Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לערוך גנטית לרכב-T תאים דרך CRISPR/Cas9 מערכת.
Abstract
צ ' ושמעון אנטיגן לקולטן T (רכב-T) הטיפול בתאים הוא קצה חיתוך ואפשרות הטיפול המהפכני החדש של סרטן. עם זאת, ישנן מגבלות משמעותיות לשימוש נרחב בטיפול בסרטן. מגבלות אלה כוללות פיתוח של רעלים ייחודיים כגון תסמונת השחרור ציטוקינים (CRS) ו רעילות נוירו (NT) והרחבה מוגבלת, פונקציות אפקטור, ופעילות נגד הגידול בגידולים מוצקים. אסטרטגיה אחת כדי לשפר את היעילות רכב-T ו/או בקרת רעלים של תאי רכב-T היא לערוך את הגנום של התאים רכב-T עצמם במהלך ייצור תא רכב T. כאן, אנו מתארים את השימוש CRISPR/Cas9 gene העריכה בתאי רכב-T באמצעות התמרה עם בניית לנטינגיזציה המכילה RNA מדריך כדי גרנולוציט מקרופאג המושבה מגרה גורם (GM-שדרתי) ו Cas9. כדוגמה, אנו מתארים CRISPR/Cas9 בתיווך מתווכת של GM-שדרתי. הראינו כי אלה מוטורס-מכוניות מסוגk/o מכונית T לייצר ביעילות gm-שדרתי פחות, תוך שמירה על פונקציית התאים הקריטיים t ותוצאה של פעילות אנטי סרטניים משופרת vivo לעומת מסוג פראי רכב-T תאים.
Introduction
שצ קולטן אנטיגן T (רכב-T) טיפול תא מציג הבטחה גדולה לטיפול בסרטן. מיכל בן , 2 שתי מכונית-T טיפולים תא המיקוד CD19 (CART19) אושרו לאחרונה בארצות הברית הצהיר ובאירופה לשימוש B ממאירות תא לאחר הוכחת תוצאות מדהימות ב מולטיב להיכנס ניסויים קליניים. מיכל שלוש , ד , 5 מחסומים לשימוש נרחב יותר של מכונית-T תאים הם פעילות מוגבלת של גידולים מוצקים ורעלים משויכים כולל תסמונת השחרור ציטוקינים (CRS) ו רעילות נוירו (NT). מיכל שלוש , מיכל 5 , מיכל בן 6 , מיכל סבן , בן שמונה , 9 כדי לשפר את המדד התרפויטי של מכונית-t טיפול בתאים, הנדסת הגנום כלים כגון נוקלאוסים אצבע אבץ, talens, ו CRISPR מועסקים לשנות עוד יותר תאים מכונית-t בניסיון לייצר פחות רעיל או יעיל יותר מכונית-t תאים. מיכל עשור , מיכל בן 11
במאמר זה, אנו מתארים שיטה כדי ליצור CRISPR/Cas9 לערוך תאים רכב-T. המטרה הספציפית של שיטה זו היא לשנות גנטית בתאי רכב-T במהלך ייצור תא רכב-T באמצעות CRISPR/Cas9 כדי ליצור פחות רעיל או יעיל יותר מכונית-T תאים. הרציונל לפיתוח מתודולוגיה זו בנויה על הלקחים שנלמדו מניסיון קליני של הטיפול בתאי רכב T, אשר מצביע על צורך דחוף אסטרטגיות הרומן כדי להגביר את החלון הטיפולי של המכונית-T טיפול בתאי ולהרחיב את היישום לתוך גידולים אחרים נתמך על ידי ההתקדמות האחרונה בביולוגיה סינתטי המאפשר שינויים מרובים של תאים רכב-T שהתחילו להיכנס למרפאה. בעוד כמה כלים הנדסת הגנום מפותחים ומיושמים בהגדרות שונות, כגון נוקלאוסים אצבע אבץ, TALENs, ו CRISPR, המתודולוגיה שלנו מתארת CRISPR/Cas9 שינוי של תאים מכונית-T. מיכל עשור , 11 crispr/Cas9 הוא מנגנון RNA מבוססי הגנה בקטריאלי אשר נועד לחסל DNA זר. CRISPR מסתמך על האנונוקיטיות כדי לדבוק רצף היעד מזוהה דרך RNA מדריך (gRNA). העריכה CRISPR של התאים רכב-T מציע מספר יתרונות על פני כלים אחרים הנדסת הגנום. אלה כוללים דיוק של רצף gRNA, פשטות לעצב gRNA מיקוד את הגן של עניין, גבוה לעריכת היעילות של הגן, ואת היכולת למקד גנים מרובים מאז Grna מרובים ניתן להשתמש באותו זמן.
