Summary
Qui, presentiamo un protocollo per modificare geneticamente le cellule CAR-T tramite un sistema CRISPR/Cas9.
Abstract
La terapia cellulare T (CAR-T) del recettore dell'antigene chimerico è una nuova opzione di trattamento all'avanguardia e potenzialmente rivoluzionaria per il cancro. Tuttavia, ci sono limitazioni significative al suo uso diffuso nel trattamento del cancro. Queste limitazioni includono lo sviluppo di tossicità uniche come la sindrome del rilascio di citochine (CRS) e neurotossicità (NT) e l'espansione limitata, le funzioni degli efumani e l'attività anti-tumorale nei tumori solidi. Una strategia per migliorare l'efficacia car-T e/o la tossicità del controllo delle cellule CAR-T consiste nel modificare il genoma delle cellule CAR-T stesse durante la produzione di cellule CAR-T. Qui, descriviamo l'uso dell'editing del gene CRISPR/Cas9 nelle cellule CAR-T attraverso la trasduzione con un costrutto lentivirale contenente un RNA guida al granulocito macrofato fattore stimolante della colonia (GM-CSF) e Cas9. Ad esempio, descriviamo CRISPR/Cas9 mediato knockout di GM-CSF. Abbiamo dimostrato che queste cellule GM-CSFk/o CAR-T producono efficacemente meno GM-CSF, pur mantenendo la funzione critica delle cellule T e si traducono in una maggiore attività antitumorale in vivo rispetto alle cellule CAR-T di tipo selvatico.
Introduction
La terapia cellulare T (CAR-T) del recettore dell'antigene chimerico è una grande promessa nel trattamento del cancro. 1 : il nome del , 2 Due terapie cellulari CAR-T rivolte a CD19 (CART19) sono state recentemente approvate negli Stati Uniti e in Europa per l'uso in neoplasie delle cellule B dopo aver dimostrato risultati sorprendenti negli studi clinici multicentri. 3 (COM del nome , 4 DEL psu' , 5 Le barriere all'uso più diffuso delle cellule CAR-T sono attività limitate nei tumori solidi e nelle tossicità associate, tra cui la sindrome di rilascio di citochine (CRS) e la neurotossicità (NT). 3 (COM del nome , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9 Per migliorare l'indice terapeutico della terapia cellulare CAR-T, vengono impiegati strumenti di ingegneria genomica come nucleasi di dita di zinco, TALEN e CRISPR per modificare ulteriormente le cellule CAR-T nel tentativo di generare cellule CAR-T meno tossiche o più efficaci. 10 del sistema , 11 Del sistema di
In questo articolo viene descritto un metodo per generare celle CAR-T modificate CRISPR/Cas9. L'obiettivo specifico di questo metodo è quello di modificare geneticamente le cellule CAR-T durante la produzione di cellule CAR-T tramite CRISPR/Cas9 per generare cellule CAR-T meno tossiche o più efficaci. La motivazione per sviluppare questa metodologia si basa sulle lezioni apprese dall'esperienza clinica della terapia cellulare CAR-T, che indica un'urgente necessità di nuove strategie per aumentare la finestra terapeutica della terapia cellulare CAR-T e per estendere l'applicazione in altri tumori ed è supportato dai recenti progressi nella biologia sintetica che consentono più modifiche di cellule CAR-T che hanno iniziato ad entrare nella clinica. Mentre diversi strumenti di ingegneria genomica sono in fase di sviluppo e applicazione in diversi ambienti, come le nucleasi di dita di zinco, i TALENs e il CRISPR, la nostra metodologia descrive la modifica CRISPR/Cas9 delle cellule CAR-T. 10 del sistema , 11 CRISPR/Cas9 è un meccanismo di difesa batterico basato sull'RNA progettato per eliminare il DNA estraneo. CRISPR si basa su endonucleasi per fendere una sequenza bersaglio identificata attraverso un RNA guida (gRNA). L'editing CRISPR delle cellule CAR-T offre diversi vantaggi rispetto ad altri strumenti di ingegneria genomica. Questi includono la precisione della sequenza di gRNA, la semplicità di progettare un gRNA che colpisca il gene di interesse, l'elevata efficienza di editing genico e la capacità di indirizzare più geni poiché più gRNA possono essere utilizzati contemporaneamente.
