Summary
Het doel van het protocol is om de technieken aan te tonen die worden gebruikt om virale ziekten te onderzoeken door het Zikavirus te isoleren en te kwantificeren, van meerdere organen in een muis na infectie.
Abstract
De gepresenteerde methoden tonen laboratorium procedures voor de isolatie van organen van besmette dieren van het Zikavirus en de kwantificering van de virale belasting. Het doel van de procedure is het kwantificeren van virale Antilichaamtiters in perifere en CZS-gebieden van de muis op verschillende tijdstippen na infectie of onder verschillende experimentele omstandigheden om virologische en immunologische factoren te identificeren die de Zikavirus infectie reguleren. De orgel isolatie procedures laten zien dat zowel de bepaling van de focus vormende assay als de kwantitatieve PCR-beoordeling van virale titers mogelijk is. De snelle orgel isolatietechnieken zijn ontworpen voor het behoud van de virus titer. Virale titer kwantificering door focus vormende assay zorgt voor de snelle doorvoer beoordeling van het Zikavirus. Het voordeel van de focus vormende assay is de beoordeling van infectieuze virus, de beperking van deze test is het potentieel voor orgaantoxiciteit vermindering van de aantoonbaarheidsgrens. Virale titer beoordeling wordt gecombineerd met kwantitatieve PCR, en met behulp van een recombinant RNA kopie controle virale genoom kopie nummer binnen het orgel wordt beoordeeld met lage aantoonbaarheidsgrens. Over het algemeen bieden deze technieken een nauwkeurige snelle hoge doorvoer methode voor de analyse van Zika-virale Antilichaamtiters in de periferie en CNS van besmette dieren van het zikavirus en kunnen worden toegepast op de beoordeling van virale Antilichaamtiters in de organen van dieren die zijn geïnfecteerd met de meeste pathogenen, waaronder Denguevirus.
Introduction
Zika virus (zikv) is een Arbovirus dat behoort tot de familie van de virussen, die belangrijke neuroinvasieve menselijke pathogenen zoals Powassan virus (powv), Japanse encefalitis virus (JEV) en West Nile Virus (WNV)1bevat. Na de isolatie en identificatie zijn er periodieke meldingen geweest van menselijke zikv-infecties in Afrika en Azië2,3,4,5en epidemieën in Midden-en Zuid-Amerika (beoordeeld in Referentie6). Echter, het was niet tot voor kort dat ZIKV werd gedacht te veroorzaken ernstige ziekte7. Nu zijn er duizenden gevallen van neurologische aandoeningen en aangeboren afwijkingen gekoppeld aan ZIKV infecties. De snelle opkomst van ZIKV heeft veel vragen met betrekking tot: Waarom is er een toename van de ernst van de ziekte, wat is de immunologische respons op ZIKV infectie en zijn er virale en/of immuun gemedieerde pathologieën gekoppeld aan de toename van neurologische manifestaties en aangeboren afwijkingen. Er is nu een haast om te begrijpen het centraal zenuwstelsel (CNS) gerelateerde ziekte geassocieerd met ZIKV, alsmede de noodzaak om snel de werkzaamheid van de antivirale middelen en vaccins tegen ZIKV testen. Tegen deze achtergrond hebben we methoden ontwikkeld voor de snelle analyse van ZIKV-Antilichaamtiters in zowel de periferie als het CZS met behulp van een ZIKV-specifieke focus vormende assays (FFA).
Kleine diermodellen zijn belangrijk voor het begrijpen van ziekteprogressie en voor de vroege evaluatie van vaccins, Therapeutics en anti-Virals. We hebben kleine diermodellen vastgesteld voor de studie van de ziekte van Arbovirus door het gebruik van verschillende muis stammen om menselijke infectie te modelleren en bescherming tegen virale pathogenen8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Met behulp van deze eerdere ervaring, begonnen we met het wijzigen van technieken die worden gebruikt voor de beoordeling van WNV en Denguevirus, een verwant Flavivirus voor de beoordeling van zikv titer in zowel perifere organen als de CNS21,23, 24. de voordelen van deze methoden ten opzichte van andere assays zijn: 1) dat zij het vermogen om zowel perifere als CNS organen te oogsten voor de analyse combineren; 2) de methoden zijn aanpasbaar voor flow cytometrie, voor metingen van aangeboren en adaptieve immuunresponsen, samen met virale Antilichaamtiters op hetzelfde dier in hetzelfde orgaan; 3) de oogsttechniek is aanpasbaar voor histologische analyse; 4) de ZIKV FFA is een snelle hoge doorvoer methode voor virale titer analyse; en 5) deze methoden kunnen worden toegepast op de beoordeling van virale Antilichaamtiters in de organen van dieren die besmet zijn met de meeste pathogenen25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures van de huidige studie zijn in overeenstemming met de richtlijnen die zijn vastgesteld door het Dierenzorg-en gebruiks Comité van de St. Louis University. SLU is volledig geaccrediteerd door de vereniging voor beoordeling en accreditatie van laboratorium Animal Care International (AAALAC).