באופן ספציפי בשיטות המתוארות כאן, השתמשנו בקידוד מדריך CRISPR לקודד וירוס RNA ו Cas9 לשבש גן במהלך התמרה מכונית של תאי T. בבחירת הטכניקה המתאימה כדי לערוך מכונית T תאים, אנו מציעים את הטכניקה המתוארת כאן הוא מנגנון יעיל כדי ליצור מחקר כיתה תא רכב T, אבל בגלל ההשפעה לטווח ארוך של שילוב קבוע של Cas9 לתוך הגנום אינו ידוע, אנו להציע מתודולוגיה זו כדי לפתח הוכחה של מחקר המושג תאים-T בכיתה רכב, אבל לא להפקת טוב בפועל ייצור תאים מכונית-T.
בפרט, כאן אנו מתארים את הדור של גרנולוציט מקרופאג המושבה גורם מגרה (GM-שדרתי) הסתרה מכונית T תאים מיקוד האדם CD19. אלה תאי רכב-T נוצרו על ידי התמרה עם חלקיקים לקידוד מדריך RNA ספציפי GM-שדרתי (שם גן CSF2) ו Cas9. בעבר מצאנו כי הניטרול של GM-שדרתי הCRS קילה ו-NT במודל מבע. 12 GM-שדרתי מכוניותk/o -T תאים לאפשר עיכוב של gm-שדרתי במהלך תהליך הייצור, ביעילות להפחית את הייצור של gm-שדרתי תוך שיפור הרכב-T תא אנטי גידול פעילות והישרדות vivo לעומת ווילטיפ רכב-t תאים. 12 לכן, כאן אנו מספקים מתודולוגיה כדי ליצור CRISPR/CAS9 לרכב תאים T.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של הלוח המוסדי של מרפאת מאיו (IRB) והועדה הביובטיטיתית המוסדית (IBC).
1. הפקת תא CART19
- בידוד תא T, גירוי ותרבות vivo לשעבר
- לבצע את כל התרבות תאים העבודה במכסה של תרבות התא ניצול ציוד הגנה אישית מתאים. בציר דם היקפי בתאי מוננובית (PBMCs) מתוך מזוהה התאים הרגילים של התורם מקונוסים דם שנאספו במהלך apheresis כמו אלה ידועים להיות מקור בר קיימא של PBMCs.13
- כדי לבודד את PBMCs, הוסף 15 מ ל של בינוני מעבר הדרגתי בצפיפות לצינור הפרדה בצפיפות 50 mL. לדלל את הדם התורם עם נפח שווה של מלוחים באגירה פוספט (PBS) המכיל 2% סרום עוברי העובר (FBS) כדי למנוע השמנה תא.
- להוסיף את הדם התורם מדולל מן החרוט לתוך צינור ההפרדה, להיזהר לא להפריע את הממשק בין הדם ואת הצפיפות מעבר הצבע בינוני. צנטריפוגה ב 1,200 x g עבור 10 דקות ב-RT.
- Decant-supernatant לתוך החדש 50 mL חרוטי, לשטוף עם PBS + 2% FBS על ידי הבאת עד 40 mL, צנטריפוגה ב 300 x g עבור 8 דקות ב-RT, ולאחר מכן, השעיית מחדש ב 40 mL של מאגר, ולספור תאים.
- בידוד תאים T מ-PBMCs באמצעות ערכת חרוזים מגנטית בחירה שלילית באמצעות מפריד תא אוטומטי לחלוטין בהתאם לפרוטוקול של היצרן.
- לתרבות התאים T מבודדים, להכין תא T בינונית (TCM) המורכבת 10% סרום AB האנושי (v/v), 1% פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (v/v), ו-סרום ללא המטפאות בינונית תא. לחטא את המדיום על ידי סינון באמצעות מסנן ואקום סטרילי 0.45 יקרומטר ולאחר מכן עם 0.22 יקרומטר מסנן ואקום סטרילי.