In particolare nei metodi qui descritti, abbiamo usato un lentivirus che codifica l'RNA e la guida CRISPR per interrompere un gene durante la trasduzione CAR delle cellule T. Nella scelta di una tecnica appropriata per modificare le cellule CAR-T, suggeriamo che la tecnica descritta di seguito sia un meccanismo efficiente per generare cellule CAR-T di grado di ricerca, ma poiché l'effetto a lungo termine dell'integrazione permanente del Cas9 nel genoma è sconosciuto, non è noto proporre questa metodologia per sviluppare prove di ricerca di grado CAR-T cellule, ma non per la produzione di buona pratica di produzione grado CAR-T cellule.
In particolare, qui descriviamo la generazione di granulociti colonia macrofato stimolante fattore di stimolazione (GM-CSF) knockout cellule CAR-T di mira persone umane CD19. Queste cellule CAR-T sono state generate dalla trasduzione con particelle lentivirali che codificano una guida RNA specifica di GM-CSF (gene name CSF2) e Cas9. In precedenza abbiamo scoperto che la neutralizzazione GM-CSF migliora CRS e NT in un modello di xenotrapianto. 12 cellule GM-CSFk/o CAR-T consentono l'inibizione di GM-CSF durante il processo di produzione, riducendo efficacemente la produzione di GM-CSF migliorando nel contempo l'attività antitumorale delle cellule CAR-T e la sopravvivenza in vivo rispetto alle cellule CAR-T di tipo selvatico. 12 Così, qui forniamo una metodologia per generare cellule CAR-T modificate CRISPR/Cas9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Questo protocollo segue le linee guida dell'Institutional Review Board (IRB) di Mayo Clinic e del Institutional Biosafety Committee (IBC).
1. Produzione di cellule CART19
- Isolamento, stimolazione e cultura delle cellule T
- Eseguire tutto il lavoro di coltura cellulare in una cappa di coltura cellulare utilizzando attrezzature di protezione personale appropriate. Raccogliere le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) da coni di sangue normali donatori de-identificati raccolti durante l'apheresi in quanto sono noti per essere una fonte vitale di PBMC.
- Per isolare i PBMC, aggiungere 15 mL di un mezzo di sfumatura di densità a un tubo di separazione del gradiente di densità di 50 mL. Diluire il sangue del donatore con un volume uguale di salina tampone di fosfato (PBS) contenente il 2% di siero bovino fetale (FBS) per evitare l'intrappolamento cellulare.
- Aggiungere il sangue disluito del donatore dal cono nel tubo di separazione, facendo attenzione a non disturbare l'interfaccia tra il sangue e il gradiente di densità medio. Centrifuga a 1.200 x g per 10 min a RT.
- Decant il supernatante in un nuovo conico da 50 mL, lava con PBS - 2% FBS portando fino a 40 mL, centrifuga a 300 x g per 8 min a RT, aspirato supernatante, resospensione in 40 mL di tampone, e contare le cellule.
- Isolare le cellule T dai PBMCt tramite un kit di perline magnetico a selezione negativa utilizzando un separatore di celle completamente automatizzato in base al protocollo del produttore.
- Per colturare le cellule T isolate, preparare il mezzo di cellule T (TCM) che consiste di 10% siero umano AB (v/v), 1% penicillina-streptomia-glutamina (v/v), e mezzo di cellule ematopoietiche senza siero. Sterilizzare il mezzo filtrando attraverso un filtro a vuoto sterile da 0,45 m e quindi con un filtro a vuoto sterile da 0,22 m.
- Il giorno 0 (il giorno della stimolazione delle cellule T), lavare le perle CD3/CD28 prima della stimolazione delle cellule T. Per lavare, posizionare il volume richiesto di perline (utilizzare abbastanza perline CD3/CD28 per un rapporto di 3:1 perline:cellule T; notare la concentrazione di perline può essere variabile) in un tubo sterile di microcentrifuga da 1,5 mL e risospensione in 1 mL di TCM.