1. orgaan isolatie
Opmerking: Het virus is niet stabiel bij kamertemperatuur (RT), dus het aantal dieren dat in één keer is geoogst, moet zorgvuldig worden gepland om virale titers te bewaren.
- Infecteren muizen met behulp van de gekozen dosis en route, gebaseerd op het fenotype vereist. Voor dit protocol, infecteren 8-10 week oude mannelijke en vrouwelijke type I interferon receptor deficiënte (Ifnar1-/-) C57BL/6 muizen.
- Anesthetize Ifnar1-/- muizen met een cocktail van ketamine (90 mg/kg) en Xylazine (10 mg/kg). Test pedaal reflex door een stevige teen knijpen om anesthesie te bevestigen. Dien 1 x 105 focus vormende eenheden (FFU) van zikv in 50 μL SUBCUTAAN (SC) toe via het voetpad.
- Bereid alle materialen die nodig zijn voor de oogst van de dag vóór: 2 schaar, Tang en 20 mL 70% ethanol (EtOH) in een 50 mL conische voor desinfectie van gereedschappen.
- Bereid spuiten en naalden: een 20 mL spuit voor perfusie, 23 G naalden (ongeveer 1 per kooi) en 1 mL spuit met 25 G naald (1 per 3-5 muis). Voeg vóór het wegen van buizen stalen kralen (in de motorkap) toe aan 1,5 mL O-ring schroefdop buizen (één voor elk orgel). De buizen moeten geschikt zijn voor homogenisatie.
- Bereid de dag van de oogst voor de materialen die nodig zijn voor de perfusie en orgel bevriezing.
- Vul een ijsemmer met droogijs en 70% EtOH om een ijsbad te maken. Bereid steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) ervan uitgaande dat 25-30 mL per muis van PBS voor elke perfusie nodig is 5-10 mL voor het ruggenmerg). Verkrijgen van anesthesie, een cocktail van ketamine en Xylazine, en veronderstellen 300 μL per muis. Plaats alle materialen en eventuele extra buizen die nodig zijn voor Flowcytometrie, enz., in een secundaire container om naar de dieren faciliteit te vervoeren.
- Volg alle noodzakelijke procedures voor binnenkomst, inclusief het doneren en afvullen van persoonlijke beschermingsmiddelen tijdens binnenkomst en vertrek in de dieren faciliteit.
Let op: Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een gecertificeerde bioveiligheidskast binnen een faciliteit voor bioveiligheid niveau 2 laboratorium (BSL-2). - Toedienen van anesthesie, 200-500 μL, intraperitoneaal afhankelijk van de grootte en het gewicht van het dier. Als alleen werken, anesthesie toedienen aan één dier in een tijd om te voorkomen dat het doden van de dieren voordat orgel oogst.
- Bevestig anesthesie dosis door knijpen teen met pincet om de pedaal reflex te evalueren. Ga niet door, tenzij volledig niet-responsief. Gebruik pinnen om de muis op een wax bord te zetten. Op dit punt, blus de muis in 70% ethanol om haar besmetting in de orgaanoogst procedure te voorkomen
- Terminaal bloeden door middel van hart punctie.
- Gebruik de schaar en de Tang, open het dier door de borstholte om het hart bloot te leggen. Verzamel bloed via een hart punctie (~ 800 μL), dit kan worden gebruikt voor meerdere testen, waaronder klinische chemie, hematologie, Flowcytometrie om antigeen specifieke responsen te detecteren, en real-time kwantitatieve PCR (qRT-PCR) voor de analyse van virale kopie nummer.
- Voor virale RNA-analyse door qRT-PCR, verzamelen bloed in een EDTA-buis als extractie uit volbloed of in een micro centrifugebuis als extractie uit serum. (Voor serum, spin buis op maximale snelheid in centrifuge, kamertemperatuur, gedurende 20 minuten en verwijder serum naar een aparte buis). Voeg na het nabewerken een lineaire Polyacrylamide als drager aan het serummonster toe. RNA kan vervolgens worden geanalyseerd of opgeslagen bij-80 °C voor verdere verwerking op een later tijdstip.
- Vul de 20 mL spuit met PBS, bij kamertemperatuur (of 37 °C) en parfumeer muizen door de vlindernaald in de linker ventrikel te plaatsen. Prik het juiste Atrium om bloed en PBS af te sluiten. Beheer de PBS langzaam terwijl u de kleur van de lever controleert om te bevestigen dat het dier volledig is geperfectiongebruikt. De lever moet veranderen van diep rood naar roze zalm kleur.
- Als de voorbereiding van de organen voor histologie, laat Butterfly naald op zijn plaats en vervolgens parfuseren met 20 mL ijskoude 4% Paraformaldehyde. Als dat zo is, is het handig om de spuit te laten aansluiten op een 3-weg kraantje met beide spuiten eraan bevestigd, waardoor de klep aan en uit wordt gedraaid als een afwisselend tussen PBS en PFA.