- ביום 0 (היום של גירוי התא T), לשטוף CD3/CD28 חרוזים לפני גירוי של תאי T. כדי לשטוף, למקם את הנפח הנדרש של חרוזים (להשתמש מספיק CD3/CD28 חרוזים ליחס של 3:1 חרוזים: T תאים; שים לב את הריכוז של חרוזים יכול להיות משתנה) בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 mL ו להשעות מחדש 1 מ ל TCM.
- . מקום בקשר עם מגנט
- אחרי 1 דקות, מטפי את TCM ולהשעות מחדש 1 מ ל של TCM טריים לשטוף את החרוזים.
- חזור על הליך זה עבור שלושה שוטפים בסך הכל.
- לאחר השטיפה השלישית, השהה מחדש את החרוזים ב 1 מ ל של TCM.
- . תספור את תאי הטי
- העברת חרוזים לתאי T ביחס של 3:1 חרוזים: תאים.
- לדלל תאים לריכוז הסופי של 1 x 106 תאים/mL.
- מודטה ב 37 ° c, 5% CO2 עבור 24 שעות.
- העברה והתמרה של תאים
- לבצע את העבודה האנטי ויראלית באמצעות BSL-2 + אמצעי זהירות, כולל ביגוד תרבות התא, ציוד מגן אישי, חיטוי של חומרים משומשים עם אקונומיקה לפני הסילוק.
- לרכוש מבנה CART19 בתוך וקטור לויראלי.
הערה: המבנה CART19 מנוצל כאן תוכנן ולאחר מכן מסונתז דה נובו באמצעות מסחרית זמין מסחרי סינתזה החלבון. בניית הרכב שוכפלה לאחר מכן הדור השלישי לווירוס בשליטה של מקדם EF-1α. קטע האזור של משתנה הרשת נגזר משיבוט FMC63 ומזהה את CD19 האנושי. המבנה הCAR19 בעל דור שני 4-1BB מגירוי וגירוי CD3ζ (FMC63-41BBz). מיכל בן 12 - ביצוע הפקה ויראלי כמתואר בעבר. מיכל בן 12
- בקצרה, כדי לייצר וירוס, לנצל תאים 293T שהגיעו 70-90% שליטה.
- אפשר דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר של ריאגנטים החצייה כולל 15 μg של הפלסטיות הפלאנטי ויראלי של עניין, 18 μg של מחסום במחסום/פול/תאת/הפוך אריזה וקטור, 7 μg של vsv-G מעטפה וקטור, 111 μl של הקדם-complexing מגיב, 129 μl של ה מגיב החצייה, ו 9.0 mL של מדיום החצייה לפני הוספת התאים 293T. לאחר מכן התרבות התאים הטרנסג ב 37 ° c, 5% CO2.
- הקציר, צנטריפוגה (900 x g עבור 10 דקות), מסנן (0.45 מסנן ניילון μM), ולהתרכז supernatant ב 24 ו 48 h על ידי ביטול הארכה ב או 13,028 x g עבור 18 h או 112,700 x g עבור 2 h.
- הקפא ב-80 ° c לשימוש עתידי.
- ביום 1, בעדינות מחדש את התאים t כדי לשבור את רוזטות טות של תאי t שהיו מגורה על 1 x 106/mL ביום 0.
- תחת המתאים BSL-2 + אמצעי זהירות עבור כל העבודה האנטי ויראלית, להוסיף וירוס טרי או מוקפא לתאי T מגורה בריבוי של זיהום (מוי) של 3.0.
- רכב-T הרחבה תא
- במהלך שלב של התרחבות, להמשיך להוסיף את תאי T מתתמרים ב 37 ° c, 5% CO2. ספירת רכב-T תאים בימים 3 ו-5, ולהוסיף טריים, מחומם מראש כדי התרבות כדי לשמור על מכונית-T ריכוז תא של 1 x 106/Ml.
- הסרת חרוזים מתאי T שעברו התמרה 6 ימים לאחר גירוי (יום 6) באמצעות מגנט. קציר, השהה מחדש, והמקום תאים T ב 50 מ"ל צינורות חרוטי ב מגנט עבור 1 דקות. לאחר מכן לאסוף את supernatant (מכיל את התאים-T רכב), ולהשליך את החרוזים.