- Mettere a contatto con un magnete.
- Dopo 1 min, aspirare la TCM e risospendere in 1 mL di MCM fresco per lavare le perline.
- Ripetere questa procedura per un totale di tre fumi.
- Dopo il terzo lavaggio, risospendere le perline in 1 mL di TCM.
- Contare le cellule T.
- Trasferire perline alle cellule T ad un rapporto di 3:1 perline:cellule.
- Diluire le cellule a una concentrazione finale di 1 x 106 cellule / mL.
- Incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2 per 24 h.
- Trafezione e trasduzione delle cellule T
- Svolgere il lavoro lentivirale utilizzando le precauzioni BSL-2, tra cui cappe per la coltura cellulare, dispositivi di protezione personale e disinfezione dei materiali usati con candeggina prima dello smaltimento.
- Acquisire un costrutto CART19 in un vettore lentivirale.
NOTA: Il costrutto CART19 utilizzato qui è stato progettato e poi sintetizzato de novo utilizzando un fornitore di sintesi proteica disponibile in commercio. Il costrutto CAR è stato successivamente clonato in una lentivirus di terza generazione sotto il controllo di un promotore di EF-1. Il frammento di regione variabile a catena singola è derivato dal clone di FMC63 e riconosce il CD19 umano. Il costrutto CAR19 possiede un dominio costimulatorio di seconda generazione 4-1BB e una stimolazione CD3 (FMC63-41BBz). 12 mila - Eseguire la produzione di lentivirale come descritto in precedenza. 12 mila
- In breve, per produrre lentivirus, utilizzare 293T cellule che hanno raggiunto 70-90% confluenza.
- Lasciare l'incubazione per 30 min a temperatura ambiente di reagenti di trasfezione, tra cui 15 g di plasmide lentivirali di interesse, 18 g di un vettore di imballaggio gag/pol/tat/rev, 7 g di un vettore di inviluppo VSV-G, 111 -L del reagente pre-complesso, 129 reagente di trasfezione, e 9,0 mL del mezzo di trasfezione prima di aggiungere alle cellule 293T. Poi colture le cellule trafette a 37 gradi centigradi, 5% DI CO2.
- Raccolta, centrifuga (900 x g per 10 min), filtro (filtro in nylon 0,45 M) e concentrazione di supernatante a 24 e 48 h per ultracentrifugato a 13.028 x g per 18 h o 112.700 x g per 2 h.
- Congelare a -80 gradi centigradi per un uso futuro.
- Il primo giorno, risospendere delicatamente le cellule T per rompere le rosette delle cellule T che erano state stimolate a 1 x 106/ mL il giorno 0.
- Secondo le opportune precauzioni BSL-2 per tutto il lavoro lentivirale, aggiungere il virus raccolto fresco o congelato alle cellule T stimolate ad una molteplicità di infezione (MOI) di 3.0.
- Espansione delle cellule CAR-T
- Durante la fase di espansione, continuare a incubare le cellule T trasdotte a 37 , 5% CO2. Contare le cellule CAR-T nei giorni 3 e 5 e aggiungere una MTC fresca e preriscaldata alla coltura per mantenere una concentrazione di cellule CAR-T di 1 x 106/mL.
- Rimuovere le perle dalle cellule T trasdotte 6 giorni dopo la stimolazione (Giorno 6) utilizzando un magnete. Raccogliere, risospendere e mettere le cellule T in tubi conici da 50 mL in un magnete per 1 min. Poi raccogliere il supernatante (contiene le cellule CAR-T), e scartare le perline.
- Riposizionare le cellule CAR-T raccolte in coltura a una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL per riprendere l'espansione.
- Il giorno 6, valutare l'espressione superficiale della CAR per citometria di flusso.
