Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Биопсия и витрификация человека

doi: 10.3791/59625 Published: July 26, 2019

Summary

Для эффективного проведения предимплантационного генетического тестирования требуется карангоцистая биопсия и витрификация. Подход, предусматривающий последовательное открытие zona pellucida и извлечение 7-8 трофектодермных клеток в день 5-7 после оплодотворения, ограничивает как количество необходимых манипуляций, так и воздействие эмбриона на неоптимальные условия окружающей среды.

Abstract

Биопсия Blastocyst выполняется для получения надежной генетической диагностики во время циклов ЭКО с предимплантационным генетическим тестированием. Затем идеальный рабочий процесс влечет за собой безопасный и эффективный протокол витрификации, в связи с временем поворота диагностических методов и переноса выбранного эмбриона (ы) на физиологический эндометрий в следующем естественном цикле. Подход к биопсии, охватывающий последовательное открытие zona pellucida и извлечение 5-10 трофектодермных клеток (в идеале 7-8), ограничивает как количество необходимых манипуляций, так и воздействие эмбриона на неоптимальные условия окружающей среды. После надлежащей подготовки, техника была воспроизводима между различными операторами с точки зрения сроков биопсии (8 мин, в диапазоне 3-22 мин в зависимости от количества эмбрионов к биопсии на блюдо), убедительные диагнозы, полученные (97,5%) и живой коэффициент рождаемости после vitrified-разогретый euploid blastocyst передачи (Зgt;40%). Выживаемость после биопсии, витрификации и потепления составила 99,8%. Скорость повторного расширения на 1,5 ч от потепления была выше, чем 97%, в значительной степени зависит от сроков между биопсией и витрификации (в идеале 30 мин), бластоцист морфологического качества и день биопсии. В общем, лучше vitrify рухнул бластоцист; поэтому в циклах, не связанных с PGT, может быть выполнена лазерная искусственная усадка, чтобы вызвать коллапс эмбриона до криоконсервации. Наиболее перспективной перспективой будущего является неинвазивный анализ средств массовой информации культуры ЭКО после бластоциста культуры в качестве предположительного источника эмбриональной ДНК. Однако этот потенциальный авангард все еще находится в стадии расследования, и еще предстоит определить и утвердить надежный протокол.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Основной целью современной эмбриологии человека является максимизация числа живорождений на стимулируемый цикл и сокращение затрат, времени и усилий для достижения беременности. Для достижения этой цели должны быть использованы проверенные подходы к отбору эмбрионов для выявления репродуктивно компетентных эмбрионов в когорте, полученных в ходе цикла ЭКО. Согласно последним данным, бластоцист культура1 в сочетании с комплексным хромосомным тестированием и витрифицированной теплой euploid переносэмбриона эмбриона (ET) является наиболее эффективной основой для повышения эффективности ЭКО2. Очевидно, что тестирование анеуплоидии требует эмбрионального образца, который в настоящее время в основном представлен из нескольких клеток, извлеченных из трофектодерма (TE), т.е. раздела бластоциста, который дает происхождение эмбриона приложения (например, плацента) во время беременности . Помимо анализа кариотипа, также мутации одного гена могут быть оценены из биопсии Т как часть клинической стратегии, известной как предимплантационное генетическое тестирование (PGT; -A для анеуплоидий, -SR для структурных хромосомных перестановок, -M для моногенных заболеваний). Другие методы биопсии яйцеклеток/эмбрионов были теоретизированы и приняты клинически на протяжении последних десятилетий, а именно биопсия полярных тел и биопсия бластомеров. Однако их использование в настоящее время сокращается, поскольку их процедурные недостатки (например, более высокая рабочая нагрузка и риск для репродуктивного воздействия) и диагностические ограничения (например, вопросы анализа одной ячейки) неявно препятствуют достаточному балансу между издержками, рисками и льготы (для обзора см.3).

В этой работе один из основных протоколов биопсии TE тщательно описан вместе с последующими процедурами витрификации, нагревания и передачи. Рабочий процесс здесь изложены идеально подходит для занят PGT единицы.

Как уже описано ранее нашей группой4,5, процедура включает в себя последовательное открытие zona pellucida полностью расширенных бластоцистых и удаление нескольких тЭцклеток (в среднем 7-8). По сравнению с днем 3 лазерной помощи штрихучийметод биопсии 6, эта процедура может облегчить ежедневный график ЭКО единицы, где деликатные процедуры, такие как бластоциста биопсии и витрификации, должны быть своевременно выполнены. Как только бластоцист достигает своего полного расширения, биопсия может быть проведена путем выбора т.д. клеток для удаления, тем самым предотвращая риск грыжи внутренней клеточной массы (ICM), что в противном случае сделать процедуру сложной. В литературе, третий протокол бластоциста биопсии также был описан, который включает в себя лазерной помощи штриховки осуществляется после эмбриона уже достигли стадии бластоциста, за несколько часов до процедуры5,7. Однако этот подход занимает больше времени и в основном подходит для единиц ЭКО, которые внедряют биопсию TE в руках малоопытных операторов и с учетом умеренно-низкой ежедневной рабочей нагрузки.

Интрацитоплазматическая инъекция спермы (ICSI)8 должна быть консолидированной техникой, если она направлена на проведение генетического анализа при ЭКО. Аналогичным образом, надлежащая система культуры для безопасного сбора эмбрионов до стадии бластоциста имеет решающее значение для осуществления стратегии биопсии TE. Достаточное количество инкубаторов, а также использование низкого уровня кислородного напряжения являются ключевыми предпосылками для этого, чтобы не скомпрометировать бластоциста скорость9. В то же время, эффективная программа криоконсервации необходима для безопасного управления циклом PGT. В последнее десятилетие, внедрение витрификации увеличила эмбрион крио-выживаемости даже до йgt;99%10,11. Это обеспечило достаточно времени для выполнения генетического тестирования и отложить перенос эмбриона на следующий менструальный цикл, на нестимулируемый и, вероятно, более восприимчивый эндометрий12.

Биопсия TE и витрификация требуют выполнения задач, требующих строгих навыков, и их эффективность может варьироваться в зависимости от неопытных операторов. Поэтому проводится специальный учебный период, прежде чем позволять каждому оператору проводить эти процедуры клинически; кроме того, необходимо периодически оценивать повышение квалификации операторов путем мониторинга ключевых показателей эффективности (КПИ) для процедур криоконсервации и биопсии. Каждая клиника ЭКО должна установить внутренние KPI для этой цели, которые должны приблизитьте те, опубликованные международными консорциумами и / или результаты, опубликованные справочными лабораториями.