- Oogst organen in gelabelde, gewogen buizen. Voor perifere organen, volg een gevestigde volgorde voor de oogst: lever, milt, nier en longen.
- Neem slechts één kwallen uit de lever; het maakt niet uit welke, maar voor alle experimenten proberen altijd te nemen van dezelfde kwallen met dezelfde grootte stuk. Evenzo, voor nieren en longen, Neem dezelfde nier en Long. Als flow cytometrie ook moet worden voltooid, elk orgaan kan worden gehalveerd. Bewaar de helft die gebruikt moet worden voor cytometrie in Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) bij kamertemperatuur totdat de oogst is voltooid.
- Onmiddellijk na de oogst, zet elk orgel in een gelabelde buis en plaats in het droogijsbad. Virus titer vermindert na verloop van tijd bij kamertemperatuur, dus de hoeveelheid tijd die het kost om organen te oogsten is uiterst belangrijk. Er moet consistentie zijn tussen muizen, dus na de veiligheid is de volgende prioriteit snelheid.
Opmerking: Als oogst organen voor virale titers, het is zeer nuttig om een tweede individuele oogst de hersenen op dit punt, om virale titers te behouden.
- Verwijder de overgebleven organen uit de lichaamsholte van de muis om toegang te krijgen tot de wervelkolom en de schedel.
- Verwijder de muis van het bord en verwijder de Pelt, gevolgd door het verwijderen van de armen en benen.
Verwijder de kop van de muis met een onthoofding, stompe of chirurgische schaar om de hersenen te oogsten door de schedel te snijden met een geserkestreerde LaGrange-schaar door het foramen magnum. Pel vervolgens de schedel met een tang en schep de hersenen uit met een spatel. - Met behulp van sterke, stomende schaar, verwijder de ribben en andere botten rond de wervelkolom. Vervolgens, snijd over het bekken bot, bloot de wervel foramen op het lumbale niveau. De kleine punt van het ruggenmerg moet op dit punt zichtbaar zijn.
- Gebruik een 10 mL spuit gevuld met PBS en een 18 G naald om het ruggenmerg te verdrijven door het snoer van het lumbale naar de cervicale wervelkolom over een Petri schaaltje te spoelen.
- Voorzichtig, plaats de schuine punt van de naald in de wervel-foramen, Vermijd overmatige druk om te voorkomen dat de naald te Hardboiled het wervellichaam. Houd sterk vast om druk uit te oefenen op het wervellichaam en de naald en druk op de zuiger van de spuit om het snoer te verdrijven. Breng het ruggenmerg onmiddellijk over in de gelabelde buis en plaats het in het droogijsbad.
- Verwijder de muis van het bord en verwijder de Pelt, gevolgd door het verwijderen van de armen en benen.
- Herhaal de procedure met alle dieren totdat de oogst is voltooid. Plaats de oogst gereedschappen in de 70% ethanol tussen dieren. Focus op consistentie en snelheid. De tijdsduur tussen elke orgaanoogst moet consistent blijven, zodat niet vooroordelen virale titer resultaten.
- Desinfecteer na afloop de bioveiligheidskast en al het materiaal voordat u het uit de dieren faciliteit verwijdert.
- Verwijder elke buis uit het ijsbad en weeg buizen om het gewicht van de organen te bepalen. Om het gewicht van de organen te bepalen, trekt u het gewicht van de lege buis af van het gewicht van het orgaan dat de buis bevat.
Opmerking: Op dit punt kunnen organen worden bevroren bij-80 °C voor verdere verwerking op een latere datum of organen kunnen onmiddellijk worden gehomogeniseerd voordat individuele aliquots worden bevroren. Het ontdooien van monsters meerdere keren vermindert virale titer. Daarom is het belangrijk om dezelfde procedure te doen voor alle experimenten binnen één project.
2. orgaanhomogenisatie
- Bereid 3 gelabelde buizen van 1,5 mL voor elk orgel om te worden gehomogeniseerd.
- Als de monsters niet onmiddellijk na de oogst worden gehomogeniseerd, verwijder dan buizen van-80 °C. De monsters hoeven niet ontdooid te worden om te homogeniseren.
- Leg de monsters op ijs om ze koud te houden om virale titer verlies te minimaliseren. Voeg vervolgens 1 mL koude DMEM met 5% FBS toe aan elk orgaan dat de buis bevat.
- Onmiddellijk te verslaan buizen in kraal klopper volgens de instructies van de fabrikant. Homogeniseren alle organen met stalen kralen in een kraal-homogenisator-instrument. Controleer of elk orgaan volledig is gehomogeniseerd.
- Draai orgaan resten in microfugebuis op 12.000 x g gedurende 5 minuten in een micro Fuge die is gekoeld tot 8 °c. Breng de buisjes dan terug naar de ijsemmer. In de bioveiligheid Cabinet, aliquot monsters in buizen voor noodzakelijke assays. Breng de buisjes dan terug naar de ijsemmer.