NOTA: Diversi metodi possono essere utilizzati per rilevare l'espressione superficiale di CAR, come la colorazione con un anticorpo secondario incrociato IgG (H-L) di capra o colorando con un peptide specifico CD19, coniugato ad un fluorocro. Qui, prendere una aliquota (circa 100.000 cellule T) dalla coltura e lavare con flusso buffer preparato con salina tampone di fosfato di Dulbecco, siero bovino fetale 2% e 1% di anzide di sodio. Macchiare le cellule con l'anticorpo anti-CAR e lavare due volte. Macchiare le cellule con macchia viva / morta e anticorpo monoclonale CD3 (OKT3). Lavare le cellule e risospendere nel buffer di flusso. Acquisire su un citometro per determinare l'efficienza della trasduzione.
- Crioconservazione delle cellule CAR-T
- Per raccogliere e crioconservare le cellule CAR-T 8 giorni dopo la stimolazione (Giorno 8 dell'espansione delle cellule T), raccogliere le cellule dalla coltura.
- Girare verso il basso per 5 min a 300 x g.
- Risospendere nel mezzo di congelamento a 10 milioni di cellule per fiala mL nel mezzo di congelamento costituito da 10% di zolfo dimeile e 90% siero bovino fetale.
- Congelare in un contenitore di congelamento per ottenere una velocità di raffreddamento di -1 oc/min in un congelatore a -80 gradi centigradi e poi trasferire in azoto liquido dopo 48 h.
- Prima del loro uso per esperimenti in vitro o in vivo, scongelare le cellule CAR-T in MTC calda.
- Lavare le cellule per diluire e rimuovere lo zolfo dimetile e ravvistare a una concentrazione di 2 x 106 cellule / mL in TCM caldo. Riposare durante la notte a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
2. Produzione GM-CSF k/o CART19
- Per interrompere GM-CSF, utilizzare una guida RNA (gRNA) mirando all'esone 3 di GM-CSF (CSF2) umano selezionato tramite screening gRNA precedentemente riportato per avere un'elevata efficienza per il gene CSF2 che codifica per la citochina umana GM-CSF. 14 Del sistema
NOTA: È stato utilizzato un costrutto lentivirale Cas9 di terza generazione di ricerca commercialmente sintetizzato contenente questo gRNA (sotto un promotore U6). Il costrutto contiene un gene di resistenza puromycina. La sequenza del gRNA è GACCTGCCTACAGACCCGCC. 12 mila - Per produrre lentivirus, utilizzare 293T cellule che hanno raggiunto 70-90% confluenza.
- Concedi 15 g di plasmide di lentivirale di interesse, 18 g di vettore di confezionamento gag/pol/tat/rev, 7 g di un vettore di inviluppo VSV-G, 111 litri del reagente pre-complesso, 129 -L della reagente di reimpostazione della trasfusione e 9,0 mL del mezzo di trasflessione da incubare per 30 min in sala mperatura.
- Aggiungere reagenti di trasfezione alle cellule 293T. Poi la coltura a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
- Raccolta, centrifuga (900 x g per 10 min), filtro (filtro in nylon 0,45 M) e concentrato supernatante a 24 e 48 h per ultracentrifugato a 13.028 x g per 18 h o 112.700 x g per 2 h e congelare a -80 gradi per un uso futuro.
- Il primo giorno, risospendere delicatamente le cellule T per rompere le rosette.
- In un laboratorio approvato da BSL-2, aggiungere il virus congelato o appena raccolto alle cellule T stimolate per generare cellule CAR-T. Traduci le cellule T sia con il lentivirus CAR19 che con GM-CSF che prendono di mira il lentivirus CRISPR. Aggiungere il lentivirus CAR19 a un MOI di 3. Poiché la titolazione del lentivirus CRISPR non era fattibile, utilizzare particelle di virus generate da una preparazione plasmid di 15 ug per trasdurre 10 x 106 cellule T.
- Vedere i passaggi rimanenti della stimolazione, l'espansione e la crioconservazione delle cellule T, come descritto nel passaggio 1.
- Per le cellule T modificate da lentiCRISPR che trasportano una resistenza puromycin, trattare le cellule con puromicina di idrocloruro ad una concentrazione di 1 g di puromycina per 1 mL il giorno 3 e il giorno 5 .
