Utilizzo di CRISPR/Cas9 per eliminare GM-CSF nelle celle CAR-T
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per modificare geneticamente le cellule CAR-T tramite un sistema CRISPR/Cas9.
Abstract
La terapia cellulare T (CAR-T) del recettore dell’antigene chimerico è una nuova opzione di trattamento all’avanguardia e potenzialmente rivoluzionaria per il cancro. Tuttavia, ci sono limitazioni significative al suo uso diffuso nel trattamento del cancro. Queste limitazioni includono lo sviluppo di tossicità uniche come la sindrome del rilascio di citochine (CRS) e neurotossicità (NT) e l’espansione limitata, le funzioni degli efumani e l’attività anti-tumorale nei tumori solidi. Una strategia per migliorare l’efficacia car-T e/o la tossicità del controllo delle cellule CAR-T consiste nel modificare il genoma delle cellule CAR-T stesse durante la produzione di cellule CAR-T. Qui, descriviamo l’uso dell’editing del gene CRISPR/Cas9 nelle cellule CAR-T attraverso la trasduzione con un costrutto lentivirale contenente un RNA guida al granulocito macrofato fattore stimolante della colonia (GM-CSF) e Cas9. Ad esempio, descriviamo CRISPR/Cas9 mediato knockout di GM-CSF. Abbiamo dimostrato che queste cellule GM-CSFk/o CAR-T producono efficacemente meno GM-CSF, pur mantenendo la funzione critica delle cellule T e si traducono in una maggiore attività antitumorale in vivo rispetto alle cellule CAR-T di tipo selvatico.
Introduction
La terapia cellulare T (CAR-T) del recettore dell’antigene chimerico è una grande promessa nel trattamento del cancro. 1 : il nome del , 2 Due terapie cellulari CAR-T rivolte a CD19 (CART19) sono state recentemente approvate negli Stati Uniti e in Europa per l’uso in neoplasie delle cellule B dopo aver dimostrato risultati sorprendenti negli studi clinici multicentri. 3 (COM del nome , 4 DEL psu’ , 5 Le barriere all’uso più diffuso delle cellule CAR-T sono attività limitate nei tumori solidi e nelle tossicità associate, tra cui la sindrome di rilascio di citochine (CRS) e la neurotossicità (NT). 3 (COM del nome , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9 Per migliorare l’indice terapeutico della terapia cellulare CAR-T, vengono impiegati strumenti di ingegneria genomica come nucleasi di dita di zinco, TALEN e CRISPR per modificare ulteriormente le cellule CAR-T nel tentativo di generare cellule CAR-T meno tossiche o più efficaci. 10 del sistema , 11 Del sistema di
In questo articolo viene descritto un metodo per generare celle CAR-T modificate CRISPR/Cas9. L’obiettivo specifico di questo metodo è quello di modificare geneticamente le cellule CAR-T durante la produzione di cellule CAR-T tramite CRISPR/Cas9 per generare cellule CAR-T meno tossiche o più efficaci. La motivazione per sviluppare questa metodologia si basa sulle lezioni apprese dall’esperienza clinica della terapia cellulare CAR-T, che indica un’urgente necessità di nuove strategie per aumentare la finestra terapeutica della terapia cellulare CAR-T e per estendere l’applicazione in altri tumori ed è supportato dai recenti progressi nella biologia sintetica che consentono più modifiche di cellule CAR-T che hanno iniziato ad entrare nella clinica. Mentre diversi strumenti di ingegneria genomica sono in fase di sviluppo e applicazione in diversi ambienti, come le nucleasi di dita di zinco, i TALENs e il CRISPR, la nostra metodologia descrive la modifica CRISPR/Cas9 delle cellule CAR-T. 10 del sistema , 11 CRISPR/Cas9 è un meccanismo di difesa batterico basato sull’RNA progettato per eliminare il DNA estraneo. CRISPR si basa su endonucleasi per fendere una sequenza bersaglio identificata attraverso un RNA guida (gRNA). L’editing CRISPR delle cellule CAR-T offre diversi vantaggi rispetto ad altri strumenti di ingegneria genomica. Questi includono la precisione della sequenza di gRNA, la semplicità di progettare un gRNA che colpisca il gene di interesse, l’elevata efficienza di editing genico e la capacità di indirizzare più geni poiché più gRNA possono essere utilizzati contemporaneamente.
In particolare nei metodi qui descritti, abbiamo usato un lentivirus che codifica l’RNA e la guida CRISPR per interrompere un gene durante la trasduzione CAR delle cellule T. Nella scelta di una tecnica appropriata per modificare le cellule CAR-T, suggeriamo che la tecnica descritta di seguito sia un meccanismo efficiente per generare cellule CAR-T di grado di ricerca, ma poiché l’effetto a lungo termine dell’integrazione permanente del Cas9 nel genoma è sconosciuto, non è noto proporre questa metodologia per sviluppare prove di ricerca di grado CAR-T cellule, ma non per la produzione di buona pratica di produzione grado CAR-T cellule.
In particolare, qui descriviamo la generazione di granulociti colonia macrofato stimolante fattore di stimolazione (GM-CSF) knockout cellule CAR-T di mira persone umane CD19. Queste cellule CAR-T sono state generate dalla trasduzione con particelle lentivirali che codificano una guida RNA specifica di GM-CSF (gene name CSF2) e Cas9. In precedenza abbiamo scoperto che la neutralizzazione GM-CSF migliora CRS e NT in un modello di xenotrapianto. 12 cellule GM-CSFk/o CAR-T consentono l’inibizione di GM-CSF durante il processo di produzione, riducendo efficacemente la produzione di GM-CSF migliorando nel contempo l’attività antitumorale delle cellule CAR-T e la sopravvivenza in vivo rispetto alle cellule CAR-T di tipo selvatico. 12 Così, qui forniamo una metodologia per generare cellule CAR-T modificate CRISPR/Cas9.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo rapporto, descriviamo una metodologia per utilizzare la tecnologia CRISPR/Cas9 per indurre modifiche secondarie nelle cellule CAR-T. In particolare, questo è dimostrato utilizzando la trasduzione lentivirale con un vettore virale che contiene gRNA mirando al gene di interesse e Cas9 per generare cellule GM-CSFk/o CART19. In precedenza avevamo dimostrato che la neutralizzazione GM-CSF migliora CRS e NT in un modello di xenotrapianto. 12 Come descritto in precedenza, le cellule…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto attraverso sovvenzioni da K12CA090628 (SSK), la National Comprehensive Cancer Network (SSK), il Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), la Predolin Foundation (SSK), l’Ufficio Mayo Clinic of Translation to Practice (SSK) e il programma di formazione Per studenti della Mayo Clinic Medical Scientist Robert L. Howell Medical-Scientist Scholarship (RMS).
Materials
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Fixation Medium (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge) |
GenScript | N/A | custom order |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Desktop Genetics | ||
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Monensin Solution, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | ATCC | CRL-3273 | acute lymphoblastic leukemia cell line |
| Nuclease Free Water | Promega | P119C | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.45uM, sterile | Genesee Scientific | 25-228 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Permeabilization Medium (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| Rat Anti-Human GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
References
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