Summary
在这里,我们提出一个协议,通过CRISPR/Cas9系统对CAR-T细胞进行基因编辑。
Abstract
奇美抗原受体T(CAR-T)细胞治疗是癌症的前沿和潜在的革命性新治疗选择。然而,在癌症治疗中广泛使用它存在重大限制。这些限制包括发展独特的毒性,如细胞因子释放综合征 (CRS) 和神经毒性 (NT) 和有限的扩张、 效应器功能和抗肿瘤活性在实体肿瘤.提高CAR-T效能和/或控制CAR-T细胞毒性的一个策略是在CAR-T细胞制造过程中编辑CAR-T细胞本身的基因组。在这里,我们描述了CRISPR/Cas9基因编辑在CAR-T细胞中通过转导与含有引导RNA的慢病毒结构,以颗粒细胞巨噬细胞菌群刺激因子(GM-CSF)和Cas9。例如,我们描述了CRISPR/Cas9对GM-CSF的介导淘汰。已经证明,与野生型CAR-T细胞相比,这些GM-CSFk/o CAR-T细胞在维持关键T细胞功能的同时,有效产生较少的GM-CSF,并增强体内抗肿瘤活性。
Introduction
嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗在癌症治疗中显示出巨大的前景。1,2两种针对CD19(CART19)的CAR-T细胞疗法最近在美国和英国批准用于B细胞恶性肿瘤,在多中心临床试验中取得了显著成果。3,4,5 CAR-T细胞更广泛地使用的障碍是实体肿瘤和相关毒性(包括细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性(NT)中的活性有限。3,5,6,7,8,9为了提高CAR-T细胞治疗的治疗指标,利用锌指核酸酶、TALEN和CRISPR等基因组工程工具进一步修改CAR-T细胞,以产生毒性较低或更有效的CAR-T细胞。10,11
在本文中,我们将介绍一种生成 CRISPR/Cas9 编辑的 CAR-T 单元格的方法。该方法的具体目标是通过CRISPR/Cas9在CAR-T细胞制造过程中对CAR-T细胞进行基因改造,以产生毒性较低或更有效的CAR-T细胞。开发该方法的原理基于从CAR-T细胞治疗的临床经验中吸取的经验教训,这表明迫切需要新的策略来增加CAR-T细胞治疗的治疗窗口,并将应用扩展到其他肿瘤,并支持合成生物学的最新进展,允许CAR-T细胞的多次修改,已经开始进入诊所。当几种基因组工程工具正在开发并应用于不同的环境,如锌指核酸酶、TALEN 和 CRISPR 时,我们的方法描述了 CRISPR/Cas9 对 CAR-T 细胞的修饰。10,11 CRISPR/Cas9 是一种基于RNA的细菌防御机制,旨在消除外来DNA。CRISPR依靠内切酶来切出通过导引RNA(gRNA)识别的目标序列。与其他基因组工程工具的CRISPR编辑CAR-T细胞具有若干优势。其中包括gRNA序列的精确性、针对感兴趣的基因设计gRNA的简单性、高基因编辑效率,以及同时使用多个gRNA系统靶向多个基因的能力。
具体来说,在本文描述的方法中,我们使用一种慢病毒编码CRISPR指南RNA和Cas9在CAR转导T细胞过程中破坏基因。在选择适当的技术来编辑CAR-T细胞时,我们建议这里描述的技术是一种产生研究级CAR-T细胞的有效机制,但由于Cas9永久集成到基因组的长期影响是未知的,我们提出这种方法,以开发概念证明研究级CAR-T细胞,但不用于生产良好的制造实践级CAR-T细胞。
特别是,在这里,我们描述了以人类CD19为目标的粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)敲除CAR-T细胞的产生。这些CAR-T细胞是通过转导与慢病毒颗粒编码的指南RNA特定于GM-CSF(基因名称CSF2)和Cas9产生的。我们之前发现,GM-CSF 中和改善 CRS 和 NT 在异种移植模型中.12个 GM-CSFk/o CAR-T 细胞允许在制造过程中抑制 GM-CSF,有效减少 GM-CSF 的生产,同时提高 CAR-T 细胞的抗肿瘤活性和在体内的存活率,与野生型 CAR-T 细胞相比。12因此,在这里,我们提供了一个生成 CRISPR/Cas9 编辑的 CAR-T 单元格的方法。
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Protocol
该协议遵循梅奥诊所机构审查委员会(IRB)和机构生物安全委员会(IBC)的指导方针。
1. CART19细胞生产
- T细胞分离、刺激和前体培养
- 利用适当的个人防护设备,在细胞培养罩中执行所有细胞培养工作。从在阿汇期间收集的去识别的正常供体血锥中采集外周血单核细胞(PBMC),因为这些已知是PBMC的一个可行来源。
- 要分离 PBMC,将 15 mL 的密度梯度介质添加到 50 mL 密度梯度分离管中。用含有2%胎儿牛血清(FBS)的磷酸缓冲盐水(PBS)稀释供体血液,以避免细胞诱捕。
- 将锥体的稀释供血加入分离管中,小心不要干扰血液与密度梯度介质之间的界面。在 RT 下以 1,200 x g离心 10 分钟。
- 将上清液切成新的50 mL锥形,用PBS +2%FBS清洗,将300 x g的离心机在RT时8分钟,吸气上清,在40 mL的缓冲液中重新悬浮,并计数细胞。
- 根据制造商的协议,使用全自动电池分离器,通过负选择磁珠套件从 PBMC 中分离 T 细胞。
- 要培养分离的T细胞,制备由10%人AB血清(v/v)、1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺(v/v)和无血清造血细胞培养基组成的T细胞培养基(TCM)。通过 0.45 μm 无菌真空过滤器过滤,然后用 0.22 μm 无菌真空过滤器对介质进行消毒。
- 在第0天(T细胞刺激日),在T细胞刺激之前清洗CD3/CD28珠。洗涤时,将所需的珠子体积(使用足够的CD3/CD28珠子,比例为3:1珠:T细胞;注意珠子的浓度可变化)放入无菌的1.5 mL微离心管中,并重新悬浮在1 mL的中药中。
- 与磁铁接触。
- 1分钟后,吸出中药,重新悬浮在1mL的新鲜中药洗珠。
- 重复此过程,共进行三次处理。
- 第三次洗涤后,将珠子重新悬浮在1mL的中药中。
- 计算 T 单元格。
- 将珠子以 3:1 珠子:细胞的比例传输到 T 细胞。
- 将细胞稀释至1 x 106细胞/mL的最终浓度。
- 在37°C下孵育,5%CO2孵育24小时。
- T细胞转染和转导
- 使用 BSL-2+ 预防措施进行慢病毒工作,包括细胞培养罩、个人防护设备,以及处理前用漂白剂对废旧材料进行消毒。
- 在慢病毒载体中获取 CART19 构造。
注:此处使用的 CART19 构造是使用市售蛋白质合成供应商设计并合成的。在EF-1+启动子的控制下,CAR结构随后被克隆成第三代慢病毒。单链可变区域片段派生自 FMC63 克隆,可识别人类 CD19。CAR19结构拥有第二代4-1BB成本测量域和CD3-刺激(FMC63-41BBz)。12 - 执行前所述的慢病毒生产。12
- 简而言之,要产生慢病毒,利用293T细胞已经达到70-90%的汇合。
- 允许在转染试剂的室温下孵育30分钟,包括15微克感兴趣的慢病毒质粒、18微克的gag/pol/tat/rev包装载体、7μg的VSV-G包络载体、111μL的预复原试剂、129 μL的转染试剂,并在加入293T细胞之前,将转染介质的9.0 mL。然后在37°C,5%CO2培养转染细胞。
- 收集,离心机(900 x g 10 分钟),过滤器(0.45 μM 尼龙过滤器),并在 24 和 48 小时通过超离心化在 13,028 x g 18 h 或 112,700 x g 2 h 浓缩上清液。
- 冷冻在-80°C,以供将来使用。
- 在第1天,轻轻地重新悬浮T细胞,以分解T细胞的玫瑰花环,在第0天被刺激在1 x 106/mL。
- 在适当的BSL-2+预防措施下,对所有慢病毒工作,添加新鲜或冷冻收获的病毒到刺激的T细胞在3.0的多重感染(MOI)。
- CAR-T 细胞扩张
- 在扩张阶段,继续在37°C、5%CO2下孵育转导T细胞。在第3天和第5天计算CAR-T细胞,并在培养基中加入新鲜的预加热中药,以保持1 x 106/mL的CAR-T细胞浓度。
- 使用磁铁在刺激后 6 天(第 6 天)从转导 T 细胞中取出珠子。在磁铁中采集、重新悬浮并将 T 细胞放入 50 mL 锥形管中 1 分钟。然后收集上清液(包含 CAR-T 细胞),并丢弃珠子。
- 将收集的CAR-T细胞放回培养中,浓度为1 x 106细胞/mL,以恢复扩张。
- 在第6天,通过流式细胞测量评估CAR的表面表达。
注:有几种方法可用于检测CAR的表面表现,例如用山羊抗小鼠IgG(H+L)交叉吸附二级抗体染色,或通过与CD19特异性肽染色,与氟铬结合。在这里,从培养液中取一个等分(约100,000T细胞),用Dulbeco的磷酸盐缓冲盐水、2%的胎儿牛血清和1%阿齐德钠制备的流动缓冲液洗涤。用抗CAR抗体染色细胞,洗涤两次。用活/死染色和CD3单克隆抗体(OKT3)染色细胞。清洗细胞并重新悬浮在流动缓冲液中。在细胞仪上采集以确定转导效率。
- CAR-T细胞冷冻保存
- 在刺激后8天(T细胞扩张的第8天),收获和冷冻保存CAR-T细胞,从培养中收获细胞。
- 在 300 x g下旋转 5 分钟。
- 在冷冻培养基中重新悬浮在冷冻培养基中,每瓶1000万个细胞,在冷冻培养基中,由10%二甲基硫酸盐和90%胎儿牛血清组成。
- 冷冻在冷冻容器中,在-80°C冷冻器中达到-1°C/min的冷却速度,然后在48小时后转移到液氮中。
- 在用于体外或体内实验之前,在温暖的中药中解冻CAR-T细胞。
- 清洗细胞以稀释和去除二甲基硫酸盐,并在热中药中重新悬浮至2 x 106细胞/mL的浓度。在37°C下过夜,5%CO2。
2. 通用-CSF k/o CART19 生产
- 为了破坏GM-CSF,利用一种针对人类GM-CSF(CSF2)的导引RNA(gRNA),通过筛选gRNA选择的人类GM-CSF(CSF2)具有高效率,该基因编码为人类细胞因子GM-CSF。14
注:使用了商业合成的Cas9第三代慢病毒结构,该结构含有这种gRNA(U6启动子下)。该结构包含一个紫霉素抗性基因。gRNA的序列是GACCTGCCACACCCGCC。12 - 要产生慢病毒,利用已经达到70-90%汇合的293T细胞。
- 允许15μg感兴趣的慢病毒质粒,18μg的gag/pol/tat/rev包装载体,7μg的VSV-G包络载体,111μL的预复原试剂,129μL的转染试剂,9.0 mL的转染介质到孵育30分钟在房间te姆佩拉图。
- 向293T细胞添加转染试剂。然后在37°C培养,5%CO2。
- 收集,离心机(900 x g 10 分钟),过滤器(0.45 μM 尼龙过滤器)和浓缩上清液在 24 和 48 小时通过超离心在 13,028 x g 18 h 或 112,700 x g 2 h 和冻结在 -80 °C 供将来使用。
- 第1天,轻轻地重新悬挂T细胞,以分解玫瑰花环。
- 在BSL-2+认可的实验室中,将冷冻或新鲜收获的病毒添加到刺激的T细胞中,以产生CAR-T细胞。用CAR19慢病毒和GM-CSF转导T细胞,以CRISPR慢病毒为目标。在 MOI 为 3 处添加 CAR19 慢病毒。由于CRISPR扁病毒的滴定不可行,使用15微克质粒制剂产生的病毒颗粒转导10 x 106 T细胞。
- 如步骤1中所述,请参阅 T 细胞刺激、扩张和冷冻保存的剩余步骤。
- 对于具有抗紫霉素的经编辑的T细胞,在第3天和第5天以每1mL浓度1微克的二氯酸氯酸光酸处理细胞。
3. 全球机制-CSF中断效率和通用CSF k/o CART19的功能评估
- GM-CSF 中断效率:通过分解 (TIDE) 排序和分析跟踪 indel
- 要对GM-CSF基因感兴趣的外因进行测序,请使用以下引源。使用 TGACTAGAGAGCACAGA 的 GM-CSF (CSF2) 的正向引色序列,以及 TCACCTCTGACCAACC 的反向引色序列。
- 使用基因组提取试剂盒从多达 500 万个 CAR-T 细胞中提取 DNA。对于PCR反应,使用每反应25μL的Taq主混合物,在βM的PCR反应中,每个引基剂的最终浓度为0.1-0.5 μg的模板DNA,使用无核酸酶水,PCR反应的总体积可达50μL。
- 请参阅表 1中描述的 PCR 循环条件。
- 在100 V的1-2%甘蔗凝胶上运行PCR样品30分钟,并使用凝胶萃取试剂盒提取。
- 序列 PCR 放大剂。通过将原始数据上传到适当的 TIDE 软件来计算等位基因修改频率。15
- GM-CSF 生产与通用 CSFk/o CART19 的功能评估
- 为了确定CAR-T细胞的细胞因子生产,孵育野生型CART19细胞和GM-CSFk/o CART19与CD19表达急性淋巴细胞白血病细胞系NALM6在1:5的比例4小时在37°C,5%CO2存在莫尼辛溶液、反人类CD49d、反人类CD28和反人类CD107a。
- 从培养中收获细胞,用于流动细胞学。用流动细胞学缓冲液清洗细胞。用活/死染色套件染色细胞。在室温下在黑暗中孵育15分钟,用固定介质固定细胞,在室温下在黑暗中孵育15分钟。
- 洗涤后,用渗透介质在细胞内染色细胞,结合抗人IFN®单克隆抗体、抗人GM-CSF、抗人MIP-1+、抗人IL-2和反人类CD3,在室温下在黑暗中孵育30最小洗涤和重新悬浮样品。在流式细胞仪上采集样本,并分析细胞内GM-CSF表达的百分比。
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Representative Results
图1显示了GM-CSFk/o CART19单元中GM-CSF的减少。为了验证T细胞的基因组被改变为敲除GM-CSF,TIDE测序用于GM-CSFk/o CART19细胞(图1A)。CAR-T细胞表面染色验证T细胞是否通过在活CD3+细胞上浇注在体外成功表达CAR表面受体(图1B)。通过流动细胞测定对GM-CSF的细胞内染色,通过对活CD3+细胞的注控,证明GM-CSF在GM-CSFk/o CART19细胞中的表达减少,验证了敲除的功能成功(图1C)。GM-CSFk/o CAR-T 细胞与野生型抗CD19 CAR-T细胞(CART19)相比,通过细胞内染色表现出GM-CSF的减少(图1B)。此外,我们之前已经表明,GM-CSFk/o CAR-T细胞减少GM-CSF的生产,同时提高抗肿瘤活性和生存性相比,野生型CAR-T细胞在体内。12
| 步 | 温度 (°C) | 时间 | 周期 |
| 初始变性 | 94 | 3分钟 | 1 |
| 变性 | 94 | 45 秒 | 35 |
| 退火 | 60 | 30 秒 | |
| 扩展 | 72 | 2分钟 | |
| 后伸长 | 72 | 10分钟 | 1 |
| 4 | ∞ |
表 1:用于GM-CSFk/o CART19细胞的TIDE测序的PCR循环条件。
图 1: GM-CSFk/o CART19细胞显示GM-CSF减少。A) 具有代表性的 TIDE 序列验证了 GM-CSF CRISPR/Cas9 GM-CSFk/o CART19 细胞的基因组改变,破坏效率为 +71%。B) 代表性流图描绘了成功的 CAR-T 细胞生产,在野生类型 CART19 和 GM-CSFk/o CART19 上具有类似的 CAR 表达式。C) 与细胞内染色测定一样,当使用CD19阳性全细胞系NALM6刺激时,GM-CSFk/o CART19细胞与野生型CART19相比,GM-CSF减少。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在本报告中,我们描述了一种利用CRISPR/Cas9技术诱导CAR-T细胞二次修改的方法。具体来说,这证明使用慢病毒转导与病毒载体,含有gRNA靶向感兴趣的基因和Cas9生成GM-CSFk/o CART19细胞。我们之前已经表明,GM-CSF 中和在异种移植模型中可改善 CRS 和 NT。12如前所述,GM-CSFk/o CAR-T 电池允许在制造过程中抑制 GM-CSF,有效减少 GM-CSF 的生产,同时保持其他关键的 T 细胞功能,并增强体内抗肿瘤活性与野生型CAR-T细胞相比。12
由于 Cas9 在基因组中的永久集成在转换为临床上可行的产品时可能与不需要的效果相关,我们建议采用这一特定方法生成研究级 CRISPR/Cas9 修改 CART19 以验证概念实验。
虽然CAR-T细胞在癌症治疗中很有希望,但1、2细胞的疗效可以继续增强,其相关毒性得到更好的控制。CRISPR/Cas9技术提供了一种直接针对CAR-T细胞基因组的策略,以设计解决当前临床缺陷的解决方案。在本文中,我们将介绍 GM-CSFk/o CART19 单元的生成。
GM-CSFk/o CAR-T细胞是通过转导为CAR-T细胞质粒的慢病毒载体和含有转基因-CSF和Cas9的导引RNA的慢病毒结构而生成的。为了产生GM-CSFk/o,在U6启动子的控制下,使用了含有Cas9的第三代慢病毒结构(lentiCRISPRv2)和针对人类GM-CSF(CSF2)14的外子3的高效导引RNA(gRNA)。在程序的转导步骤中应特别注意,因为这些步骤对于改性CAR-T细胞的发育最为关键。挖空效率可以通过分解 (TIDE) 序列跟踪印贝来验证和评估。通过CD19+靶细胞对CAR结构的抗原特异性刺激,然后测量不同的T细胞功能,包括GM-CSF的产生,研究CAR-T细胞的功能活性。12值得注意的是,由于CART19的单链可变区域片段是小鼠来源,在表面染色前发生两次表面染色之前,应发生用山羊抗小鼠抗体进行CAR表达的染色。如果最初未观察到良好的 CAR 表达式,则这是故障排除中的重点。
这些经过改造的CAR-T细胞可用于体外研究以及体内异种移植模型,用于概念实验的证明。该技术的一个优点是CAR-T细胞的产生和基因操作可以同时进行一个步骤,与其他技术相比,效率也很好。10,11虽然双慢病毒转导是生成研究级GM-CSFk/o CART19细胞的一种方便和有效的方法,但DNA被纳入基因组,而长时间的Cas9表达可能会破坏基因组的稳定,增加偏离目标的影响风险。这种技术的一个局限性是,良好的制造实践级敲除需要修改技术到核苷酸蛋白CRISPR/Cas9系统,因为这种方法不会导致Cas9永久纳入基因组和降低偏离目标效应的可能性。本文所述方法可能应用于各种基因,通过CRISPR/Cas9对CAR-T细胞进行基因改造,以帮助产生毒性较低或更有效的CAR-T细胞。
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Disclosures
SSK 是 CAR T 细胞治疗领域的专利发明者,该专利授权给诺华(根据宾夕法尼亚大学梅奥诊所和诺华之间的协议)。这些研究部分由人类(SSK)的赠款资助。RMS、MJC、RS 和 SSK 是与本工作相关的专利的发明者。实验室 (SSK) 接受托莱罗、人类、风筝、伦蒂根、莫菲斯和Actinium的资助。
Acknowledgments
这项工作得到了K12CA090628(SSK)、国家综合癌症网络(SSK)、梅奥个性化医学诊所中心(SSK)、普雷多林基金会(SSK)、梅奥诊所执业翻译办公室(SSK)的资助。梅奥诊所医学科学家培训计划罗伯特·豪厄尔医生-科学家奖学金(RMS)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Fixation Medium (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge) |
GenScript | N/A | custom order |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Desktop Genetics | ||
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Monensin Solution, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | ATCC | CRL-3273 | acute lymphoblastic leukemia cell line |
| Nuclease Free Water | Promega | P119C | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane 0.45uM | Thermo Scientific Nalgene | 450-0045 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Permeabilization Medium (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| Rat Anti-Human GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
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