TE биопсии, витрификации потепления и свидетельские процедуры являются проверенными методами в нашем подразделении, которые были стандартизированы во всех операторов, участвующих, как сообщалось в трех предыдущих публикациях11,13,14 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Протокол для биопсии бластоциста человека, описанный здесь, следует руководящим принципам G.EN.E.R.A. Комитет по этике человеческих исследований.

ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице материалов для необходимых материалов. Дополнительный необходимый материал включает в себя лабораторную обувь и снаряжение, хирургическую маску, крышку для волос, хирургические перчатки, постоянный нетоксичный маркер, щипцы и дезинфицирующее средство. Использование хирургического платья, одноразовых хирургических перчаток, маски для лица, покрытия для волос является обязательным для предотвращения риска заражения. Все рабочие зоны, а также оборудование, участвующее в процессе, должны быть тщательно очищены лабораторным дезинфицирующим средством (например, Oosafe) перед началом любой процедуры. Все расходные материалы и используемые средства массовой информации должны быть стерильными и индивидуально упакованы или алицитированы. Предлагается использовать специальную рабочую станцию для биопсии и труб и ограничить доступ области только к операторам, участвующим в процедуре (эмбриолог и свидетель).

1. Подготовка за день до процедуры биопсии

  1. Подготовка пост биопсии культуры блюдо.
    1. Поместите 6 капель 20 -Л ЭКО культуры среды (Таблица материалов) в IVF культуры блюдо и наложения с 6 мл предварительно разогретого минерального масла для эмбриона культуры (Таблица материалов).
    2. Добавьте еще 10 кЛ среды культуры ЭКО к каждой капле. Инкубировать ночь при 37 градусах Цельсияв контролируемой атмосфере (5% O 2, 6% CO2).
  2. Приготовьте 4-хорошую тарелку ЭКО для промывки бластоциста после биопсии.
    1. Поместите 600 л среды культуры ЭКО в первые две скважины и наложение с 300 л предварительно разогретого минерального масла для эмбриональной культуры.
    2. Инкубировать ночь при 37 градусах Цельсияв контролируемой атмосфере (5% O 2, 6% CO2).
  3. Распределите 1,5 л погрузочного раствора(Таблицаматериалов) в каждой трубке ПЦР, которая будет использоваться для трубтт ТЭ, вращайте его и держите при 4 градусах Цельсия.

2. Подготовка в День процедуры биопсии

  1. Приготовьте блюдо из биопсии.
    1. Поместите 3 капли из 10-хЛ HEPES-буферизированной среды (дополненный человеческим сывороточным альбумином)(Таблица Материалов) в ряд в блюдо культуры ЭКО.
    2. Повторите шаг 1.1.1 в зависимости от количества доступных бластоцистых (до 4 бластоцистых на блюдо) и наложения с 6 мл предварительно разогретого минерального масла для эмбриональной культуры.
    3. Инкубировать блюдо при 37 градусах По Цельсию, по крайней мере 1 ч, прежде чем выполнять процедуру биопсии.

3. Blastocyst Отбор и оценка

  1. Оценка бластоциста в соответствии с его расширением и морфологическим появлением ICM и TE(рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ:
    Критерии классификации были адаптированы из Gardner и Schoolcraft15 и ранее описаны Capalbo et al. и Cimadomo et al.4,11.
    1. Определите размер и класс расширения как: Для полностью вылупившихся бластоциста, B для вылупления бластоциста, C для полностью расширенного бластоциста, и D для не расширенного бластоциста (эти эмбрионы биопсифицируются только в том случае, если они не расширяются дальше до дня 7).
    2. Определите класс ICM: 1 для заметного ICM с несколькими строго упакованными ячейками; 2 для различимых с несколькими, но примерно упакованными клетками; 3 для трудно различить с очень немногими низкокачественными клетками.
    3. Определите TE класс следующим образом: 1 для хорошо организованного эпителия с несколькими клетками; 2 для свободного эпителия с несколькими клетками; 3 для нескольких и/или больших некачественных ячеек.

4. Биопсия Трофиктодерма

  1. Выполните биопсию TE на всех жизнеспособных полностью расширенных бластоцистых (желательно c класса для размера и расширения).
  2. Установите удерживающие и биопсиальные пипетки для каждой процедуры биопсии. Рекомендации для биопсии пипетка следующие: 30 мкм внутреннего диаметра, 35 "угол наклона, 0,75 мм расстояние кончик согнуть.
  3. Пометьте блюдо биопсии с деталями пациента (имя и фамилия женщины, дата рождения и ID), а затем номер каждой капли с эмбриона и цикла идентификаторов. Используйте постоянный нетоксичный маркер.
  4. Перенесите бластоцист с 300 мкм зачистки пипетки на первую каплю биопсии блюдо и промыть его для того, чтобы удалить избыток культуры среды. Затем переместите бластоцист во вторую каплю блюда из биопсии.
  5. Переместите блюдо в перевернутый микроскоп и премьер биопсии пипетка успокоительной некоторых средств от третьей капли биопсии блюдо.
  6. На 20-кратное увеличение, сориентировать бластоциста, чтобы иметь четкое представление о ICM. Когда он визуализирован в 7 часов (напротив области, которая будет направлена на удаление т.д. клеток), закрепите эмбрион на удерживающих пипетке(рисунок 2a).
  7. Сосредоточьтесь на zona pellucida и удостоверьтесь, что и пипетки, и бластоцист находятся в одной координационной плоскости.
  8. Переключитесь на лазерную цель (время пульса 0,3 мс, 6,5 мкм) и расположите лазерную указку на zona pellucida на противоположной стороне ICM. Просверлите zona pellucida через лазерные импульсы 2х3(рисунок 2b).
  9. Аккуратно нажмите биопсии пипетка против zona pellucida и удар некоторые среды через нарушение, чтобы отделить клетки TE от его внутренней поверхности и ускорить крах бластоциста (Рисунок 2c).
  10. После того, как TE отделена(Рисунок 2d), введите через отверстие (при необходимости, сделать его шире с последним лазерным импульсом) и aspirate несколько клеток TE (в идеале 7'813,16) в биопсии пипетка с нежным всасыванием (Рисунок 2e).
  11. Слегка переместите биопсию пипетку назад при применении умеренного всасывания, чтобы растянуть целевые клетки(рисунок 2f).
  12. Направьте лазер к самой тонкой части аспирированных клеток и огонь 2'5 лазерных импульсов на стыках между клетками, чтобы отделить клетки-мишени от тела эмбриона (Рисунок 2g). Сроки лазерных импульсов и количество импульсов могут быть скорректированы в зависимости от качества бластоциста; однако, постарайтесь свести их к минимуму, чтобы избежать клеточного лиза.
  13. После отделения TE фрагмент от бластоциста(Рисунок 2h),выпустить его в тот же биопсии падение далеко от бластоциста. Это необходимо, чтобы предотвратить их от всасывается снова в биопсии пипетка (Рисунок 2i).
  14. Отпустите бластоциста из удерживающей пипетки и быстро поднимите обе пипетки, чтобы фрагмент не прилип к ним.
  15. Сфотографировать биопсии фрагмент для целей контроля качества(рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если больше, чем один бластоцист должен быть биопсии в процедуре (до четырех на биопсию блюдо), изменить биопсии пипетка с новым для предотвращения перекрестного загрязнения между эмбрионами.
  16. Повторите шаги 4.1-4.13.
  17. Переместите блюдо из биопсии обратно в ламинарный капот потока.
  18. Этикетка пост-биопсии культуры блюдо с парой ID, и каждая капля с эмбрионом и цикл ID.
  19. В присутствии свидетеля, промыть бластоциста в чистой среде ЭКО, и, наконец, переместить его к его соответствующей капли пост-биопсии блюдо.
  20. Переместите постбиопсии блюдо в инкубатор в контролируемой атмосфере(37 градусов по Цельсию, 6% CO 2, 5% O2) до витрификации. Рекомендуется выполнять витрификации в течение 30 минут от процедуры биопсии, чтобы предотвратить бластоцист повторного расширения.