- למקם את התאים שנאספו-T בחזרה בתרבות בריכוז של 1 x 106 תאים/mL כדי לחדש את ההתרחבות.
- ביום 6, לאמוד את הביטוי פני השטח של המכונית על ידי הזרמת cy, לנסות.
הערה: מספר שיטות ניתן להשתמש כדי לזהות את הביטוי פני השטח של מכונית, כגון כתמים עם העין אנטי עכבר IgG (H + L) חוצה-adsorbed נוגדן משני או על ידי הצביעת עם CD19 פפטיד מסוים, מצועם ל fluorochrome. כאן, לקחת סדרת מחלקים (כ 100,000 T תאים) מן התרבות ולשטוף עם מאגר זרימה הכין עם מלוחים פוספט באגירה של dulbecco, 2% סרום העוברי העובר, ו 1% נתרן azide. להכתים את התאים עם נוגדן נגד מכונית ולשטוף פעמיים. הכתם את התאים עם כתם חי/מת ונוגדנים CD3 שבטיים (OKT3). שטוף את התאים והשהה מחדש במאגר הזרימה. לרכוש על cytometer כדי לקבוע התמרה יעילות.
- הקפאה קריוגנית
- כדי הקציר והקפאת המכונית-T תאים 8 ימים לאחר גירוי (יום 8 של הרחבת התא T), לקצור את התאים מן התרבות.
- ספין למטה עבור 5 דקות ב 300 x g.
- להשעות מחדש ב הקפאה בינונית ב 10,000,000 תאים לכל mL למבחנה בהקפאה בינונית המורכבת 10% דימתיל תיל סולפוקסיד ו 90% העובר סרום.
- להקפיא במיכל קפוא כדי להשיג שיעור קירור של 1 ° c/min ב-80 מקפיא ° c ולאחר מכן להעביר לחנקן נוזלי אחרי 48 h.
- לפני השימוש שלהם בתוך מבחנה או בניסויים vivo, הפשרת תאים רכב T ב-TCM חם.
- לשטוף את התאים כדי לדלל ולהסיר את diמתיל סולפוקסיד ולהשעות מחדש לריכוז של 2 x 106 תאים/ML ב TCM חם. מנוחה ללילה ב 37 ° c, 5% CO2.
2. GM-שדרתי הייצור k/o CART19
- כדי לשבש את מג-שדרתי, לנצל את מדריך RNA (grna) המיקוד אקסון 3 של האדם GM-שדרתי (CSF2) נבחר באמצעות הקרנת grna בעבר דיווחו כי יש יעילות גבוהה עבור הגן CSF2 המקודד עבור ציטוקינים האנושית GM-שדרתי. מיכל בן 14
הערה: מחקר מסחרי מסונתז כיתה Cas9 הדור השלישי לבנה ויראלי המכיל gRNA זה (תחת מקדם U6) שימש. המבנה מכיל גן התנגדות מpuromycin. הרצף של הגרנה הוא גאקTGCCTGACTTTTTTTTTT. מיכל בן 12 - כדי לייצר וירוס, לנצל 293T תאים שהגיעו 70-90% שליטה.
- הרשו 15 μg של הפלסטיות הפלנגיאני של הריבית, 18 μg של מחסום במחסום/פול/תאת/הפוך אריזה וקטור, 7 μg של VSV-G מעטפה וקטור, 111 μL של הגיב טרום השלמת, 129 μL של מגיב החצייה, ו 9.0 mL של בינונית העברה כדי דגירה עבור 30 דקות בחדר te . מטבע הספרות
- הוספת ריאגנטים לזיהום ה293t תאי t. ואז התרבות ב 37 ° c, 5% CO2.
- הקציר, צנטריפוגה (900 x g עבור 10 דקות), מסנן (0.45 מסנן ניילון μM) ולהתרכז supernatant ב 24 ו 48 h על ידי ביטול הארכה ב-13,028 x g עבור 18 h או 112,700 x g עבור 2 h ו להקפיא ב-80 ° צ' לשימוש עתידי.
- ביום 1, השהה מחדש בעדינות את תאי T כדי להפריד בין רוטות.