- Voor focus vormende Assay, aliquot 500 μL in een gelabelde buis. Plaats vervolgens de buisjes in het rek op een ijsemmer. Aliquot 50 μL in een buis voor RNA voor fluor kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR) voor het meten van het virale genoom kopie nummer.
- Isoleer totaal RNA van de organen van de besmette dieren met behulp van een commerciële RNA Isolation Kit. Bepaal Flavivirus virale RNA met behulp van de primer sonde sets specifiek voor ZIKV, die unieke sequenties in elk Flavivirus genoom herkent. Bepaal het nummer van de virale kopie met behulp van een Kopieer controle plasmide die een gedefinieerd positief enkelvoudig RNA genereert dat in vitro wordt gegenereerd met T7 polymerase met de ZIKV-doel sequenties.
- Aliquot het overblijvende monster, dat ongeveer 300 μL is, in de derde buis en bewaar indien nodig bij-80 °C.
Opmerking: Als de monsters niet eerder zijn bevroren, Vries dan op-80 °C. Als de monsters eerder waren bevroren, ga dan verder op de focus vormende assay en/of RNA-isolatie voordat u stopt.
3. Zika virus focus vormende assay26
Opmerking: Het is belangrijk om een geen viruscontrole en een positieve controle op te nemen. De positieve controle is een verdunningsreeks van een virus bestand met een bekende concentratie. Niet alle besturingselementen moeten zich op dezelfde plaat bevinden, maar naarmate de test groter wordt dan 5 platen, moeten er meer controles worden toegevoegd en moeten er tussen de platen worden uitgespreid. Zorg dat u de monolaag niet krabt met de pipetpunten of met een krachtige wassing. Meerdere organen kunnen op dezelfde dag of op verschillende dagen worden getiterd. Maar een individueel orgaan mag niet over meerdere dagen worden getiterd, omdat verschillende testomstandigheden van invloed kunnen zijn op virale titer. Het wordt sterk aanbevolen om een individueel orgel op één dag uit te voeren.
- Bereid vóór de dag van de test de cellen en reagentia die nodig zijn voor de focus vormende assay.
- Bereid groeimedia voor met 500 mL DMEM met 5 mL HEPES en 25 mL FBS. De cellen van de Vero-World Health Organization (WHO) groeien in groeimedia bij 37 °C, 5% CO2 vóór het begin van de test. De Vero-cellen mogen niet een hoge doorgang zijn of steeds meer dan 100% confluentie krijgen vóór de aanvang van de test.
- Bereid 500 ml van een 2% Hydroxypropyl methylcellulose oplossing door Autoclaveren van een 1 l glazen media fles met 10 g Hydroxypropyl methylcellulose en een grote roerstaaf en een aparte 1 l glazen media fles met 500 ml H2O. Als het geautoclaveerd water de warmte in de magnetron heeft afgekoeld totdat de fles heet aanvoelt, maar niet kookt.
- Giet zachtjes warm/heet water in een fles Hydroxypropyl methylcellulose terwijl u in de weefselkweek kap zit. Gedeeltelijke dop fles en roer op de kookplaat tot Hydroxypropyl methylcellulose in oplossing (1-4 h). Aliquot de 2% Hydroxypropyl methylcellulose oplossing in steriele 50 ml conische buis. 2% methylcellulose kan worden bewaard bij 4 °C totdat het nodig is.
- Bereid een 5% Paraformaldehyde oplossing in PBS voor de bevestiging van de platen en bewaard bij 4 °C tot dat nodig is. Bereid een 1x focus vormende assay Wash buffer door 0,05% Triton X-100 toe te voegen aan PBS en opgeslagen bij RT. bereid een 1x FFA-kleurings buffer voor door 1 mg/mL saponine aan PBS toe te voegen en te bewaren bij 4 °C totdat dat nodig is. Deze kunnen een-twee weken van tevoren worden bereid.
- Bereken het aantal vlakke bodem 96-put-platen die nodig zijn voor de Assay, zodat elk orgaan in drievat wordt geplateerd. Neem voldoende extra putten op voor positieve en negatieve controles.
- Breid voldoende Vero-cellen in groeimedia uit om de test te voltooien. Trypsinoseer de Vero-cellen en tel ze opnieuw op met 1,5 x 105 cellen per ml in groeimedia. Plaat Vero-cellen in de 96 goed vlakke bodemplaten bij 3,0 x 104 Vero-die cellen/goed in groeimedia door toevoeging van 200 μL per put.
- Incuberen van de platen bij 37 °C bij 5% CO2 's nachts, zorg ervoor dat de platen zijn niveau in de incubator, zodat de cellen worden gelijkmatig verdeeld in de put.
Opmerking: Elk laboratorium ontwikkelt de Vero-cellen iets anders; het doel is een 90-95% confluente monolaag in elke put op de dag van de test voor Zika virus.