5. Тюбинг

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура должна проводиться в присутствии свидетеля и внутри ламинарного капота при комнатной температуре. Во время процедуры держите трубки ПЦР в стойке холодной трубки на льду(дополнительная рисунок 1).

  1. Пометьте трубки ПЦР постоянным нетоксичным маркером.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка должна осуществляться по требованию генетической лаборатории. Как правило, имя и фамилия пациента (инициалы), пара ID, эмбрион а также идентификатор цикла (например: JD 12345 1.2 для эмбриона N.1 2-го цикла, принадлежащего Джейн Доу, чья пара ID составляет 12345). Идентификатор эмбриона должен быть сообщен также буквами на теле трубки.
  2. Пометьте крышку 60 мм х 15 мм культуры блюдо (труба блюдо) с биопсии эмбрионов идентипов (Дополнительныйрисунок 1) и подготовить две 10 капель биопсии стирального раствора (Таблица материалов) в нем.
  3. Прайм 140 мкм зачистки пипетка(Дополнительный Рисунок 1) с некоторыми биопсии стиральный раствор из второй капли трубки блюдо.
  4. Поместите блюдо биопсии под стереомикроскоп, чтобы легко визуализировать фрагмент TE (ы).
  5. Аккуратно выпустите немного раствора для мытья биопсии на фрагмент TE; затем, загрузить его в зачистки пипетка.
  6. Переместите фрагмент TE на вторую каплю раствора для мытья биопсии в трубке и тщательно промойте его 2–3 раза.
  7. Перенесите фрагмент TE на дно трубки ПЦР (ранее помеченной после нее) с помощью погрузочного раствора, уделяя внимание, чтобы не касаться его стен с кончиком зачистки пипетки.
  8. Повторите процедуру от шага 5.3 до шага 5.7 для каждого фрагмента TE, обращая внимание использовать новый капилляр для каждого фрагмента TE.
  9. В конце процедуры труб, положить все ПЦР трубки в мини-центрифуги, и спина их в течение нескольких секунд.
  10. Храните образцы при -20 градусов до отгрузки их в родящееся генетическую лабораторию для тестирования.

6. Бластоцист Витрификация

  1. Vitrify рухнул бластоцисты в течение 30 минут от биопсии TE, чтобы предотвратить их повторное расширение.
  2. Пометьте пластину витрификации женскими деталями и идентификаторами бластоциктов, которые должны быть витрифицированы.
  3. Пометьте поддержку витрификации (ы) с именем и фамилией женщины, удостоверением личности пары, удостоверением эмбриона, который будет загружен на него, а также датой процедуры. Используются специальные криомаркировки, которые сохраняют свою целостность даже при очень низкой температуре (-196 градусов по Цельсию).
  4. При комнатной температуре, обойтись 0,3 мл раствора равновесия (ES) (Таблица материалов) для каждого бластоциста, который будет vitrified.
  5. В присутствии свидетеля, переместить бластоциста в ES с помощью 300 мкм зачистки пипетки.
  6. Оставьте бластоцист в ES на 13-15 мин. После первоначального сокращения объема будет наблюдаться постепенное повторное расширение.
  7. Заполните небольшую охлаждающую стойку жидким азотом (LN2) и поместите его под ламинарный капот потока.
  8. Распределить 300 л раствора витрификации (VS)(Таблицаматериалов) во второй скважине. После того, как бластоцист полностью перевыполнили, перенесите его в раствор VS на 1 мин и прополоскайте его, чтобы разбавить ES.
  9. В присутствии свидетеля, загрузить бластоциста на витрификации поддержки и заботиться об удалении избытка VS. Тонкая пленка раствора должна окружить бластоцист.
  10. Окунитесь витрификации поддержки в LN2 и переместить его энергично, с тем чтобы уменьшить риск образования пузырьков близко к образцу.
  11. Поместите защитную крышку, сохраняя при этом витрификацию поддержки погружен в LN2.
  12. В присутствии свидетеля, переместить витрификации поддержки в долгосрочной перспективе LN2 резервуар для хранения.

7. Искусственное усадка небиопсиированных blastocystss

  1. Если биопсия TE не проводится, искусственно разрушаются бластоцисты непосредственно перед витрификации(рисунок 4).
    1. Переместите культурное блюдо из инкубатора в перевернутый микроскоп и сосредоточьтесь на выбранном эмбрионе.
    2. Переключитесь на лазерную цель (предустановленный импульс: 0,3 мс, 6,5 мкм), нацеливай на zona pellucida на противоположной стороне ICM, затем направьте лазерные импульсы 1-2 на соединения между клетками TE на безопасном расстоянии от ICM. Бластоцисты должны рухнуть менее чем за 5 минут.
  2. Продолжить с витрификации рухнул бластоцист, как описано в разделе 6.