- ב BSL-2 + מעבדה מאושרת, להוסיף וירוס קפוא או שנקטפו טרי לתאי T מגורה כדי ליצור תאים מכונית-T. השני תאים עם שניהם CAR19 הנגיף ו-GM-שדרתי מיקוד כשנגיף CRISPR. הוספת CAR19-וירוס ב-משרד הבית של 3. מאז טיטור של הנגיף crispr לא ניתן לביצוע, שימוש חלקיקי וירוס שנוצר מ 15 הכנה בלתי מבוקר הפלסטיות לשנות 10 x 106 תאים T.
- עיין בשלבים הנותרים של גירוי בתאי T, התרחבות והקפאה כמתואר בשלב 1.
- עבור lentiCRISPR-בעריכת תאי T הנושאים puromycin עמידות, לטפל בתאים עם puromycin דיהידרוטסטוסטרון בריכוז של 1 μg של puromycin per 1 mL ביום 3 ויום 5.
3. GM-שדרתי שיבוש יעילות והערכה פונקציונלית של GM-שדרתי k/o CART19
- בדיקות וניתוח מעקב אחר הפרעות ברצף
- כדי לסדר את הריבית בגנים של ג'נרל מוטורס, השתמש בצבעי היסוד הבאים. להשתמש ברצף פריימר קדימה עבור GM-שדרתי (CSF2) של TGACTACAGAGGCACAGA, ואת הרצף פריימר הפוכה של TCACCTCגנול ACCTCATTAACC.
- לחלץ DNA מ עד 5,000,000 מכונית-T תאים עם ערכת החילוץ גנומית. עבור התגובה PCR, השתמש 25 μl של מיקס מאסטר taq לכל תגובה עם ריכוז סופי של כל פריימר בתגובת ה-pcr של μm, 0.1-0.5 μg של DNA תבנית, וכמות כוללת של תגובת ה-PCR הביא עד 50 μl עם מים חינם נוקלאז.
- עיין בתנאי האופניים של ה-PCR המתוארים בטבלה 1.
- הפעל דגימות PCR על 1-2% agarose ג'ל ב 100 V עבור 30 דקות ולחלץ באמצעות ערכת החילוץ ג'ל.
- . רצף הגברה של הPCR חשב את תדירות השינוי של אלל על-ידי העלאת נתונים גולמיים לתוכנת גאות מתאימה. מיכל בן 15
- GM-שדרתי הייצור והערכה פונקציונלית של GM-שדרתי CART19k/o
- כדי לקבוע את הייצור ציטוקינים של מכונית-T תאים, דגירה סוג פראי CART19 תאים GM-שדרתיk/o CART19 עם CD19 ביטוי חריפה לוקמיה לימפובלסטית קו NALM6 ביחס 1:5 עבור 4 h ב 37 ° צ', 5% CO2 בנוכחות monensin הפתרון, האנטי-אנושי CD49d, CD28 אנטי-אנושי והCD107a האנטי-אנושי.
- הקציר תאים מהתרבות עבור cy, לזרום הציטונסה. לשטוף את התאים עם מאגר cy, הזרימה. כתם את התאים עם ערכת מכתים חי/מת. מודטה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. תקן את התאים עם מדיום קיבעון ו-דגירה בחושך בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.
