seguimiento.
- Seleccione Sí en la ventana que aparece después del último paso para guardar los datos más precisos.
NOTA: Este nuevo seguimiento se guardará como Seguimiento en la pestaña Seguimiento automático en la barra lateral izquierda. Se puede acceder al seguimiento guardado y editarlo más adelante.
- Cálculo de la calibración
- Haga clic con el botón derecho en Grupos de calibración de cámara y seleccione Nuevo grupo de calibración de varita.
- Seleccione Todas las cámaras y mantenga pulsada la tecla Ctrl (control) mientras selecciona Aceptar.
- Cambie la longitud de la varita a 100,00 mm, el desplazamiento del suelo del marco en L a 7,00 mm, las iteraciones para la detección de valores atípicos a 4 y permita la desviación de la longitud de la varita a 0,300.
- Cambie la cámara en la que la varita debe estar visible en la opción 4 y active lo siguiente: fijar la relación de aspecto, fijar el parámetro de sesgo y fijar el punto principal ( Tabla1).
NOTA: Estos ajustes se determinaron experimentalmente para ser óptimos para esta configuración. - Acepte calibraciones con desviación estándar de longitud de varita inferior a 3 mm y valor residual inferior a 0,004.
NOTA: Si las cámaras o el equipo asociado se mueven más allá de este punto, se requerirá que se recalibre el sistema.
3. Entrenamiento y preparación del animal para la locomoción de la cinta de correr
- Entrenamiento de ratas para la locomoción de la cinta de correr
- Aclimatar ratas a la cinta de correr durante 5 minutos antes de una sesión de entrenamiento12.
- Entrena a las ratas a caminar con peso completo en sus extremidades a 13 cm/s durante 15 min/sesión por las mañanas durante 1 semana. Entrena a todas las ratas hasta que sean capaces de caminar constantemente (mínimo de 10 escalones continuos) en la cinta de correr12.
- Completa sesiones de entrenamiento a la misma hora del día para cada rata.
- Antes de la recolección de datos, anestesiar a la rata colocando la rata en una cámara de incubación.
- Entregar gas isoflurano (1,0%-2,5%) y 0,4 L de oxígeno durante aproximadamente 5 min. Pellizque el pie de la rata para comprobar la profundidad de la anestesia.
- Proceda cuando la rata no responda al pellizco de la pata (reflejo negativo de abstinencia de la pata).
- Afeitar la rata en las regiones donde se colocarán marcadores para evitar que el pelaje interfiera con el seguimiento de marcadores (Figura1).
- Palpate la piel para que el punto de referencia óseo coloque los marcadores. Utilice marcadores de pluma para las articulaciones distales al codo y a la rodilla (Figura3).
NOTA: Los marcadores retrorreflectantes son hemisferios plásticos de 0,5 cm de diámetro cubiertos con cinta retrorreflectante. - Coloque los marcadores como desee en los puntos de referencia óseos antes de la recopilación de datos (Figura3).
NOTA: En ratas sanas y no neuroraumáticas, las ratas suelen eliminar los marcadores retrorreflectantes colocados sobre las articulaciones distales. Para fines de demostración, los marcadores retrorreflectantes se colocan sobre los puntos de referencia óseos proximales (cresta ilíaca, cadera, articulación de la rodilla para las extremidades posteriores, articulaciones de hombro y codo para la extremidad anterior), y los marcadores de pluma se utilizan para los puntos de referencia más distales. En nuestras manos, esto ha dado resultados reproducibles entre y dentro de ratas (datos inéditos).
- Palpate la piel para que el punto de referencia óseo coloque los marcadores. Utilice marcadores de pluma para las articulaciones distales al codo y a la rodilla (Figura3).
4. Captura de movimiento
- Seleccione el botón rojo de la cámara en la barra superior del software de captura de movimiento para grabar una prueba. Designe la ubicación de guardado en el equipo y seleccione Iniciar grabación para grabar a 120 fotogramas.
- Establezca una velocidad de cinta de correr definida por el usuario y permita que la rata camine durante aproximadamente 30 s, o un mínimo de 10 pasos continuos.
- Detenga la grabación y compruebe que el material de archivo contiene al menos 10 pasos continuos antes de continuar.
- Cree un nuevo grupo de cámaras para cada prueba después de guardar el vídeo grabado.
5. Seguimiento de movimiento
- Seleccione el signo " +" adyacente al grupo de cámaras guardada. Esto mostrará una lista de las seis cámaras.