8. Передаваемые Blastocyst потепление

  1. В день ET, подготовить ET 4-колой пластины, поместив 600 л предварительно уравновешенных ЭКО культуры среды для каждой скважины. Инкубировать при 37 градусах Цельсия вконтролируемой атмосфере (5% O 2, 6% CO2),при выполнении бластоциста потепления.
  2. Пометьте согревающую тарелку с именем и фамилией женщины, удостоверением личности пары, идентификатором эмбриона, который будет нагреваться в нем.
  3. Распределите 1 мл оттаивания раствора (TS) (Таблица материалов) в ОДНО-хорошее блюдо ЭКО (Дополнительнаярисунок1) и подогрейте его до 37 градусов по Цельсию в термостате, по крайней мере 1 ч перед началом процедуры.
  4. Заполните небольшую охлаждающую поддержку LN2 и поместите ее в ламинарный капот потока в непосредственной близости от рабочей зоны.
  5. Перед началом процедуры проверьте информацию о витрификации, представленную на опоре витрификации. Все идентиматы должны соответствовать генетическому отчету, а бластоцист для согреться должен быть выбран среди передаваемых. Во время процедуры требуется свидетель.
  6. Возьмите одно-хорошо блюдо, содержащее подогрев ТС из термостата и поместите его на подогревом этапе под стереомикроскоп.
  7. Потяните за защитную крышку в LN2 с помощью щипков.
  8. Окунитесь быстро кончик витрификации поддержки в 37 КС TS.
  9. Под микроскопическим наблюдением осторожно перемещайте поддержку витрификации до тех пор, пока бластоцист не будет освобожден от кончика.
  10. Оставьте бластоциста в общей сложности 1 мин в ТС, обращая внимание, чтобы держать его в нижней части TS.
  11. При комнатной температуре выделяем 200 л раствора разбавления (DS)(Таблицаматериалов) на первом колодце пластины витрификации.
  12. Передача бластоциста в DS и поместить его в нижней части колодца, выпустив некоторые ТС на вершине его, чтобы создать своего рода градиент. Оставьте на 3 мин.
  13. Распределить 200 л стирального раствора (WS) в 2 различных скважинах (WS1 и WS2).
  14. Перенесите бластоцист на WS1 и поместите его на дно скважины, выпустив некоторые DS среды на вершине его. Затем перенесите бластоцист на WS2 и оставьте его нетронутым в течение 1 мин.
  15. Пометьте пост-разогревную ET пластину с именем женщины и фамилией, идентификатор омицы пары, ID эмбриона, который будет культивирован в нем.
  16. В присутствии свидетеля, передача разогретого бластоциста к предварительно уравновешенной культуре среды в пост-потепления ET пластины.
  17. Промыть бластоцист в первом колодце ET пластины и поместите его во второй колодец.
  18. Перенесите блюдо после потепления в инкубатор в контролируемой атмосфере (37 градусов по Цельсию, 6% CO2,5% O2) и культуры бластоциста, по крайней мере 1,5 ч, прежде чем проверить его выживание и повторное расширение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 5 показаны примеры вырожденных, крио-выживших, но не вновь расширенных и крио-выживших и полностью расширенных бластоцистых.

9. Перенос эмбрионов

  1. Чтобы выполнить ET, поместите блюдо на разогретой стадии ламинарного капота потока, так что эмбрион виден под микроскопом при низком увеличении.
  2. Возьмите около 0,4 мл среды культуры ЭКО. Закрепите наконечник шприца твердо в приемном конце внутреннего катетера, а затем отпустите среду до 0,1 мл.
  3. Среда культуры аспирируется до наблюдения эмбрионов, попадающих в катетер (минимальное количество носителей: 10–15 л).
  4. Поместите катетер в пластиковый корпус и перейдите в операционную и поместите внутренний катетер во внешний направляющий выступ.
  5. Как только достиг матки, нажмите шприц поршень, чтобы освободить эмбрион (ы). Отпустите очень медленно среды, пока поршень читает 0,1 мл.
  6. Возьмите катетер обратно в лабораторию и проверьте под микроскопом, что эмбрион был перенесен.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Рисунок 6 представляет собой схему всех результатов процедуры биопсии, которая может быть принята для стандартизации протокола и контроля за работой каждого оператора. Основным процедурным результатом является сроки завершения биопсии/биопсии; основным техническим результатом является качество участка, произведенного после генетического тестирования, что может привести либо к окончательному или безрезультатного диагнозу, последний из которых требует повторной биопсии недиагностированного бластоциста; основным биологическим результатом является скорость крио-выживаемости и повторного расширения по сравнению с дегенерацией после потепления; наконец, основным клиническим результатом является живой коэффициент рождаемости после vitrified-разогретый blastocyst передачи. В трех предыдущих исследованиях мы сообщили, KPIs определены в центре (ы) для технических, биологических и клинических исходов11,13,16. В дальнейшем мы сообщаем, как был определен KPI для определения сроков биопсии. Кроме того, было исследовано и то, как время между биопсией и витрификацией повлияло на постпотепление, поведение эвплоидных бластоцистых.

В течение 2 лет, в общей сложности 1544 trophectoderm биопсии процедуры были проведены 7 операторов (таблица 1). Все биопсии бластоцисты были затем перемещены обратно в инкубатор в пост-биопсии культуры блюдо до витрификации. Все соответствующие данные были собраны в соотношениябазы. Все сроки биопсии и между биопсией и витрификации были ретроспективно получены из программного обеспечения системы электронного свидетеля ЭКО. Затем данные экспортировались и анализировались на предмет статистических данных.

Крио-выживаемость euploid бластоций после трофитодерм биопсии и витрификации потепление было N No 571/572, 99,8%. Скорость повторного расширения на 1,5 ч после потепления была N 556/571, 97,4%. Среди 15 не вновь расширенных бластоциктов, один привел к живорождению после перевода в утробе матери. Коэффициент живорождений после витрифицированного разогретого euploid одного blastocyst передачи был N 227/572, 39,7%.