- לאחר כביסה, כתם את התאים הintracellularly עם בינוני החדירות בשילוב עם נוגדן אנטי אנושי IFNγ שבטיים, אנטי אדם GM-שדרתי, אנטי אדם MIP-1β, אנטי אדם IL-2, ו אנטי אדם CD3 ו דגירה בחושך בטמפרטורת החדר עבור 30 min. שטוף והשהה מחדש את הדגימות. לרכוש דגימות על cytometer זרימה מנותח עבור אחוז של הביטוי התאיים GM-שדרתי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מראה הפחתה של gm-שדרתי ב gm-שדרתי CART19 תאיםk/o . כדי לוודא כי הגנום של התאים T שונתה לנוקאאוט GM-שדרתי, רצף הגאות שימש בתאי GM/o CART19 (איור 1a). רכב-T תא המשטח הצביעת מוודאת כי התאים T לבטא בהצלחה את קולטן פני השטח של המכונית בחוץ גופית על ידי העליה על live CD3 + תאים (איור 1B). כתמים תאיים של GM-שדרתי על ידי הזרימה cy, לנסות ממחיש ירידה ביטוי של GM-שדרתי ב GM-שדרתי CART19 תאיםk/o על ידי באמצעות באמצעות לחיות CD3 + תאים, אימות הצלחה פונקציונלית של נוקאאוט (איור 1c). GM-מחשב מסוגk/o מכונית-t התצוגה הירידה בשנת GM-שדרתי לעומת ווילטיפוס ANTI-CD19 רכב-t תאים (CART19) באמצעות כתמים תאיים (איור 1b). בנוסף, יש לנו בעבר הראו כי GM-שדרתיk/o רכב-T תאים להפחית את הייצור של gm-שדרתי תוך שיפור פעילות אנטי סרטניים והישרדות בהשוואה לתאי הרכב-T wildtype ב vivo. מיכל בן 12
| צעד | טמפ ' (° צ') | זמן | מחזורי |
| דנטורציה ראשונית | 94 | 3 דקות | 1 |
| דנטורציה | 94 | 45 שניות | 35 |
| ריפוי | 60 | 30 שניות | |
| סיומת | 72 | 2 דקות | |
| פוסט-אלונגציה | 72 | 10 דקות | 1 |
| 4 | ∞ |
טבלה 1: PCR תנאי אופניים עבור רצף הגאות של GM-שדרתי CART19 תאיםk/o .
איור 1 : ג'נרל מוטורסk/o CART19 תאים להראות הפחתת GM-שדרתי. A) רצף הגאות הייצוגית מוודאת שינוי הגנום של GM-שדרתי CRISPR/Cas9 gm-שדרתי את התאיםk/o CART19 עם יעילות הפרעה של ~ 71%. ב) מתווה זרימה ייצוגית מתארים מוצלחת רכב-T הייצור תאים עם ביטוי רכב דומה על פראי סוג CART19 ו GM-שדרתיk/o CART19. ג) כפי שאסף על ידי כתמים תאיים, gm-שדרתיk/o CART19 תאים להראות מופחת GM-שדרתי לעומת סוג פראי CART19 כאשר מגורה עם CD19 חיובי כל תא התא NALM6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדו ח זה, אנו מתארים מתודולוגיה לניצול CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה כדי לגרום שינויים משניים בתאי רכב-T. באופן ספציפי, זה מוצג באמצעות התמרה ויראלית עם וקטור ויראלי המכיל gRNA מיקוד הגן של עניין Cas9 לייצר GM-שדרתי התאיםk/o CART19. הצגנו בעבר כי הניטרול של GM-שדרתי נטרול קילה CRS ו-NT במודל מבע. 12 כפי שתוארה בעבר, GM-שדרתי מכוניותk/o מכונית T לאפשר עיכוב של gm-שדרתי במהלך תהליך הייצור, ביעילות להפחית את הייצור של gm-שדרתי תוך שמירה על פונקציות קריטיות אחרות תא T, והתוצאה משופרת הפעילות נגד הגידול vivo בהשוואה לתאי מכונית-T wildtype. מיכל בן 12
מאז שילוב קבוע של Cas9 בגנום יכול להיות משויך אפקטים לא רצויים כאשר מתורגם מוצר בר קיימא קלינית, אנו מציעים את המתודולוגיה הספציפית הזאת כדרך להפיק כיתה מחקר CRISPR/Cas9 שונה CART19 עבור הוכחת הרעיון ניסויים.
בעוד התאים CAR-T להחזיק הבטחה בטיפול בסרטן,1,2 יעילותם יכול להמשיך להיות משופר ושלהם רעילות הקשורים בשליטה טובה יותר. CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה מספקת אסטרטגיה ישירות למקד את הגנום של מכונית-T תאים למהנדס פתרונות ליקויים קליניים הנוכחי. במאמר זה, אנו מתארים את הדור של GM-שדרתי CART19 תאיםk/o .