- Asigne calibración 3D al archivo de la cámara
- Vaya al grupo Calibración de la cámara y haga clic con el botón derecho en Calibración calculada. Seleccione Asignar parámetros de cámara 3D. Asigne el archivo de calibración a los archivos de cámara adecuados en el grupo de cámaras guardado. Pase el cursor sobre el archivo de la cámara para verificar la calibración (se lee como válida en calibración 3D).
- Seguimiento 2D de la cámara individual
- Haga clic con el botón derecho en el grupo de cámaras para realizar el seguimiento de movimiento. Seleccione Seguimiento 2D.
- Seleccione de siete a diez mejores pasos continuos y consistentes para el seguimiento. Registre el número de fotograma en el primer contacto de la extremidad de referencia en la cinta de correr para cada paso.
NOTA: Para fines de demostración, la extremidad posterior izquierda fue seleccionada como la extremidad de referencia.
- Hay varias opciones de seguimiento disponibles.
- Haga clic con el botón derecho en el marcador de interés y seleccione Seguimientoautomático, que detectará puntos circulares brillantes creados por marcadores retrorreflectantes (Figura4).
- Alternativamente, los marcadores de seguimiento utilizando la coincidenciade patrones , que utilizará un algoritmo integrado en el software para realizar un seguimiento de los marcadores en función del tamaño y el color (Figura 4).
- Realice un seguimiento manual y corrija marcadores o errores indetectables en el seguimiento.
- Utilice marcadores negros cuando no sean posibles los marcadores retrorreflectantes de las juntas distales.
- Realice un seguimiento de los marcadores negros mediante el procesamiento avanzado de imágenes invirtiendo marcadores negros en puntos brillantes para el seguimiento automático.
NOTA: La opción Procesamiento de imágenes se puede utilizar para ayudar a realizar un seguimiento de los marcadores que son difíciles de detectar o ver. - Haga clic con el botón derecho en el vídeo de la rata en la ventana de seguimiento 2D. Seleccione Procesamiento de imágenes.
- Seleccione Vista avanzada y agregue una combinación de los cuatro filtros (brillo, contraste, gamma) para que el marcador negro sea lo más oscuro posible en comparación con su entorno. Por último, agregue Invertir y el marcador negro se convertirá en un marcador brillante que se puede rastrear automáticamente (Figura5).
- Realice un seguimiento de los marcadores negros mediante el procesamiento avanzado de imágenes invirtiendo marcadores negros en puntos brillantes para el seguimiento automático.
- Corrección de la colocación del marcador
- Realice un seguimiento manual y corrija marcadores o errores indetectables en el seguimiento.
- Para realizar un seguimiento manual del vídeo, seleccione el marcador deseado en la barra lateral derecha. Haga clic con el botón derecho y seleccione Seguimiento manual. Comience a realizar un seguimiento del marcador seleccionado en el vídeo de rata que aparece fotograma a fotograma.
- Para corregir cualquier error, vaya a la trama donde se produjo el error de seguimiento. Haga clic con el botón derecho en la pestaña de marcador específico en la barra lateral derecha y haga clic en Eliminar punto. Vuelva a realizar un seguimiento del punto manualmente en la posición exacta.
- Usando el método anterior, complete el seguimiento 2D para todas las cámaras utilizadas para todos los marcadores deseados en el rango de fotogramas de pasos continuos.
- Haga clic en Guardar durante todo el proceso de seguimiento.
6. Análisis cinemático
- Asignaciones de fase
- Haga clic con el botón derecho en Fases y seleccione Editar modelode fase .
- Personalizar las fases del ciclo de marcha para cada extremidad de acuerdo con los déficits que uno elige estudiar (por ejemplo, la adición de fases de arrastre, fases de curvatura del dedo del pie, etc.) dentro de las fases tradicionales de postura y oscilación de un ciclo de paso. Defina las fases parael experimento (figura 6).
NOTA: Para fines de demostración, aquí se muestran tres fases, y la extremidad posterior izquierda se utiliza como la extremidad de referencia para los siete a diez ciclos de marcha. - Haga clic con el botón derecho en la cámara del grupo de cámaras y seleccione Mostrar vídeo.
- Asigne fases del ciclo de marcha para cada extremidad dentro del software utilizando el botón Agregar fase o la tecla de método abreviado F11.
- Seleccione la extremidad apropiada bajo análisis y designe el primer fotograma de seguimiento como el inicio de la fase de postura.
- Progresa el video al fotograma donde termina la fase de postura y comienza la fase de oscilación. Designe este fotograma como el inicio de la fase de oscilación.