3. Efficienza dell'interruzione GM-CSF e valutazione funzionale di GM-CSF k/o CART19
- Efficienza di interruzione GM-CSF: monitoraggio degli indels mediante sequenziamento e analisi della decomposizione (TIDE)
- Per sequenziare l'esone di interesse per il gene GM-CSF, utilizzare i seguenti primer. Utilizzare una sequenza di primer in avanti per GM-CSF (CSF2) di TGACTACAGAGGCAGAE e una sequenza di primer inversa di TCACCTCTGACCTCATTAACC.
- Estrarre DNA da fino a 5 milioni di cellule CAR-T con un kit di estrazione genomica. Per la reazione PCR, utilizzare 25 l di un mastermix Taq per reazione con una concentrazione finale di ogni primer nella reazione PCR di :M, 0,1-0,5 g di DNA modello, e un volume totale della reazione PCR ha portato fino a 50 l con acqua priva di nuclesi.
- Vedere le condizioni di ciclo PCR descritte nella Tabella 1.
- Eseguire campioni di PCR su un gel di agarose 1-2% a 100 V per 30 min ed estrarre utilizzando un kit di estrazione gel.
- amplificatori PCR di sequenza. Calcola la frequenza di modifica degli alleli caricando i dati grezzi in un software TIDE appropriato. 15 Mi lasa del sistema
- Produzione GM-CSF e valutazione funzionale di GM-CSFk/o CART19
- Per determinare la produzione di citochine di cellule CAR-T, incubare cellule di tipo selvatico CART19 e GM-CSFk/o CART19 con il CD19 che esprime la linea cellulare linfoblastica acuta NALM6 a un rapporto di 1:5 per 4 h a 37 gradi centigradi, 5% di CO2 in presenza di monensina soluzione, CD49d anti-umano, CD28 anti-umano e CD107a anti-umano.
- Raccogli cellule dalla coltura per la citometria di flusso. Lavare le cellule con buffer di citometria di flusso. Macchia le cellule con un kit di colorazione vivo / morto. Incubare al buio a temperatura ambiente per 15 min. Fissare le cellule con un mezzo di fissaggio e incubare al buio a temperatura ambiente per 15 min.
- Dopo il lavaggio, macchia le cellule intracellularialmente con il mezzo di permeabilizzazione in combinazione con anticorpo monoclonale anti-umano IFN, anti-umano GM-CSF, MIP-1, IL-2 anti-umani e CD3 anti-umano e incubare al buio a temperatura ambiente per 30 min. Lavare e sospendere i campioni. Acquisire campioni su un citometro di flusso e analizzati per la percentuale di espressione intracellulare GM-CSF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figura 1 mostra la riduzione di GM-CSF nelle celle GM-CSFk/o CART19. Per verificare che il genoma delle cellule T sia stato alterato per eliminare la GM-CSF, il sequenziamento TIDE è stato utilizzato nelle cellule GM-CSFk/o CART19 (Figura 1A). La colorazione della superficie delle cellule CAR-T verifica che le cellule T esprimano con successo il recettore della superficie CAR in vitro gating su cellule CD3 in tempo reale (Figura1B). La colorazione intracellulare di GM-CSF per citometria di flusso dimostra una diminuzione dell'espressione di GM-CSF nelle cellule GM-CSFk/o CART19 mediante gating su cellule CD3 in tempo reale, verificando il successo funzionale del knockout (Figura 1C). Le cellule GM-CSFk/o CAR-T presentano una diminuzione della GM-CSF rispetto alle cellule CAR-T wildtype (CART19) tramite colorazione intracellulare (Figura 1B). Inoltre, abbiamo dimostrato in precedenza che le cellule GM-CSFk/o CAR-T riducono la produzione di GM-CSF migliorando al contempo l'attività anti-tumorale e la sopravvivenza rispetto alle cellule CAR-T di tipo selvatico in vivo. 12 mila
| passo | Temp (C) | ora | Cicli |
| Denaturazione iniziale | 94 (in questo stato del sistema | 3 min | 1 : il nome del |
| Denaturazione | 94 (in questo stato del sistema | 45 sec | 35 Mi lasa |
| ricottura | 60 del sistema | 30 sec | |
| interno | 72 del 179 | 2 min | |
| Post-allungamento | 72 del 179 | 10 min | 1 : il nome del |
| 4 DEL psu' | ∞ |
Tabella 1: Condizioni di ciclismo PCR per il sequenziamento TIDE delle cellule GM-CSFk/o CART19.