Определение идеального времени биопсии

В таблице 1 кратко излагаются соответствующие данные проводимых процедур биопсии. В целом, 1,89 и 1,03 (диапазон 1-4) бластоцисты были биопсии за процедуру в 8,24 и 4,23 мин (диапазон 3-22). Среднее время биопсии варьировалось из-за количества бластоцистов, биопсии на процедуру, от минимум 5,78 и 2,94 мин (диапазон 3-16), когда только один эмбрион был заложен в блюдо до максимума 12,93 и 4,43 мин (диапазон 6-22), когда эмбрионы последовательно биопсии мы re 4. Другим важным параметром был оператор, участвовавший в процедуре: самый опытный (N No 443 процедуры) был самым быстрым (7,41 и 3,6 мин, диапазон 3-22), в то время как наименее опытный (N No 42) был самым медленным (14,19 и 4,24 мин, диапазон 6-22). Действительно, обобщенные линейной модели, влекущие как "количество бластоциктов биопсии в процедуру", так и переменные "оператора" прекрасно объясняют "время биопсии" с R2 и 0,48 и мощностью 1. Этот анализ был полезен для определения того, что в идеале 6 мин достаточно для процедуры биопсии бластоциста, когда в блюдо закладывается только эмбрион, в то время как в блюде закладывается 9 мин, 12 мин и 13 мин для 2, 3 и 4 бластоцистых соответственно. Очевидно, что вся процедура влечет за собой также перемещение эмбрионов из культуры в блюдо биопсии и от последнего к пост-биопсии культуры блюдо после процедуры, а также изменение биопсии пипетка между последовательной биопсии.

Рисунок 7 укладывает среднее время биопсии для каждого оператора вдоль исследуемых триместров (от1-го до8-го). Пунктирная красная линия определяет среднее общее значение 8,24 мин. Такой график полезен для мониторинга средней производительности каждого практикующего врача. Например, большинство опытных операторов (1 и 2) показали постоянное снижение этого времени, что свидетельствует о тенденции, характерной для кривой обучения. Все операторы от 3 до 6 были вместо этого достаточно постоянными в их производительности вокруг среднего общего значения через триместы. В любое время они показали пик среднего значения от данного триместра (например, оператор 3 в7-м триместре, оператор 4 в6-м триместре, оператор 5 в3-м триместре), они были предупреждены, чтобы пересмотреть свою производительность. Оператор 7 (т.е. наименее опытный) показал сроки, типичные для эмбриолога, который только что закончил свое обучение. Возможно, он / она будет соответствовать стандартам внутренней лаборатории, как опыт будет увеличиваться.

Важно отметить, что время биопсии было аналогичным по всему повторно расширенной и не повторно расширенный euploid blastocysts на 1,5 ч от потепления (9,52 и 4,23 мин, диапазон 3-22 против 10,5 и 5,68 мин, диапазон 4-22; т-тест 0,37). Скорее всего, имплантированные (N No 229) и не имплантированные (N No 343) витрифицированные подогретые эвплоидные бластоцисты также показали сопоставимые сроки биопсии (9,77 и 4,15 мин, диапазон 3-22 против 9,41 и 4,36 мин, диапазон 3-22; t-test 0,39). Возможно, тогда время биопсии до 4 бластоцисты не влияет на поведение эмбриона после потепления. Поэтому мы определили это значение как максимальный порог.

Аналогичным образом, не было показано никакой разницы с точки зрения коэффициента живорождений между различными операторами биопсии, как уже сообщалось ранее13 (Дополнительная таблица 1).

Другим важным параметром для мониторинга производительности каждого оператора является скорость неубедительных результатов после постановки диагноза, которая должна быть максимально приближена к общей производительности каждой лаборатории. В идеале этот показатель не должен превышать 2,5% и со временем может снижаться из-за растущего опыта в биопсии и тюбинговых процедурах16. Целевое число тэ клеток для получения 7-8 в соответствии с двумя предыдущими исследованиями13,16. С этой целью предлагается сфотографировать биопсионный фрагмент для целей контроля качества (см. некоторые примеры на рисунке 3). Такая картина может быть проверена в случае неубедительных диагнозов для оценки того, была ли причина вменяема в размер/качество фрагмента (т.е. низкое качество молекулярного анализа), трубку (т.е. отказ усиления ДНК) или некоторые проблемы в обработки образца в генетической лаборатории.

Определение идеального времени между биопсией и витрификации

В исследуемый период, 572 euploid blastocysts были разогреты, чтобы пройти перенос эмбриона после диагноза euploidy. Рисунок 8A показывает каждый разогретый бластоцист, как черный круг, распределенный по все возрастающим срокам между биопсией и витрификации и сгруппированы в две группы в соответствии с результатами расследования: повторно расширенный или не расширенный в течение 1,5 ч от Потепление. Все бластоцисты (N No 117/117) vitrified в течение 30 минут, 97,6% (N No 245/251) бластоцисты витрифицированы между 31-90 мин, и 95,1% (N No 194/204) бластоцисты vitrified за 90 мин повторно расширена, соответственно (без повторного расширения ставки: 0%, 2,4% и 4,9%). Поэтому мы устанавливаем 30 мин и 90 мин как ранние и поздние пороги времени между биопсией и витрификации.

Рисунок 8B показывает скорость повторного расширения в трех группах (30 мин, 31-90 мин, йgt;90 мин) далее суб-кластерных в соответствии с бластоциста качества и день развития предимплантации. Особенно для низкого качества и / или день 7 blastocysts, сроки между биопсией и витрификации кажется решающим для достижения повторного расширения после потепления. В частности, коэффициент ы повторного расширения после потепления исправлены как для бластоциста качества и день биопсии в бластоции vitrified в течение 30 минут от биопсии против бластоциста vitrified за 90 мин было 3,05 (95% ДИ 1,01-9,4, стр 0,05). Вместо этого период между этими двумя порогами (31-90 мин) представлял собой серую зону, которая может или не может иметь последствия.

Только 1 из 15 не вновь расширенных бластоцисты привели к живому рождению после передачи. Таким образом, мы наконец исследовали уровень живорождений, достигнутый после разогретого euploid одного blastocyst передачи кластерных в трех группах в соответствии со сроками между биопсией и витрификации. Самый высокий уровень живорождений был достигнут за счет передачи euploid бластоцисты vitrified 30 мин от трофитодерм биопсии (N No 56/117, 47,9%). Тем не менее, этот результат не достиг статистической значимости по сравнению с тем же результатом, полученным либо с бластоцистами, витрифицированными между 31 и 90 мин (N No 92/251, 36,7%; Точный тест Фишера 0,06 евро, или с бластоцистами, витрифицированными, 90 мин от биопсии (N 81/204, 39,7%; Точный тест Фишера 0,16 евро). Таким образом, либо негативное воздействие на бластоцист репродуктивную компетентность является незначительным, либо размер выборки в этом наборе данных (N No 572) недостаточен для достижения статистической значимости.