- Progresa el vídeo hasta el primer fotograma donde el pie comienza a descender. Designe este marco como el inicio de la fase de oscilaciónmedia.
NOTA: En este documento, la fase de postura de un ciclo de paso para cada extremidad se define como el primer fotograma en el que la extremidad entra en contacto con la superficie de la cinta de correr. La fase de oscilación se define como el primer fotograma en el que la extremidad sale de la superficie de la cinta de correr. La fase de oscilación media es el marco donde la extremidad alcanzó el máximo espacio libre y comienza a descender. Un ciclo de marcha completo se define desde el inicio de la postura inicial hasta la asignación de fase de postura del siguiente ciclo de marcha. - Repita estos pasos hasta que se completen las asignaciones de fases de extremidades para cada paso. Repita para las otras tres extremidades.
- Cálculos de coordenadas 3D
- Realice cálculos 3D después de rastrear las seis cámaras.
- Haga clic con el botón derecho en el grupo de cámaras y seleccione Nuevo cálculo 3D, haga clic en Todo para la selección de la cámara y, a continuación, seleccione Aceptar.
NOTA: Aparecerá una nueva carpeta. Esta carpeta contiene todos los datos de coordenadas 3D para todos los marcadores rastreados. Para ver y/o editar fases, haga clic con el botón derecho en las coordenadas 3D en la barra lateral izquierda y seleccione Editar fases (Figura 7). - Genere datos de interés, como diagramas de altura o velocidad de unión con puntos de datos arrastrando el marcador de interés para ver uno al lado del otro con las fases de marcha asignadas. (por ejemplo, cinemática articular en la Figura 8).
- Diagrama 3D
- Haga clic en Diagrama 3D para generar una figura 3D de la prueba.
- Exportar datos sin procesar haciendo clic con el botón derecho del botón derecho en Coordenadas 3D/Exportar.
- Haga clic con el botón derecho en el archivo de coordenadas 3D y seleccione Exportar.
- Abra el archivo en un software de hoja de cálculo e importe los datos en MATLAB.
- Cree un programa para crear trazados de coordinación de altura de paso de miembros.
NOTA: Los datos de coordenadas 3D se pueden exportar a softwares de análisis o scripts de macros personalizados para generar más datos, más allá de lo que ofrecen las características de software.
Representative Results
Este protocolo demuestra una metodología para la recopilación y análisis cuantitativo de datos cinemáticos 3D para la locomoción de la cinta de correr en roedores utilizando un software simple e integrado. Los resultados muestran que el protocolo es factible en la recopilación y análisis de cinemática cuadrúpeda de locomoción en ratas sanas e indoloras de la médula espinal. Los investigadores con experiencia en manejo de ratas deben colocar marcadores en ratas, luego calibrar y utilizar el sistema de captura de movimiento sin ningún problema crítico. Los datos se generan fácilmente sin el uso de algoritmos complejos.
Aquí, el protocolo se implementó en ratas sanas y de la médula espinal lesionadas (hemisección derecha C5). A los efectos de este manuscrito, solo se muestran los resultados representativos. En general, varias cinemáticas del movimiento de las articulaciones y los segmentos de las extremidades se pudieron obtener fácilmente de las coordenadas 3D de cada marcador. Las diferencias críticas entre los ciclos de marcha anormales y ciclos de marcha saludables se detectaron fácilmente con múltiples resultados, incluyendo (pero no limitado a) medidas de altura de paso, velocidad de la articulación, ángulo de articulación (Figura9), duración de la fase del ciclo de paso para las cuatro extremidades, y coordinación de extremidades (Figura10). El análisis de los datos cualitativos en forma de gráficas y diagramas de palos puede guiar la determinación de las herramientas cuantitativas utilizadas para implementar para los resultados finales de este enfoque de análisis (Figura11).
En una rata sana representativa, el perfil de ángulo de codo demostró picos lisos y únicos con ciclos de marcha adyacentes consistentes que mostraban un rango completo de movimiento (Figura9). La fase de postura alterna y las duraciones de la fase de oscilación de los rastros sugirieron una coordinación intralimba consistente. Por el contrario, el perfil de ángulo del codo de una rata herida de la médula espinal representativa demostró múltiples picos distorsionados, que eran menos consistentes y de rangos de movimiento más pequeños. Además de las alteraciones en la fase de postura alargada y las duraciones de la fase de oscilación acortada, hubo una deficiencia en la coordinación intralimba para la RFL.