ג'נרל מוטורסk/o מכונית-t התאים נוצרו על ידי התמרה עם וקטור העדשה לרכב-t הפלזמה תא מבנה וירוס מכיל מדריך RNA כדי GM-שדרתי ו Cas9. כדי לייצר את GM-החמצן k/o, הדור השלישי בניית וירוס (lentiCRISPRv2) המכיל Cas9 ודיווח יעילות גבוהה מדריך RNA (grna) מיקוד אקסון 3 של האדם GM-שדרתי (CSF2)14 תחת השליטה של מקדם U6 היה מנוצל. טיפול מיוחד יש לנקוט במהלך השלבים התמרה של ההליך כמו אלה הם הקריטיים ביותר לפיתוח של תאים רכב-T שונה. יעילות הנוקאאוט יכול להיות מאומת ומוערך באמצעות מעקב אחר של indels על ידי התפרקות (הגאות) רצפים. הפעילות הפונקציונלית של התאים CAR-T נחקר באמצעות גירוי ספציפי אנטיגן של בניית רכב עם CD19 + תאים היעד, ואחריו מדידה של פונקציות שונות תא T, כולל ייצור של GM-שדרתי. 12 של הערה, כתמים עבור ביטוי רכב עם נוגדן נגד העכבר להתרחש לפני מכתים נוגדנים אחרים עם שני שוטף המתרחשים לפני פני השטח בעקבות משתנה בודד באזור המשתנה של CART19 להיות של מוצא העכבר. זוהי נקודה של הדגשה בצרות ירי אם ביטוי רכב טוב לא נצפתה בתחילה.
אלה שונה בתאי רכב-T ניתן להשתמש במחקרים מבחנה ובדגמי vivo מבע עבור הוכחת ניסויים המושג. היתרון של טכניקה זו היא כי הייצור תא T רכב ומניפולציה גנטית יכולים להתרחש בשלב אחד עם יעילות טובה לעומת טכניקות אחרות. מיכל עשור , 11 בעוד התמרה כפולה ויראלית היא שיטה נוחה ויעילה כדי לייצר כיתה מחקר GM-שדרתיk/o CART19 תאים, ה-DNA משולבים הגנום וביטוי ממושך Cas9 עלול לערער את הגנום ולהגדיל את סכנת השפעות מחוץ ליעד. מגבלה של טכניקה זו היא כי טוב-ייצור מיקוד כיתה העבודה ידרוש שינוי של הטכניקה כדי ribonucleoprotein crispr/Cas9 מערכת כמו מתודולוגיה זו אינה תוצאה התאגדות קבועה של Cas9 לתוך הגנום ו מפחית את הפוטנציאל לאפקטים מחוץ ליעד. המתודולוגיה המתוארת בפרוטוקול כאן יכול להיות מיושם על מגוון של גנים כדי לשנות גנטית בתאי רכב-T באמצעות CRISPR/Cas9 כדי לעזור לייצר פחות רעיל או יעיל יותר תאים מכונית-T.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SSK הוא ממציא על פטנטים בתחום של מכונית T-cell טיפול אשר מורשים Novartis (תחת הסכם בין מאיו קליניק, אוניברסיטת פנסילבניה, ונוברטיס). מחקרים אלה מומנו בחלקו על ידי מענק של הומניגה (SSK). RMS, MJC, RS, ו-SSK הם ממציאים על פטנטים הקשורים לעבודה זו. המעבדה (SSK) מקבלת מימון מ סובלנות, הומניניאן, עפיפון, לנטיגן, מורורסיס, ואקטינום.
Acknowledgments
עבודה זו היתה נתמכת באמצעות מענקים מ K12CA090628 (SSK), הלאומי סרטן מקיף ברשת (SSK), מרכז הקליניקה של מאיו עבור הרפואה האישית (SSK), קרן Predolin (SSK), משרד מרפאת מאיו של תרגום לתרגול (SSK), ו התוכנית מדען רפואי מאיו מרפאת הדרכה רוברט ל. האוול מלגה מדען (RMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Fixation Medium (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge) |
GenScript | N/A | custom order |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Desktop Genetics | ||
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Monensin Solution, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | ATCC | CRL-3273 | acute lymphoblastic leukemia cell line |
| Nuclease Free Water | Promega | P119C | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane 0.45uM | Thermo Scientific Nalgene | 450-0045 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Permeabilization Medium (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| Rat Anti-Human GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
References
- Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Schuster, S. J., et al. Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Gust, J., et al. Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
- Fitzgerald, J. C., et al. Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia. Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).
- Liu, X., Zhao, Y. CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy. Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).
- Ren, J., Zhao, Y. Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9. Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).
- Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. , (2018).
- Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