- Verdun het Zikavirus monster op de dag van de test. Als de orgel monsters eerder waren gehomogeniseerd, verwijder dan monsters uit de vriezer-80 °C en laat ze ontdooien voordat de monsters op ijs worden geplaatst voor de test.
- Op ijs, bereid een ronde bodem 96 goed plaat door 180 μL koude groeimedia toe te voegen aan rijen B tot en met H die rij leeg laten. Voeg 150 μL van elk gehomogeniseerd orgel monster toe aan rij A van de ronde bodemplaat.
- Bereid seriële 10-voudige verdunningen van elk monster met behulp van een meerkanaals pipet. Verdun monsters in een ronde bodem 96 goed door toevoeging van 20 μL monster in 180 μL groeimedia, waarbij pipetpunten tussen elke verdunning worden gewijzigd.
- Bereid de focus vorm plaat door het verwijderen van de media uit de vlakke bodem 96 goed plaat die Vero-cellen bedekt. Doe dit onmiddellijk voor het toevoegen van het virus monsters om te voorkomen dat de monolaag uitdrogen.
- Voeg aan elke put in de Vero-plaat 100 μL van de virus verdunning toe. Voeg een monster toe met dezelfde set tips door van de laagste naar de hoogste concentratie te gaan. Rock platen side-to-Side 2-4 keer oppassen niet te zwenken.
- Incuberen bij 37 °C, 5% CO2 voor 1-2 h. Zorg ervoor dat de platen zich in de incubator bevinden. Tijdens de incubatie opwarmen 2% Hydroxypropyl methylcellulose tot RT.
- Verdun 2% methylcellulose oplossing in groeimedia. De verdunning moet een verhouding hebben van ongeveer 2:1 van 2% Hydroxypropyl methylcellulose tot groeimedia. Houd bij kamertemperatuur totdat het tijd is om het te gebruiken. Voeg 1-2 druppels/goed toe (stel het pipet in op 125 μL) van de methylcellulose: groeimedia naar elk goed van de 96 goed plaat.
- Incubate 32-40 h bij 37 °C, 5% CO2. Omdat ieders Vero-cellen iets anders groeien en factoren zoals celconfluentie en stam van het Zikavirus kunnen de incubatietijd veranderen.
- Bevestig de Vero-cellen met de voorbereide 5% Paraformaldehyde-oplossing.
- Voeg 50 μL van 5% Paraformaldehyde toe aan elke put over de bovenkant van de Hydroxypropyl methylcellulose laag in de bioveiligheidskast. Incuberen voor 60 min bij RT. De bevestiging kan gaan overnachten bij 4 °C, maar dek de plaat af met Parafilm om de verdamping te verminderen.
- Dump overlay en media uit cellen in een afvalbak in de bioveiligheid Cabinet. Was voorzichtig met PBS, 150 μL/goed. Verwijder PBS uit de platen en verwijder de plaat van de BSL-2.
- Herhaal de PBS Wash 2x met toevoeging van 150 μL/well. Verwijder vervolgens de PBS. Voeg 150 μL/goed 1x FFA Wash buffer en laat zitten voor 5-10 min bij RT naar permeabilize de vaste cellen.
- Detecteer infectie met primaire Zika antilichamen. Bereid het primaire antilichaam 4G2 (D1-4G2-4-15) met een concentratie van 1 mg/mL in de FFA-kleurings buffer. Bereid voldoende antilichaam voor de hele test.
Opmerking: Blijf uit de buurt van labluiers of ander hoog-pluis absorberend materiaal omdat de vezels een negatieve invloed hebben op de beeldvorming van de Foci.- Verwijder de FFA-reinigings buffer van de platen. Voeg 50 μL/put van het primaire antilichaam in de FFA-kleurings buffer toe. Sluit de platen af met Parafilm en inincuberen 's nachts bij 4 °C op een schommel platform. De test kan worden uitgevoerd met een incubatie gedurende 2 uur bij RT.
- Visualiseer de infectie door toevoeging van een secundair HRP-geconjugeerd antilichaam. Bereid de secundaire geit anti-Mouse HRP-gelabeld antilichaam in een concentratie van 1:5000 in FFA-kleurings buffer. Bereid voldoende antilichaam voor de hele test.
- Was cellen 3x met FFA Wash buffer, het verwijderen van de wasbuffer door te flikken in de gootsteen elke keer. Beits de cellen met het secundaire antilichaam in de FFA-kleurings buffer bij 50 μL/goed. Incuberen 1-2 h bij RT.
- Was cellen 3x met FFA Wash buffer, het verwijderen van de wasbuffer door te flikken in de gootsteen elke keer. Voeg 50 μL/put van het Trueblue-substraat toe.
- Let op de platen zorgvuldig, wachten 2-15 min tot vlekken zijn volledig gedefinieerd en minimale achtergrond. Nadat de vlekken zichtbaar zijn, was u voorzichtig met water, met behulp van een hand om de monolaag te beschermen tegen de kracht van het stromend water. Kraan droog op papieren handdoeken (niet luiers) en beeld zo snel mogelijk.