En los datos representativos presentados trazados para la coordinación, se encontró que las gráficas de coordinación (Figura10) generadas a partir de ratas sanas representativas mostraban una coordinación rítmica bien definida y alterna en las extremidades ipsilaterales durante la marcha ciclos (patrón en forma de L) y patrón en forma de D en fase con extremidades contralaterales. En comparación, una rata representativa lesionada por la médula espinal (hemisección derecha C5) mostró una coordinación no alterna y no rítmica deficiente en las extremidades ipsilaterales y una coordinación rítmica alterna inusual (patrón en forma de L) en uno de los contralaterales emparejamientos de extremidades (Figura10). Dado el déficit observable en la extremidad delantera derecha en el video en movimiento grabado, esto sugiere que la RFL y lHL no pudieron soportar todo el peso sin el apoyo de LFL o RHL en un momento dado. Esta tendencia sugiere un mecanismo compensatorio para hacer frente a la velocidad de marcha forzada en una cinta de correr.
Los datos cuantificables se generaron fácilmente a partir del uso del sistema 3D, pero esto implicó acceder a pestañas separadas y seleccionar entre una multitud de opciones disponibles dentro del software. Existe un trabajo actual en el desarrollo de una plantilla automatizada que generará datos cuantitativos y cualitativos en un solo informe para los resultados más obvios de interés (sin la necesidad de generar individualmente resultados diferentes), como se hace de forma rutinaria con sistema cinemático utilizado para estudios clínicos. Por lo tanto, se pueden compilar y exportar varios puntos de conexión en un formato de informe que se puede visualizar fácilmente inmediatamente después de una prueba.
Figura 1 : Configuración experimental. (A) Esquema de una configuración de recopilación de datos cinemáticas de seis cámaras para una tarea de caminar de la cinta de correr. Un conjunto de tres cámaras se coloca a ambos lados de la cinta de correr para capturar (fotograma a fotograma) movimientos de marcador izquierdo y derecho durante la locomoción. (B) Diagrama que representa la colocación de marcadores sobre puntos de referencia óseos en las extremidades anteriores y posteriores del roedor para capturar la cinemática de locomoción cuadrúpeda. Se coloca un total de 11 marcadores a cada lado de la rata. Las regiones sombreadas muestran el área donde se asemplan a la rata. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Marcadores para calibración. (A) Asignaciones de conjunto de marcadores para el sistema de calibración de varitas, utilizando dos marcos de calibración: L-Frame y wand (B) El sistema de coordenadas se define mediante el L-Frame, donde el origen del marco L (intersección de dos patas del marco) se define como (0,0). Las dos extremidades del L-Frame, L-Frame short y L-Frame long definen los ejes X e Y, respectivamente, y el eje z se define como perpendicular al plano XY. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Tipos de marcadores. (A) Fotografía del tronco inferior de la rata que muestra los dos tipos de marcadores utilizados. (B) La fotografía muestra un marcador retrorreflectante colocado en la cresta ilíaca con cinta adhesiva de doble cara que está diseñada para adherirse a la piel (roja circular). (C) La fotografía demuestra la colocación de un marcador de pluma sobre la articulación metatarsofalángica derecha (rojo en círculo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Seguimiento de movimiento. (A) Imagen muestra la interfaz de seguimiento de movimiento donde se pueden rastrear varios marcadores simultáneamente utilizando las funciones "Track automatically" y "Track using pattern matching". (B) La vista ampliada de un marcador retrorreflectante se detecta como un punto circular blanco brillante en la función "Seguimiento automáticamente" durante la asignación del marcador. El software reconoce este punto como un punto circular azul brillante. El punto rojo se reconoce finalmente como el centro del marcador prescrito. Una mancha roja centrada dentro del marcador circular disminuye las posibilidades de errores experimentales durante el seguimiento de datos. La desviación del centro sugiere que es probable que las mediciones y análisis posteriores sean inexactas. (C) Vista ampliada de un marcador retroreflectivo seleccionado para la coincidencia de patrones. En función del tamaño, la forma y el color del marcador seleccionado, el software identifica automáticamente los marcadores que coinciden con la descripción en los fotogramas de vídeo posteriores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Opciones de seguimiento básicas y avanzadas. (A) Los vídeos se pueden procesar dentro del software haciendo clic con el botón derecho en el vídeo durante el análisis para que los marcadores poco claros o borrosos se visualicen claramente para permitir el seguimiento automático. Para fines de demostración, se muestran dos tipos de ajustes de procesamiento de imágenes que se ajustan para adaptarse a diferentes condiciones de iluminación ambiental durante la recopilación de datos para facilitar el seguimiento. (B) Un fotograma de vídeo representativo antes del procesamiento de imágenes. (C) Para el procesamiento básico de imágenes (tipo de procesamiento I), los ajustes de brillo y contraste se ajustan para obtener una vista más clara. (D) Utilizando la configuración avanzada de procesamiento de imágenes (tipo de procesamiento II), el marcador de unión metatarsofalange (marcador negro) derecho se invierte y, a continuación, se puede realizar un seguimiento automático. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Asignaciones de fase. El ciclo de gait para cada extremidad se puede dividir en fases discretas de acuerdo con el diseño experimental. Para fines de demostración, se muestran tres fases del ciclo de marcha. (A) La fase de postura se define como el primer fotograma en el que la extremidad entra en contacto con la superficie de la cinta de correr. (B) La fase de oscilación se define como el primer fotograma en el que la extremidad sale de la superficie de la cinta de correr (C) La fase de oscilación media es el primer fotograma después del espacio entre las extremidades donde la pata comienza a descender. En (D), se define un ciclo de marcha completo desde el inicio de la postura inicial hasta la asignación de fase de postura del siguiente ciclo de marcha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 : Opciones avanzadas para el análisis de fase de paso. Esta opción permite una vista en profundidad del seguimiento y las asignaciones de fase, así como la capacidad de modificar las asignaciones de fase. (A) Cuadro de selección marcador para ver y seleccionar el marcador deseado. (B) Ventana de selección de coordenadas: al resaltar la coordenada de interés (en este caso, las coordenadas z) se mostrará como rojo en la ventana principal del diagrama. (C) Ventana de selección de fase:las fases asignadas para una extremidad se pueden ver con respecto a los marcadores y coordenadas seleccionados en (A) y (B). Las fases también se pueden editar a través de esta ventana. (D) Ventana diagrama: las coordenadas de un marcador específico se pueden comparar simultáneamente durante las fases individuales del ciclo de marcha. El verde y el amarillo representan las fases de postura y oscilación respectivamente para la extremidad posterior derecha durante la locomoción cuadrúpeda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8 : Muestra de datos cinemáticos 3D. (A) Varios resultados de cada marcador de unión se pueden visualizar pictóricamente desde el conjunto de datos de coordenadas 3D después del seguimiento de vídeo (B) Datos representativos generados para los ciclos de fase de postura y oscilación para cada extremidad delantera y posterior durante cada extremidad anterior y posterior durante cuadrúpedos caminando en una rata. Los colores representan fases de postura y oscilación de ciclos de pasos consecutivos. El rojo y el verde corresponden a las fases de posición de las extremidades anteriores y traseras derechas, respectivamente. El azul y el azul corresponden a las fases de postura de la extremidad delantera izquierda y de las extremidades posteriores, respectivamente. El amarillo corresponde a la fase de oscilación de cada extremidad. (C) Múltiples grupos de datos (marcadores o resultados discretos) se pueden comparar simultáneamente con facilidad. Los datos de velocidad de coordenadas z de los marcadores de la articulación de la rodilla izquierda y derecha se seleccionan arbitrariamente para demostrar la velocidad vertical del marcador de la articulación de la rodilla desde la superficie de la cinta de correr. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9 : Datos representativos de cinemática angular de ratas sanas y cervicales lesionadas por la médula espinal durante la locomoción de la cinta de correr. (A) El perfil de ángulo de unión de codo en una rata representativa sana muestra picos suaves y únicos de trazas de ángulo de unión con ciclos de marcha adyacentes consistentes que muestran un rango completo de movimiento. Las barras rojas y amarillas denotan las fases de postura y oscilación, respectivamente, del ciclo de pasos de la extremidad delantera. (B) Por el contrario, las trazas de una rata herida representativa de la médula espinal están relativamente más distorsionadas y muestran picos múltiples inconsistentes con un rango general más pequeño de movimiento articular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10 : Datos representativos de coordinación de las extremidades de una rata malherida de la médula espinal sano y cervical durante la locomoción de la cinta de correr. (A) Los valores de la coordenada z de los marcadores metacarpofalángica (MCP) y metatarsofalánico (MTP) que representan las medidas de altura de los pasos se trazan en seis combinaciones diferentes entre las extremidades de aproximadamente 10 pasos durante la caminata cuadrúpeca. Se muestran demostraciones representativas de los seis posibles pares de coordinación de extremidades. (B) Una rata sana muestra una coordinación rítmica alterna clara (patrón en forma de L) para todos los pares (i, ii, iii, iv). Cuando las extremidades están en fase (v, vi), los pares de coordinación siguen un patrón en forma de D. (C) En una rata lesionada de la médula espinal cervical, tenga en cuenta i) la mala coordinación entre las dos extremidades anteriores, (iii) emparejamiento ipsilateral derecho y (iv) coordinación inusual para uno de los pares de extremidades contralaterales. Tenga en cuenta que las gráficas de coordinación (B,C) no comparten la misma escala. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11 : Figura de palo 3Danimado. Ejemplo de una figura de stick 3D generada a partir de datos rastreados. Haga clic aquí para descargar esta figura.