Figure 1
Рисунок 1: Параметры для оценки бластоциста. Расширение: (A) полностью вылупились, (B) в штриховке, (C) полностью расширена, и (D) не расширена. Идеальный этап C, в то время как бластоцист D следует уделять больше времени для достижения полного расширения, если этот этап не будет достигнут в день 7; Внутренняя масса клеток (ICM) морфологическое качество: 1 (заметное с несколькими строго упакованными клетками), 2 (различимые с несколькими, но примерно упакованными клетками) и 3 (трудно отличить очень мало некачественных клеток); trophectoderm (TE) морфологическое качество: 1 (хорошо организованный эпителий с несколькими клетками), 2 (свободный эпителий с несколькими клетками) и 3 (несколько и/или большие низкокачественные клетки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Резюме последовательной zona pellucida (ЗП) открытие и трофектодерм (TE) клетки поиска подход для бластоциста биопсии. () Ориентируйте бластоцист с внутренней массой клеток (ICM) близко к удерживая пипетке и далеко от места, где будут извлечены выбранные ячейки TE. Закрепите бластоциста на удерживая пипетке; (б) откройте ЗП через 2-3 лазерных выстрела; (c) удар некоторые культуры средств массовой информации через отверстие; (d) бластоцист отсоединится от ЗП; (e) введите ЗП и сосать 5-10 ТЭ клеток в биопсии пипетки; (f) перемещайтесь назад с биопсией пипеткой, чтобы растянуть выбранный фрагмент и разоблачить соединения между клетками; (g) огонь на стыках между клетками и продолжать растяжение фрагмента, пока клетки TE не будут освобождены от тела бластоциста; (h) бластоцист после того, как биопсия TE рухнула; (i) Сфотографировать фрагмент биопсии для контроля качества и перенести его в трубку ПЦР, которая будет отправлена в генетическую лабораторию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Примеры фрагментов биопсии: (a-c)желательные фрагменты; (d) лисиченый фрагмент; (e) небольшой фрагмент с вырожденными клетками; (f) небольшой, частично лисиченый и вырожденный фрагмент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Искусственная усадка. () Ориентируйте бластоцист так, чтобы внутренняя масса клеток (ICM) была далека от целевого участка трохектодерма (TE); (b) Огонь 2-3 лазерных выстрелов подряд на стыках между клетками TE и перемещением наружу; (с) Подождите, пока бластоцист рухнет, прежде чем начать витрификации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Примеры дегенерации бластоциста (a), крио-выживания, но не повторного расширения (б) и крио-выживания и полного повторного расширения (с) 1,5 ч после потепления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Резюме различных результатов биопсии тропхектодерма, которые могут быть использованы для мониторинга работы оператора и определения ключевых показателей эффективности внутренней для каждой лаборатории. Основным процедурным результатом является сроки биопсии. Основным техническим результатом является скорость получения убедительных (евплоидных или анеуфлоидных) и неубедительных диагнозов (требуется повторная биопсия); последнее может быть вызвано усилением ДНК или низкокачественными молекулярными данными, что приводит к неинтерпресуемым участкам профиля числа копий хромосом. Основным биологическим результатом является скорость крио-выживаемости и повторного расширения или дегенерации после биопсии, витрификации и потепления. Основным клиническим результатом является частота живорождений или отрицательных исходов беременности, достигнутых после переноса стекловидного разогретого бластоциста. Следует отметить, что в то время как процедурный результат зависит исключительно от оператора и количества бластоциктов для биопсии в процедуре, все другие результаты могут быть затронуты от других confounders независимо от оператора биопсии (например, шаги и операторы участие в молекулярном анализе, морфологическое качество бластоциста, день биопсии), которые должны быть учтены, чтобы правильно оценить его /ее производительность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Среднее время биопсии на одного оператора в 8 исследованиях тримесеров. В таблице подытоживается связанное количество процедур и среднее количество бластоциктов, биопсии в каждой процедуре каждым оператором в 8 исследуемых триместрах. Пунктирная красная линия в каждом графике представляет общее среднее время биопсии (8,24 мин). Бары ошибок являются стандартными отклонениями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8: Повторное расширение после потепления по сравнению со сроками между биопсией и витрификации. (A) показывает, не вновь расширенный и вновь расширенный blastocysts 1,5 часа после потепления. Каждый бластоцист представлен черным кругом по все возрастающим таймингам. Вертикальные непрерывные черные линии представляют 30 мин, установленные в качестве раннего порога, и 90 мин, установленные в качестве позднего порога. (B) показывает темпы повторного расширения в трех группах (время между биопсией и витрификации: 30 мин, 31-90 мин, йgt;90 мин) далее кластерных в соответствии с бластоциста качества и день биопсии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

N процедур N бластоцисты биопсии в процедуре Среднее время биопсии и SD, диапазон (мин)
Оператор 1 443 г. 2,01 и 1,09, 1-4 7,41 и 3,6, 3-22
195 г. 1 4,75 и 1,96, 3-16
111 г. 2 7,83 и 2,45, 3-18
71 год 3 10.27 и 2.41, 4-16
66 4 11.48 - 3,81, 6-22
Оператор 2 290 г. 1,81 и 0,98, 1-4 7,87 и 4,13, 3-22
142 г. 1 5,69 и 3,32, 3-16
89 2 8.48 и 2.79, 3-18
30 год 3 11.37 - 3,72, 4-20
29 4 13.1 и 3.89, 9-22
Оператор 3 287 1,98 и 1,05, 1-4 9.10 - 4,65, 3-22
121 год 1 6 х 2,19, 3-15
89 2 9,6 и 3,87, 3-22
38 3 12,66 и 4,55, 4-22
39 4 14.13 - 4,8, 6-22
Оператор 4 217 Г. 1,66 и 0,87, 1-4 7,58 и 3,45, 3-22
118 год 1 5,58 и 1,96, 3-14
66 2 8,92 и 2,91, 4-22
21 год 3 11.48 - 2,34, 5-16
12 Лет 4 13 и 4,26, 6-19
Оператор 5 144 г. 2,03 и 1,08, 1-4 9,43 и 4,24, 3-22
59 1 6,15 и 2,5, 3-16
43 2 10.07 - 2,73, 6-16
20 3 12,6 и 2,89, 9-18
22 Г. 4 14.09 - 4.43, 6-22
Оператор 6 121 год 1,67 и 0,94, 1-4 7,79 и 3,93, 3-22
70 лет 1 6,19 и 2,95, 3-16
32 год 2 8.12 - 1,72, 3-11
9 До 9 3 12.78 - 3.31, 9-18
10 Лет 4 13,5 и 6,19, 6-22
Оператор 7 42 г. 1,62 и 0,94, 1-4 14.19 - 4.24, 6-22
27 1 11.85 - 5.53, 6-16
6 2 16,5 и 3,73, 11-22
7 (г. 3 19.86 - 3.34, 13-22
2 4 19 и 4,24, 16-22
Общая 1544 год 1,89 и 1,03, 1-4 8.24 - 4,23, 3-22
732 г. 1 5,78 и 2,94, 3-16
436 г. 2 8,85 и 3,14, 3-22
196 г. 3 11.72 - 3,70, 4-22
180 г. 4 12,93 и 4,43, 6-22