Figura 1 : GM-CSFk/o Le celle CART19 mostrano una riduzione di GM-CSF. A) Una sequenza TIDE rappresentativa verifica l'alterazione del genoma delle cellule GM-CSF CRISPR/Cas9 GM-CSFk/o CART19 con un'efficienza di interruzione del 71%. B) I grafici di flusso rappresentativi raffigurano una produzione di cellule CAR-T di successo con un'espressione CAR simile sul tipo selvaggio CART19 e GM-CSFk/o CART19. C) Come analizzato dalla colorazione intracellulare, le cellule GM-CSFk/o CART19 mostrano una riduzione GM-CSF rispetto al tipo selvaggio CART19 se stimolata con la linea cellulare ALL positiva CD19 NALM6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In questo rapporto, descriviamo una metodologia per utilizzare la tecnologia CRISPR/Cas9 per indurre modifiche secondarie nelle cellule CAR-T. In particolare, questo è dimostrato utilizzando la trasduzione lentivirale con un vettore virale che contiene gRNA mirando al gene di interesse e Cas9 per generare cellule GM-CSFk/o CART19. In precedenza avevamo dimostrato che la neutralizzazione GM-CSF migliora CRS e NT in un modello di xenotrapianto. 12 Come descritto in precedenza, le cellule GM-CSFk/o CAR-T consentono l'inibizione di GM-CSF durante il processo di produzione, riducono efficacemente la produzione di GM-CSF mantenendo altre funzioni critiche delle cellule T e l'attività antitumorale in vivo rispetto alle cellule CAR-T di tipo selvatico. 12 mila
Poiché l'integrazione permanente di Cas9 nel genoma potrebbe essere associata a effetti indesiderati quando tradotto in un prodotto clinicamente fattibile, proponiamo questa metodologia specifica come un modo per generare un grado di ricerca CRISPR/Cas9 modificato CART19 per la prova di concetto Esperimenti.
Mentre le cellule CAR-T promettono nella terapia del cancro,1,2 la loro efficacia può continuare ad essere migliorata e le loro tossicità associate meglio controllate. La tecnologia CRISPR/Cas9 fornisce una strategia per indirizzare direttamente il genoma delle cellule CAR-T per progettare soluzioni alle attuali carenze cliniche. In questo articolo viene descritta la generazione di cellule GM-CSFk/o CART19.
Le cellule GM-CSFk/o CAR-T sono state generate dalla trasduzione con un vettore lentivirale per il plasmide di cellule CAR-T e un costrutto di lentivirus contenente un RNA guida a GM-CSF e Cas9. Per generare il GM-CSFk/o, è stato utilizzato un costrutto di lentivirus di terza generazione (lentiCRISPRv2) contenente Cas9 ed è stata utilizzata una guida ad alta efficienza riportata RNA (gRNA) mirata all'esone 3 di GM-CSF (CSF2)14 sotto il controllo di un promotore U6. Particolare attenzione deve essere presa durante le fasi di trasduzione della procedura in quanto queste sono le più importanti per lo sviluppo delle cellule CAR-T modificate. L'efficienza delle eliminazioni può essere verificata e valutata monitorando gli indels mediante sequenze di decomposizione (TIDE). L'attività funzionale delle cellule CAR-T è studiata attraverso la stimolazione specifica dell'antigene del costrutto CAR con cellule bersaglio CD19, seguita dalla misurazione di diverse funzioni delle cellule T, compresa la produzione di GM-CSF. 12 Di nota, la colorazione per l'espressione CAR con un anticorpo antito-tono di capra deve avvenire prima di altre colorazioni anticorpali con due fusi che si verificano prima della colorazione superficiale a causa del frammento di regione variabile a catena singola del CART19 di origine del topo. Questo è un punto di enfasi nel tiro a fuoco se una buona espressione CAR non viene inizialmente osservata.