| Parámetro de calibración | Entradas de calibración |
| Longitud de la varita [mm] | 100 |
| Desplazamiento del suelo del marco L [mm] | 7 |
| Iteraciones para la detección de valores atípicos | 4 |
| Desviación permitida de la longitud de la varita | 0.3 |
| La varita debe ser visible en al menos __ cámaras | 4 |
| Corregir la relación de aspecto | Comprobado |
| Corregir el parámetro de sesgo | Comprobado |
| Fijar punto principal | Comprobado |
Tabla 1: Ajustes avanzados para la calibración. La tabla resume los parámetros que utilizamos para calibrar con precisión la configuración de seis cámaras. Estos ajustes se probaron experimentalmente y se encontraron óptimos para nuestra configuración.
Discussion
Este artículo de protocolo demuestra el uso de un sistema de seguimiento de movimiento para la recopilación y análisis de datos cinemáticos 3D durante la locomoción cuadrúpeda de la cinta de correr en roedores. Las características importantes del sistema de análisis de movimiento cinemático 3D incluyen la cuantificación detallada de la cinemática del movimiento articular (cinemática de fase de paso, ángulos de articulación, rango de movimiento, velocidades de paso) de múltiples articulaciones y extremidades simultáneamente, detección de déficits motores inconmensurables a simple vista, eliminación de sesgo subjetivo en la recopilación y análisis de datos, y fácil visualización de toda la extremidad y cinemática postural que se puede comparar con la yuxtaposición simultánea de toda la rata en movimiento. Sin necesidad de algoritmos y modelado añadidos, los métodos muestran la capacidad del software para analizar cuantitativamente la cinemática de la marcha con gran detalle, eficiencia, facilidad, precisión y reproducibilidad.
En roedores, los déficits locomotores de las extremidades anteriores y posteriores después de una lesión de la médula espinal (SCI) se evalúan comúnmente utilizando sistemas de puntuación locomotora subjetivos y estandarizados, como el sistema de puntuación BBB1. Los sistemas subjetivos de puntuación generalmente introducen sesgo del probador porque diferentes investigadores pueden asignar diferentes puntuaciones para el mismo déficit motor o la misma puntuación para diferentes déficits motores, lo que resulta en una menor reproducibilidad y sensibilidad de la prueba13 . Además, la incapacidad de detectar déficits sutiles conlleva el riesgo de inferir erróneamente los efectos de una intervención.
Para combatir estos problemas,algunos investigadores han adoptado sistemas automatizados 2,3,4,5 y sistemas con o sin el uso de algoritmos complejos14,15. Estas pruebas realizan análisis de ciclo de paso que revelan perfiles de rodamientos de peso y patrones de secuencia de pasos derivados de los movimientos de colocación de la pata de las ratas que caminan a través de una pista. Sin embargo, una desventaja importante del análisis de marcha de vídeo planoventral es que el cuerpo del sujeto en sí no es directamente visible 2,3. Estos datos se limitan a la información obtenida a partir de impresiones de los movimientos de pies y patas, cuestionando la selección e interpretación de los parámetros de la marcha en la evaluación de los déficits (véase Chen et al.16). Los detalles del movimiento que revelan la cinemática segmental dinámica del movimiento y posicionamiento de las extremidades no se pueden obtener con precisión para el análisis de locomoción3,5. Las desviaciones críticas de los datos del ángulo de las articulaciones (es decir, el rango de movimientos, la velocidad de los movimientos, etc.), la relación de las articulaciones entre sí dentro de una extremidad y entre las extremidades, y la mecánica subyacente del cuerpo que alteran los patrones de marcha son imposibles de obtener. Como tal, si cualquier deterioro observable de la marcha es resultante de alteraciones en movimientos articulares segmentarios individuales y/o múltiples (es decir, coordinación intralimba proximal-distal, relaciones posturales del tronco con respecto a la posición y el ciclo de marcha de las extremidades, etc.) permanecer enmascarado.
Pocos sistemas actualmente disponibles capturan la cinemática de la marcha y evalúan la disfunción motora cualitativa y cuantitativamente, pero son menos ampliamente utilizados. Un sistema de análisis de marcha de seguimiento de vídeo de alta velocidad de cuerpo completo filma ciclos de marcha espontáneos desde tres lados (uno ventral y dos planos laterales) y realiza un seguimiento de los puntos de referencia óseos para generar una serie de resultados de marcha17,18. Algunos investigadores emplean el análisis cinemático del plano sagital para obtenerdatos de movimiento 2D de la extremidad posterior 19,20. Sin embargo, una tercera dimensión de movimiento que se produce ortogonal al plano de visión (lateral o sagital) es indetectable en los análisis11,18,19.
Otros sistemas de recopilación de datos posturales de cuerpo de roedores 3D más sofisticados, 3D, segmento del cuerpo, utilizan modelado matemático 3D de la recopilación de datos, así como un sistema de análisis para rastrear y cuantificar el movimiento 3D de los segmentos del cuerpo del roedor, al tiempo que incluye la cabeza patrones de movimiento8. 9 han desarrollado un sistema de captura de movimiento optoelectrónico basado en marcadores para cuantificar la cinemática postural del cuerpo 3D durante la locomoción terrestre en los haces de marcha utilizando un sistema de siete cámaras. Los principales resultados estudiados en estos dos últimos trabajos se centran principalmente en la postura general del roedor en lugar del análisis de la marcha. Los sistemas de captura de movimiento 3D proporcionan datos de marcha cinemática 3D de alto rendimiento utilizando múltiples cámaras y sistemas de software elaborados, revisados por Bhimani et al.21. Las versiones más antiguas del sistema de análisis de movimiento 3D presentado también se han utilizado en trabajos anteriores en ratas con y sin neurotrauma12,22,23.
A pesar de la disponibilidad de sistemas de recopilación y análisis de movimiento 3D para la investigación, el uso preclínico de esta técnica en roedores sigue siendo relativamente limitado. Parte de la razón de este problema es que los protocolos de recopilación y análisis de datos dependen en gran medida del uso de la construcción de modelos cinemáticos y algoritmos complicados que se ajustan a un modelo cinemático de la extremidad posterior de la rata durante la marcha para generar una multa de alta resolución cinemática de la marcha8,9,11,22. La metodología detallada presentada aquí proporciona detalles del procedimiento involucrado a lo largo del proceso experimental, incluyendo la manipulación de animales, entrenamiento, configuración experimental, recopilación de datos y pasos de análisis.
También se proporcionan detalles sobre la calibración del sistema, que es la parte fundamental del protocolo, que asegurará la reproducibilidad entre los ensayos adyacentes dentro y entre los sujetos. Las técnicas paso a paso descritas introducen objetividad en el procedimiento de recopilación de datos y lo hacen altamente reproducible. Los datos generados a partir de este software de captura de movimiento se pueden visualizar fotograma a fotograma para obtener calidad de movimiento y realizar un seguimiento automático. Más detalladamente se describe cómo esta recopilación o cuantificación de datos no requiere ningún algoritmo o modelado adicional. Los estudiantes, el personal y los investigadores pueden utilizar software estadístico simple para generar resultados cinemáticos básicos sin depender de conocimientos técnicos específicos.
Este sistema también se puede utilizar para la locomoción sobremolida, alcance y agarre, y otras configuraciones experimentales para adaptarse a la meta experimental. El número y el tipo de marcadores también se pueden ajustar para la cola, la espalda, el tronco o las orejas, según sea necesario. Una ventaja más grande del software presentado en comparación con los sistemas es su capacidad para recopilar datos de vídeo de alta resolución del sujeto. Como tal, conjuntos complejos de cálculos (es decir, movimientos angulares, líneas de palo que conectan múltiples uniones, etc.) se pueden superponer al vídeo grabado. La colocación del marcador y los datos 3D generados se pueden verificar con los movimientos reales de una rata en movimiento. Por el contrario, con el otro sistema de captura de movimiento 3D, solo se capturan los marcadores y se debe realizar cualquier reanálisis en los diagramas de palo (marco esquelético) en lugar del vídeo del sujeto real. Por lo tanto, falta la verificación de la colocación del marcador en el movimiento real del sujeto.