Таблица 1: Общее среднее время биопсии и среднее количество бластоцистов биопсии в каждой процедуре в соответствии с биопсией оператора. Среднее время биопсии также было показано в зависимости от каждого последовательного числа бластоциктов биопсии в каждой процедуре. Обобщенные линейные модели, включающие как "биопсию оператора", так и "количество бластоцистов, биопсифицированных в процедуре" переменных, прекрасно коррелирует с "временем биопсии" (R2 и 0,48, мощность No 1).

Дополнительная рисунок 1: Основные устройства и опоры, необходимые для процедуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 1: Логистический регрессионный анализ не показывает какой-либо существенной связи между оператором биопсии и живорождений после витрифицированного разогретого euploid передачи бластоциста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Только опытные опытные эмбриологи, прошедшие свой учебный период, должны выполнять как биопсию TE, так и витрификацию бластоциста. Кроме того, свидетель обязан контролировать процедуры и гарантировать эффективную прослеживаемость во время i) движения биопсии бластоциста из биопсии блюдо (Дополнительная рисунок 1) в пост-биопсии блюдо (Дополнительная рисунок 1 ), затем к пластине витрификации(Дополнительная фигура1) и, наконец, к поддержке витрификации (Дополнительнаярисунок1); ii) передача биопсии ТЭ-клеток из биопсии в трубку ПЦР(дополнительная диаграмма1); iii) потепление и передача шагов после диагностики. Для подробного описания всех этапов свидетельских показаний отсылайте к режиму отказа и анализу эффектов (FMEA), ранее опубликованным14.

Все методы, описанные в настоящем документе, соблюдают местное регулирование (Итальянский закон 40/2004). Согласно закону, на самом деле, пара может запросить, чтобы быть информированным о состоянии здоровья эмбрионов, которые они произвели во время цикла ЭКО. В этой связи должно быть подписано подробное информированное согласие на PGT от обоих партнеров.

В этой работе мы описали, как внедрить бластоцист биопсию для PGT в напряженной лабораторной рутины. Применение бластоциста биопсии подход был важным шагом вперед в последнее десятилетие в ЭКО. Впервые сообщил де Бур и его коллеги в 2004году 17, вскоре он был признан в качестве более эффективной и информативной процедуры по сравнению с расщепления стадии и полярных подходов биопсии тела3. Ценность этой процедуры в основном заключается в снижении технической нагрузки, но и в снижении частоты хромосомной мозаики на данном этапе развития18,19. Кроме того, удаление нескольких клеток Т из бластоциста было предложено в качестве более безопасной процедуры, чем удаление одного бластомера из эмбриона стадии расщепления. Действительно, в рандомизированном исследовании без отбора первый подход не привел к какому-либо воздействиюна потенциал имплантации эмбриона, в то время как последний включал значительное сокращение на 20%.

Протокол, в основном используемый во всем мире, влечет за собой лазерное открытие зоны в 3-й день после оплодотворения. На сегодняшний день не проводилось рандомизированное контролируемое исследование для сравнения различных подходов к биопсии бластоциста. Однако разумно, что чем меньше количество манипуляций и воздействия растущих эмбрионов на неоптимальные условия окружающей среды, тем ниже потенциальная инвазивность протокола. Кроме того, наличие отверстия в zona pellucida с 3-го дня развития может повлиять на расширение бластоциста и вызвать грыжу ICM-клеток вместе с клетками TE. По этим причинам мы установили и внедрили описанный здесь протокол, который влечет за собой последовательное нарушение зоны с лазерной помощью и извлечение тЭЦ, как только бластоцист достигнет полного расширения. Также существует другой протокол, который влечет за собой день 5 или 6 вспомогательных штриховки5,7. В частности, бурение зоны проводится на 5-й или 6-й день развития предимплантационной на противоположной стороне в отношении ICM; бластоцист затем перемещается обратно в инкубатор в ожидании спонтанного грыжи тихих клеток. Очевидно, что периодический мониторинг бластоциста должен быть обеспечен в последующие часы, чтобы биопсию, как только TE начнет грыжу, а также предотвратить эмбрион от вылупления полностью. Если, с одной стороны, неквалифицированные практикующие могут легко реализовать эту альтернативную стратегию биопсии, то с другой стороны, она не подходит для занятой лаборатории, выполняющей несколько процедур в день. Последовательный протокол открытия зоны и бластоциста биопсии, описанный здесь, является менее трудоемким и позволяет сократить практическое время и более высокую гибкость для планирования повседневной деятельности в лаборатории, чтобы координировать сроки, посвященные биопсии и витрификации процедур.

Плохое качество бластоцистов может быть более сложным для биопсии, поскольку TE клетки могут быть липкими, но больше лазерных выстрелов координируется с растяжения фрагмента подвергать соединения между клетками достаточно, чтобы удалить его из тела бластоциста. Полностью вылупившихся бластоциста может быть биопсии, как бластоцисты заключены в zona pellucida, но они могут быть сложнее vitrify и тепло. В случае безрезультатных диагнозов после биопсии, данные, представленные на сегодняшний день являются согласующимся, что никакого вреда, кажется, вытекают из повторной биопсии и следующие витрификации потепление цикла16,21.

Витрификация в настоящее время используется в центре для выполнения бластоцификации криоконсервации, поскольку она постоянно сообщается безопаснее, более эффективным и менее трудоемким, чем медленное замораживание протокола из обзора и мета-анализа последней литературы 10.