Queste cellule CAR-T modificate possono essere utilizzate in studi in vitro e in vivo modelli di xenotrapianto per esperimenti proof of concept. Un vantaggio di questa tecnica è che la produzione di cellule CAR-T e la manipolazione genetica possono entrambi verificarsi in un unico passaggio con una buona efficienza rispetto ad altre tecniche. 10 del sistema , 11 Mentre la doppia trasduzione lentivirale è un metodo conveniente ed efficace per generare cellule GM-CSFk/o CART19 di grado di ricerca, il DNA viene incorporato nel genoma e l'espressione prolungata di Cas9 può destabilizzare il genoma e rischio di effetti fuori target. Una limitazione di questa tecnica è che i knockout di grado di buona pratica di produzione richiederebbero la modifica della tecnica ad un sistema di ribonucleoproteina CRISPR/Cas9 in quanto questa metodologia non comporta l'incorporazione permanente di Cas9 nel genoma e riduce il potenziale di effetti fuori target. La metodologia qui descritta può essere potenzialmente applicata a una varietà di geni per modificare geneticamente le cellule CAR-T tramite CRISPR/Cas9 per contribuire a generare cellule CAR-T meno tossiche o più efficaci.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SSK è un inventore di brevetti nel campo della terapia CAR T-cell che sono autorizzati a Novartis (sotto un accordo tra Mayo Clinic, Università della Pennsylvania, e Novartis). Questi studi sono stati finanziati in parte da una sovvenzione di Humanigen (SSK). RMS, MJC, RS e SSK sono inventori di brevetti relativi a questo lavoro. Il laboratorio (SSK) riceve finanziamenti da Tolero, Humanigen, Kite, Lentigen, Morphosys e Actinium.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto attraverso sovvenzioni da K12CA090628 (SSK), la National Comprehensive Cancer Network (SSK), il Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), la Predolin Foundation (SSK), l'Ufficio Mayo Clinic of Translation to Practice (SSK) e il programma di formazione Per studenti della Mayo Clinic Medical Scientist Robert L. Howell Medical-Scientist Scholarship (RMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience | Invitrogen | 17-0038-42 | |
| Choice Taq Blue Mastermix | Denville Scientific | C775Y51 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD107a | BD Pharmingen | 555800 | |
| Fixation Medium (Medium A) | Invitrogen | GAS001S100 | |
| GenCRISPR gRNA Construct: Name: CSF2 CRISPR guide RNA 1; Species: Human, Vector: pLentiCRISPR v2; Resistance: Ampicillin; Copy number: High; Plasmid preparation: Standard delivery: 4 μg (Free of charge) |
GenScript | N/A | custom order |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| https://tide.nki.nl. | Desktop Genetics | ||
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| IFN gamma Monoclonal Antibody (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience | Invitrogen | 47-7319-42 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Monensin Solution, 1000X | BioLegend | 420701 | |
| Mouse Anti-Human CD28 Clone CD28.2 | BD Pharmingen | 559770 | |
| Mouse Anti-Human CD49d Clone 9F10 | BD Pharmingen | 561892 | |
| Mouse Anti-Human MIP-1β PE-Cy7 | BD Pharmingen | 560687 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| NALM6, clone G5 | ATCC | CRL-3273 | acute lymphoblastic leukemia cell line |
| Nuclease Free Water | Promega | P119C | |
| Olympus Vacuum Filter Systems, 500 mL, PES Membrane, 0.22uM, sterile | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane 0.45uM | Thermo Scientific Nalgene | 450-0045 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), Liquid | Gibco | 31985-070 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2 | BD Horizon | 562384 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Permeabilization Medium (Medium B) | Invitrogen | GAS002S100 | |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182001 | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| Rat Anti-Human GM-CSF BV421 | BD Horizon | 562930 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
References
- Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies. Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Schuster, S. J., et al. Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Gust, J., et al. Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
- Fitzgerald, J. C., et al. Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia. Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).
- Liu, X., Zhao, Y. CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy. Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).
- Ren, J., Zhao, Y. Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9. Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).
- Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. , (2018).
- Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