- Vlekken kunnen handmatig worden geteld of met behulp van een geautomatiseerde spot teller. Als handmatig wordt geteld, kan een ontleed bereik worden gebruikt om te helpen in de visualisatie.
- Selecteer voor elk monster een verdunning met gemakkelijk te onderscheiden Foci (bijv. 20 tot 200 per putje) en bereken titer in de focus vormende eenheden per mL (FFU/ml), met behulp van het gemiddelde van dubbele putjes: FFU/mL = (gemiddelde Foci/well) × (verdunningsfactor) ÷ (mL entmateriaal).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om zikv Antilichaamtiters te evalueren met behulp van het hierboven beschreven protocol Ifnar1-/- muizen zijn geïnfecteerd met zikv (PRVABC59) via subcutane (SC) injectie op het voetpad. Hier, de administratie van 1 x 105 FFU van zikv tot 8-12 week oude Ifnar1-/- muizen SC is niet dodelijk, maar het virus kan repliceren in zowel de periferie en CNS. Deze dosis en route worden gebruikt om gastheer pathogeen immuunresponsen en pathogeniteit te bestuderen. Toediening van 1 x 105 FFU van zikv naar een 8-12 week oude Ifnar1 -/- muis intraveneuze (IV) injectie is tussen 80 tot 100% dodelijk, met het dier bezwijken voor infectie tussen 8 aan 14 dagen na virus injectie. We gebruiken routinematig deze toedieningsroute om de werkzaamheid van antivirale middelen en Therapeutics te bepalen, evenals voor preklinisch vaccin kandidaten testen.
Vier 10-12 week-oude Ifnar1-/- muizen werden geïnfecteerd met 1 x 105 FFU van zikv SC en milt, levers, nieren, ruggengraat koorden en hersenen werden geoogst vier dagen na infectie door de hierboven beschreven methoden (Figuur 1). De hoeveelheid ZIKV in de weefsels werd getest door de focus vormende assay (FFA) met behulp van Vero-cellen in een 96 well-indeling zoals hierboven beschreven. Met behulp van de FFA wordt weefsel virale belasting uitgedrukt als focus vormende eenheden (FFU) per g weefsel. Vergelijkbaar met wat werd waargenomen in een eerdere studie van zikv infectie van Ifnar1-/- 26, we zagen hersenen na een bemonstering van virale Antilichaamtiters in verschillende organen vier dagen na zikv infectie. Deze resultaten geven aan dat de methoden die worden gebruikt voor orgaanoogst en-tittering door focus vormende assay kunnen worden gebruikt voor het opsporen van titer in zowel perifere organen als het CZS binnen hetzelfde dier. Interessant, we hadden niet verwacht te zien van hoge virale Antilichaamtiters in zowel de periferie en de CNS vier dagen na infectie in de Ifnar1-/- muizen omdat alle van de Ifnar1-/- overleven zikv infectie met deze dosis en de route. We blijven deze observatie verkennen om te begrijpen hoe zikv kan blijven repliceren in het CZS van Ifnar1-/- zonder letaliteit te veroorzaken.
Bij het uitvoeren van de focus vormende assay (FFA), er zijn meerdere technische fouten die een onderzoeker kan maken die zal resulteren in suboptimale FFA resultaten. De meest voorkomende fouten zijn: 1) orgaantoxiciteit; 2) krachtige Pipetteer; 3) vezel verontreiniging; en 4) onjuiste celplating dichtheid. We bespreken elk van deze onderwerpen hieronder en illustreren de uitkomst in Figuur 2. Een van de meest voorkomende problemen die optreedt bij zowel de FFA als de plaque test is orgaantoxiciteit (Figuur 2a rode pijl). We geloven dat orgaantoxiciteit wordt gedreven door de hoge concentratie van intracellulaire componenten die vrijkomen tijdens orgel homogenisatie. Orgaantoxiciteit varieert op basis van het orgaan en wordt gezien in organen die zijn geoogst van niet-geïnfecteerde dieren, waarbij de lever het meest toxisch en de milt het minst is. De toxiciteit wordt verlaagd omdat het orgel op de FFA-plaat op de serie wordt verdund. Toxiciteit verandert echter de gevoeligheid van de Assay, wat resulteert in een verandering in de aantoonbaarheidsgrens. Zoals weergegeven in Figuur 2a als de virale titer in het orgel lager is dan de toxiciteit, zal de FFA niet in staat zijn om de virale titers nauwkeurig op te nemen. Figuur 2b illustreert de toxiciteit in Wells a1-4, maar de virale titer is voldoende hoog om orgaantoxiciteit te overwinnen zoals te zien in Wells B3 en B4. Om deze beperking in de FFA te overwinnen, voeren we ook kwantitatieve real-time PCR op orgel titer monsters uit. In figuur 2cillustreren we verschillende veelvoorkomende technische fouten. Krachtig pipetteren of wassen kan de monolaag (figuur 2c, *) verwijderen als dit in putten met Foci voorkomt dat gegevens verloren gaan