После того, как процедура была хорошо установлена и операторы должным образом обучены, мы провели ретроспективный анализ, чтобы определить идеальные процедурные сроки для обеих бластоцистии биопсии и витрификации процедур (обобщены здесь, в репрезентативных результатах). В качестве окончательных результатов, мы оценили скорость повторного расширения euploid бластоциста оценивается на 1,5 ч после потепления и живой коэффициент рождаемости, достигнутый после vitrified-разогретый euploid одного эмбриона передачи. После биопсии не наблюдалось ни одного случая дегенерации бластоциста, и после потепления было зарегистрировано всего 0,2% (N 1/572) коэффициента дегенерации, что подтверждает надежность принятых подходов к биопсии и витрификации. Согласно анализу, сроки, необходимые для выполнения бластоцистии биопсии не влияет ни на жизнеспособность euploid blastocysts после потепления определяется как повторное расширение скорости, или репродуктивного потенциала определяется как живой коэффициент рождаемости. Хотя различные сроки могут наблюдаться между операторами с различным опытом, мы можем рассмотреть бластоциста биопсии безопасно, когда процедура завершена примерно в 8 мин, в диапазоне от 3 до 22 мин в зависимости от количества эмбрионов на процедуру (однако нет данных доступны для биопсии процедур, выполняемых с более длительными интервалами). Среднее время, затрачиваемые на биопсию бластоциста от каждого отдельного оператора, должно периодически (по крайней мере каждые три месяца) контролироваться в качестве KPI. Наряду с этим, уровень безрезультатной диагностики и живой рождаемости после витрифицированного разогретого euploid blastocyst передачи должны быть также рассмотрены. Наконец, мы наметили идеальное время между биопсией и витрификации. Так как мы наблюдали самый высокий уровень повторного расширения после потепления, когда бластоцисты были vitrified в течение 30 минут от биопсии, мы предлагаем это значение в качестве идеального порога. В частности, чем дольше время между биопсией и витрификации, тем больше биопсии бластоциста будет вновь расширяться, прежде чем криоконсервации. Это может быть вредно для крио-выживания, особенно при работе с некачественным и / или день 7 blastocysts11. Тем не менее, никакого существенного влияния на клинические исходы не наблюдалось, даже если витрификация была отложена за 90 мин. Поэтому в спорадических случаях такие сроки могут быть разрешены.

Метод, выбранный для получения образца для PGT, не должен влиять на жизнеспособность эмбриона, должен включать надежные и информативные результаты, должен быть клинически эффективным и должен быть легко реализован тем самым, уменьшая затраты и лабораторную нагрузку. Blastocyst биопсия выполняет все эти предпосылки. Тем не менее, это все еще инвазивная процедура, которая должна быть выполнена квалифицированными операторами в хорошо оборудованной лаборатории. В настоящее время ведется расследование авангарда неинвазивного подхода PGT (niPGT). Возможно, в будущем, отработанные средства массовой информации культуры после ЭКО могут быть проанализированы для проведения хромосомных и / или генетического тестирования. Это интригующая перспектива на будущее, поскольку расходы на клинику ЭКО будут ниже, и вся рабочая нагрузка, связанная с биопсией эмбрионов, будет обойдена. Тем не менее, надежность и воспроизводимость отработанного медиа-анализа для генетического тестирования еще предстоит оценить22,23,24, поэтому необходимо приложить больше усилий для определения и проверки протокола, который мог бы костюм всех клиник ЭКО выполнения PGT во всем мире.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

AG и RM собрали данные и составили рукопись. УК проанализировала данные, составила репрезентативные результаты, выполнила статистику и пересмотрела рукопись. FMU и LR обеспечили критическое обсуждение результатов и всей рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Cold tube rack Biocision XTPCR96
Electronic pipette controller Fisher Scientific 710931
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
IVF Electronic Witness System CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions RI Witness ART Management System
Inverted microscope Nikon Eclipse TE2000-U
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Laser objective RI Saturn 5
Microinjectors Nikon Narishige NT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubes Eppendorf CSLQSPIN for 0.2 mLl PCR tubes
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermostat Panasonic MCO-5AC-PE
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Consumables
Biopsy pipette RI 7-71-30FB35720 30 µm ID, flat 35 °C
Cryolock Cryolock CL-R-CT
CSCM complete Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer Catheter Cook G17934
Flexipet pipette Cook G26712 140µm stripping pipette tip
Flexipet pipette Cook G46020 300µm stripping pipette tips
Holding pipette RI 7-71-IH35/20 30 µm ID, flat 35 °C
Human Serum Albumin Irvine Scientific 9988
IVF One well dish Falcon 353653
Mineral Oil for embryo culture Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Irvine Scientific 90126 Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta Surface Thermofisher scientific 176740 IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dish Corning 353802 60 mm x15 mm
Reproplate Kitazato 83016
Serological pipette Falcon 357551 10ml
Sterile disposable Gilson tips Eppendorf 0030 075.021 200 µL
Tubing Kit Provided by the genetic lab PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification media Kitazato VT801 Equilibration and vitrification solutions
Warming media Kitazato VT802 Thawing and dilution solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
  2. Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104, (6), 1503-1512 (2015).
  3. Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
  4. Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29, (6), 1173-1181 (2014).
  5. Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. (2016).
  6. McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84, (6), 1628-1636 (2005).
  7. Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20, (7), 1855-1859 (2005).
  8. Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13, (4), 1014-1019 (1998).
  9. Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22, (1), 2-22 (2016).
  10. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23, (2), 139-155 (2017).
  11. Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. (2018).
  12. Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20, (6), 808-821 (2014).
  13. Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31, (1), 199-208 (2016).
  14. Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33, (3), 360-369 (2016).
  15. Gardner, D. K., Schoolcraft, B. Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. Jansen, R., Mortimer, D. Parthenon Press. 377-388 (1999).
  16. Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. (2018).
  17. de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82, (2), 295-298 (2004).
  18. Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107, (5), 1098-1106 (2017).
  19. McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11, (10), e1005601 (2015).
  20. Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100, (3), 624-630 (2013).
  21. Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106, (3), e164 (2016).
  22. Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110, (5), 870-879 (2018).
  23. Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31, (8), 1653-1661 (2016).
  24. Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33, (4), 745-756 (2018).
Биопсия и витрификация человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maggiulli, R., Giancani, A., Cimadomo, D., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Human Blastocyst Biopsy and Vitrification. J. Vis. Exp. (149), e59625, doi:10.3791/59625 (2019).More

Maggiulli, R., Giancani, A., Cimadomo, D., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Human Blastocyst Biopsy and Vitrification. J. Vis. Exp. (149), e59625, doi:10.3791/59625 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter