CRISPR/Cas9 gebruiken om GM-CSF uit te nemen in CAR-T-cellen
Summary
Hier presenteren we een protocol voor genetisch gemodificeerde CAR-T cellen via een CRISPR/Cas9 systeem.
Abstract
Chimeric antigeen receptor T (CAR-T) celtherapie is een Cutting Edge en potentieel revolutionaire nieuwe behandelingsoptie voor kanker. Echter, er zijn aanzienlijke beperkingen aan haar wijdverbreide gebruik bij de behandeling van kanker. Deze beperkingen omvatten de ontwikkeling van unieke toxiciteiten zoals cytokine release Syndrome (CRS) en neurotoxiciteit (NT) en beperkte expansie, Effector functies, en anti-tumor activiteit in vaste tumoren. Een strategie ter verbetering van de werkzaamheid van CAR-t en/of controle toxiciteiten van CAR-T-cellen is om het genoom van de auto-T-cellen zelf te bewerken tijdens de productie van auto-T-cel. Hier beschrijven we het gebruik van CRISPR/Cas9-genbewerking in CAR-T-cellen via transductie met een lentivirale constructie die een RNA-geleiding bevat naar granulocyt macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) en Cas9. Als voorbeeld beschrijven we CRISPR/Cas9 gemedieerde Knockout van GM-CSF. We hebben aangetoond dat deze GM-CSFk/o Car-t cellen effectief minder GM-CSF produceren met behoud van kritische T cel functie en resulteren in verbeterde anti-tumor activiteit in vivo in vergelijking met wild type auto-T cellen.
Introduction
Chimeric antigeen receptor T (CAR-T) celtherapie vertoont een grote belofte in de behandeling van kanker. 1 , 2 twee Car-T-celtherapieën gericht op CD19 (CART19) werden onlangs goedgekeurd in het Verenigd verklaarde en in Europa voor het gebruik in B celmaligniteiten na het aantonen van opvallende resultaten in multicenter klinische proeven. 3 , 4 , 5 barrières voor meer wijdverbreid gebruik van auto-T-cellen zijn beperkte activiteit in vaste tumoren en geassocieerde toxiciteiten, waaronder cytokine release SYNDROOM (CRS) en neurotoxiciteit (NT). 3 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 om de therapeutische index van Car-t-celtherapie te verbeteren, worden genoom engineering tools zoals zink vinger nucleasen, Talens en crispr gebruikt om de auto-t-cellen verder te wijzigen in een poging om minder toxische of effectievere auto-t-cellen te genereren. 10 , 11
In dit artikel beschrijven we een methode voor het genereren van CRISPR/Cas9 bewerkte CAR-T-cellen. Het specifieke doel van deze methode is het genetisch wijzigen van de auto-T cellen tijdens de productie van CAR-T cel via CRISPR/Cas9 om minder toxische of effectievere auto-T cellen te genereren. De logica voor het ontwikkelen van deze methodologie is gebaseerd op lessen geleerd uit klinische ervaring met CAR-T-celtherapie, die wijst op een dringende behoefte aan nieuwe strategieën om het therapeutische venster van CAR-T-celtherapie te verhogen en de toepassing uit te breiden tot andere tumoren en wordt ondersteund door de recente vooruitgang in de synthetische biologie waardoor meerdere modificaties van auto-T cellen die zijn begonnen met het betreden van de kliniek. Terwijl verschillende genoom engineering tools worden ontwikkeld en toegepast in verschillende instellingen, zoals zink vinger nucleasen, Talens en crispr, beschrijft onze methodologie crispr/Cas9 modificatie van Car-T cellen. 10 , 11 crispr/Cas9 is een op RNA gebaseerd bacterieel afweermechanisme dat is ontworpen om vreemd DNA te elimineren. Crispr vertrouwt op enzym om een doel sequentie te klieven die wordt geïdentificeerd door middel van een RNA geleider (grna). Crispr editing van Car-T cellen biedt verschillende voordelen ten opzichte van andere genoom engineering tools. Deze omvatten nauwkeurigheid van de gRNA-sequentie, eenvoud om een gRNA te ontwerpen die gericht is op het gen van belang, hoge genbewerkings efficiëntie en de mogelijkheid om meerdere genen te targeten, omdat meerdere Grna’s tegelijkertijd kunnen worden gebruikt.
Specifiek in de hier beschreven methoden gebruikten we een lentivirus codering CRISPR Guide RNA en Cas9 om een gen te verstoren tijdens auto-transductie van T-cellen. Bij het selecteren van een geschikte techniek om auto-T-cellen te bewerken, stellen we voor dat de hier beschreven techniek een efficiënt mechanisme is voor het genereren van onderzoekskrige auto-T-cellen, maar omdat het lange termijn effect van permanente integratie van Cas9 in het genoom onbekend is, Stel deze methodologie voor om proof of concept Research-cellen te ontwikkelen, maar niet voor het produceren van goede productiepraktijken met grade CAR-T-cellen.
In het bijzonder beschrijven we hier de generatie van granulocyt macrofaag kolonie stimulerende factor (GM-CSF) Knockout CAR-T cellen gericht op Human CD19. Deze auto-T-cellen werden gegenereerd door transductie met linvirale deeltjes die een specifieke RNA-gids coderen, specifiek voor GM-CSF (gennaam CSF2) en Cas9. We ontdekten eerder dat GM-CSF neutralisatie CRS en NT in een xenotransplantaatmodellen is-model uitstraalt. 12 GM-CSFk/o Car-t cellen zorgen voor de REMMING van GM-CSF tijdens het productieproces, effectief vermindering van de productie van GM-CSF terwijl het verbeteren van auto-T cel anti-tumor activiteit en overleving in vivo in vergelijking met wild type Car-t cellen. 12 zo bieden we hier een methodologie voor het genereren van crispr/CAS9 bewerkte Car-T-cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit rapport beschrijven we een methodologie om CRISPR/Cas9-technologie te gebruiken voor het opwekken van secundaire wijzigingen in CAR-T-cellen. Specifiek, dit wordt aangetoond met behulp van lentivirale transductie met een virale vector die gRNA gericht op het gen van belang en Cas9 voor het genereren van GM-CSFk/o CART19 cellen. We hadden eerder aangetoond dat GM-CSF neutralisatie CRS en NT in een xenotransplantaatmodellen is-model uitstraalt. 12 zoals eerder beschreven, maken GM-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van K12CA090628 (SSK), het National Comprehensive Cancer Network (SSK), het Mayo Clinic Center for geïndividualiseerde geneeskunde (SSK), de Predolin Foundation (SSK), de Mayo Clinic Office of translation to practice (SSK), en de Mayo Clinic Medical Scientist training programma Robert L. Howell arts-wetenschapper beurs (RMS).
Materials
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Fixation Medium (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge) |
GenScript | N/A | custom order |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Desktop Genetics | ||
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Monensin Solution, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | ATCC | CRL-3273 | acute lymphoblastic leukemia cell line |
| Nuclease Free Water | Promega | P119C | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile | Genesee Scientific | 25-228 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Permeabilization Medium (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| Rat Anti-Human GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
References
- Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Schuster, S. J., et al. Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Gust, J., et al. Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
- Fitzgerald, J. C., et al. Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia. Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).
- Liu, X., Zhao, Y. CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy. Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).
- Ren, J., Zhao, Y. Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9. Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).
- Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. , (2018).
- Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