Basándose en la experiencia con este sistema, la calibración desempeña un papel crucial en el éxito de la recopilación de datos. La calibración del sistema es muy sensible al cambio. y un ligero movimiento de cualquier cámara puede comprometer todo el proceso de recopilación y análisis de datos de coordenadas 3D. Solo se requieren dos cámaras a cada lado de un plano de visualización para la recopilación de datos, pero la tercera cámara es muy recomendable para proporcionar más precisión al hacer referencia cruzada a las ubicaciones de cada marcador con otras cámaras. A medida que aumenta el número de cámaras de seguimiento, la precisión de la coordenada 3D para un marcador específico también aumentará. Durante las ocasiones en las que los marcadores se oscurecen debido a los déficits de la marcha (como el enroscarse de los dedos de los dedos del pie o arrastrar en el caso de la marcha después del neurotrauma), estas condiciones pueden requerir un seguimiento manual extenso. Sin embargo, la cantidad de datos generados finalmente a partir del seguimiento es digna del tiempo invertido en el seguimiento manual de los marcadores, por lo que es una herramienta invaluable en la detección de déficits motores sutiles.
En nuestra experiencia, cualquier tediosidad asociada con el uso del sistema está más allá del uso del equipo y la tecnología en sí. Al igual que otros protocolos para la evaluación de los comportamientos motores, el método con el que las ratas son manejadas y entrenadas para la tarea afecta en gran medida los resultados. Por ejemplo, aislar ratas de su cohorte es fundamental durante las pruebas; de lo contrario, las ratas que no son probadas pero que todavía están presentes durante las pruebas muestran un eventual deterioro del rendimiento de la tarea. Las temperaturas ambiente óptimas, la iluminación y los niveles de ruido son otros determinantes. Fouad y otros publicaron otros desafíos que acompañan a las pruebas de motor funcional en ratas24. De hecho, los usuarios cegados de este laboratorio que siguieron la metodología correctamente no experimentaron ningún obstáculo importante con la recopilación de datos, el seguimiento de movimiento y el análisis de datos.
En este artículo, se describe un sistema de captura de movimiento 3D para recopilar y analizar datos locomotor de manera efectiva para que los investigadores puedan recopilar enormes cantidades de datos locomotores en profundidad rápidamente de varias ratas. Actualmente estamos trabajando en la creación de una plantilla de análisis de datos automatizado que se puede integrar en el software y llegar a ser capaz de generar un informe de resultados predeterminados en pocos segundos para la locomoción de la cinta de correr en roedores, similar a lo que se hace en humanos estudios utilizando sistemas de captura y análisis de movimiento6,25. El desarrollo de esta plantilla permitirá a los investigadores preclínicos obtener datos detallados de locomotor de roedores a conveniencia de unos pocos clics de un botón del ratón. Se espera que los métodos proporcionados en este trabajo resulten útiles para los investigadores preclínicos para evaluar el comportamiento motor de los roedores de manera más objetiva. Ahora estamos delicadiendo el uso de este sistema para recopilar datos cinemáticos 3D de alto rendimiento durante comportamientos comunes y hábiles de las extremidades anteriores, como llegar y agarrar. Es importante destacar que la utilidad de este método se puede ampliar a ratas con una variedad de lesiones neurotratraumáticas y no neurotramáticas.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nuestro agradecimiento especial a Pawan Sharma por su ayuda con la configuración experimental para el vídeo y la contribución intelectual a este proyecto. Agradecemos también a Christopher Palacio su contribución en la asistencia para la demostración del protocolo de vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 camera Basler (Scout scA640-120gu) motion capture system. | Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germany | N/A | Recording device for motion analytics. |
| Calibration Frame and Wand | Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germany | N/A | L-shaped calibration defining the global coordinate sysetem, and the trident shape wand (100 mm) |
| Markers | Shah Lab | N/A | Recording device for motion analytics. Markers are Custom made in our lab from 0.5cm googly-eyes covered with reflective tape. |
| Matlab | Mathworks, Inc, Natic, Ca | N/A | Data analysis software |
| Rodent Cage | Custom Made within Stony Brook. | N/A | Clear plexiglass cage used to keep the rodent on the treadmill. |
| Simi Reality Motion Systems | Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germany | N/A | 3D tracking Software. |
| Treadmill | Mk Automation Inc., Bloomfield, CT 06002 | N/A | Treadmill used for rodent locomotion. |
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