die leiden tot onnauwkeurige rapportage van titer-resultaten. Vezels of haren, die aanwezig zijn in het absorberende papier van de laboratorium Bank kunnen individuele putjes besmetten (figuur 2c, $) Dit kan aanzienlijke fouten veroorzaken bij het gebruik van een geautomatiseerd telprogramma. Hoewel de meeste geautomatiseerde tellings Programma's glasvezel uitsluitingsopties hebben, hebben we niet gevonden dat het zeer effectief is bij het uitsluiten van vezels uit de analyse. De oplossing hiervoor is handmatig tellen van de putten, die zeer tijdrovend en is niet praktisch voor de analyse van grote testen kan zijn. Celdichtheid is een ander probleem dat een dramatisch effect kan hebben op het succes van een focus vormende assay (figuur 2D). Als cellen aan het begin van de test niet de juiste dichtheid hebben, wordt het aantal en de grootte van de vlekken beïnvloed. Zoals weergegeven in figuur 2D, kolommen 1-3, zullen cellen met ongeveer 60% confluentie aan het begin van de assay vergeleken met cellen die zijn verguld op 90% confluentie kolommen 4-6 de focus vormende assay drastisch beïnvloeden. Om dit obstakel te overwinnen, moeten kleine piloot testen worden uitgevoerd om de celdichtheid en fixatie tijden te optimaliseren, omdat individuele laboratoriumomstandigheden van invloed zijn op het succes van de assay.
Voor studies waarbij verschillende groepen geïnfecteerde dieren worden vergeleken, is de statistische analyse die wordt uitgevoerd afhankelijk van de verdeling van de gegevens. Ofwel worden parametrische of niet-parametrische tests gebruikt om de statistische significantie te beoordelen. Voor parametrische tests wordt ANOVA gebruikt om het algehele effect te detecteren, en individuele behandelingsgroepen zullen worden vergeleken met de Dunn's test. Indien de verdeling van de gegevens niet voldoet aan de eisen voor parametrische analyse, worden niet-parametrische tests toegepast. De Kruskal-Wallis test wordt gebruikt om het algehele behandelingseffect te detecteren, en de Mann-Whitney U test wordt gebruikt om paarsgewijze vergelijkingen uit te voeren. Voor de hier aanwezige resultaten hebben we de dieren niet vergelijken met een tweede gegevensset die op dit moment is geoogst, dus we hebben geen statistische analyse uitgevoerd op de getoonde gegevensset.
Figuur 1: virale replicatie in de periferie en CNS. Virale last in het perifere en CNS weefsels na IFNAR1-/- muizen krijgen 1x105 FFU van zikv SC. Op dag 4 (n = 4 per groep) werden na infectie organen geoogst, bevroren, gewogen en gehomogeniseerd. Niveaus van het virus werden gekwantificeerd door focus vormende assay. De aantoonbaarheidsgrens is 100-500 FFU/gram gebaseerd op orgel. Gegevens worden weergegeven als log10 focus vormende eenheid per gram weefsel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: gemeenschappelijke moeilijkheden met de focus vormende assay. Voor alle focus vormende assays werd virale antigeen gedetecteerd met een anti-Flavivirus MAb, gevolgd door immunoperoxidasetechniek kleuring (paars). A) Vero-cellen werden geteeld tot een 90% confluentie en geïnfecteerd met een 10-voudige seriële verdunning van supernatant van lever geoogst van een 8 weken oude C57BL/6 muis, IV geïnfecteerd met 5 x 107 FFU van zikv 4 dagen eerder. De rode pijl geeft de hoogste of "nette" concentratie van lever supernatant aan die de toxiciteit bij deze concentratie aantoont. B) Vero-cellen werden gekweekt tot een 90% confluentie en geïnfecteerd met een 10-voudige verdunning van supernatant van zikv geïnfecteerde niercellen. In dit geval zijn de monsters in kolom 1 en 2 van een C57BL/6-muis en Col 3 en 4 van een Ifnar1-/-. Beide muizen waren 8 weken oud geïnfecteerd met 1 x 105 FFU van ZIKV IV en geofferd 4 dagen na infectie. Vergelijkbaar met (A) is er enige toxiciteit waargenomen bij de hoogste concentratie (rij A), maar de virale Antilichaamtiters waargenomen in kolom 3 en 4 overwinnen de grens van detectie problemen waardoor nauwkeurige Antilichaamtiters kunnen worden gedetecteerd. C) de Vero-cellen zijn verguld. De geselecteerde putten vertonen veelvoorkomende technische fouten. De * toont een gebied waar de monolaag werd verwijderd als gevolg van krachtige Pipetteer. De $ is geplaatst over een put waar een vezel kan worden gezien. D) de celconcentratie van Vero beïnvloedt de gevoeligheid van de test. In dit plaatje werden de Vero-cellen verguld met 1,0 x 104 cellen/goed in kolom 1-3 en 3,0 x 104 Vero-die cellen/goed in kolom 4-6. Vervolgens werd de plaat geïnfecteerd met 10-voudige verdunningen van ZIKV PRVABC59 kolf. De hoogste virale concentratie monsters zijn in rij A en verdund naar beneden, waarbij elke rij een 10-voudige verdunning vertegenwoordigt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ZIKV infectie kan leiden tot een neurologische aandoening dus de huidige diermodellen om pathogenese te bestuderen, immuunresponsen en beschermende werkzaamheid van vaccins en antivirale middelen moeten zich richten op virale controle binnen het CZS. Een van de uitdagingen bij het concentreren op de ziekte van CNS is dat het vaak ten koste gaat van het bestuderen van perifere infectie. De orgel isolatie methoden die hier worden voorgesteld, zijn gericht op de noodzaak om de ZIKV-infectie in zowel de periferie als het CZS snel te evalueren om de door CNS gemedieerde ZIKV geassocieerde ziekte te beoordelen en een model op te zetten voor preklinisch onderzoek van antivirale geneesmiddelen, therapeutische en Vaccins. Een bijkomend voordeel van deze techniek is dat het ook een hoge mate van flexibiliteit mogelijk maakt, inclusief de gecombineerde studie van immunologische reacties op ZIKV of histologische analyse van infectie. Deze techniek, is niet beperkt tot alleen zikv maar kan ook universeel worden toegepast om een reeks van gastheer-pathogen interacties te bestuderen, met inbegrip van flavivirussen zoals Denguevirus21, orthopoxvirussen zoals apenpokken en ectromelia. De overwegingen en nadelen van deze techniek van het oogsten richten zich vooral op de capaciteiten van de experimenteerder. Omdat ZIKV gedurende langere tijd niet stabiel is bij kamertemperatuur, kan de hoeveelheid tijd die het kost om organen te oogsten na perfusie een aanzienlijke invloed hebben op de kwaliteit van de resultaten. Voor de meeste experimenten die we hebben uitgevoerd, vergelijken we virale Antilichaamtiters van muizen die zijn behandeld met twee voorwaarden, dus we focussen onze inspanningen op de consistentie van de tijd tussen orgel oogsten niet op snelheid. Op deze manier voert dezelfde persoon dezelfde procedure uit voor het hele experiment om consistentie te behouden. De andere belangrijke overweging met deze procedure is veiligheid, we hebben gemakkelijk uitgevoerd deze methoden met BSL-2 (ZIKV, Denguevirus) en BSL-3 (WNV, chikungunya virus) pathogenen. Het is zeer belangrijk om alle procedures uit te voeren in een schone, goed onderhouden, gecertificeerde bioveiligheidskast met desinfectiemiddel.
Een FFA parallellen de plaque Assay, behalve dat het gebruikt peroxidase immunokleuring om Foci van geïnfecteerde cellen te identificeren, in plaats van plaques. Zowel mijn laboratorium als meerdere andere laboratoria zijn nu succesvol overgeschakeld op het gebruik van FFAS voor al onze tittering experimenten11,14,15,17,26,27 ,28. De FFA heeft meerdere voordelen ten opzichte van de traditionele plaque assay: a) de FFA is sneller, wat een kortere incubatie vereist in vergelijking met een plaque Assay, b) het is ook een hogere doorvoersnelheid, uitgevoerd in 96-well platen. De 96 goed plaat formaat kan ook geschikt voor kleinere volumes van startmateriaal. Daarnaast c) is de FFA compatibel met het gebruik van een geautomatiseerde plaat wasmachine en een geautomatiseerd spot teller, waardoor de arbeidstijd en de benodigde tijdsduur voor de test aanzienlijk worden verkort. De FFA heeft meer stappen na infectie, maar d) met het gebruik van meerkanaals pipets, of zelfs een Pipetteer robot, is de timing voor de meeste teststappen na fixatie flexibel en kan de test 's nachts of langer worden onderbroken. Ten slotte, e) het kan vooral nuttig zijn voor virusstammen die geen duidelijke plaques, zoals Denguevirus vormen. Een nadeel van de FFA is dat het specifieke antilichamen vereist voor het opsporen van virus geïnfecteerde cellen, die kunnen worden verstorende bij het overwegen van diverse virusstammen of Mutant virussen. Voor de FFA zoals bij de plaque test is de dichtheid van de celmonolaag op het moment van de infectie van cruciaal belang voor het welslagen van de test. Cellen moeten worden gebruikt bij een hogere samenvloeiing voor een FFA in vergelijking met een plaque test, vanwege de verkorte tijdsduur vóór fixatie. Omdat de FFA een hogere doorvoer is, kosteneffectiever en sneller dan de traditionele plaque Assay, kan mijn laboratorium snel gegevens analyseren voor het bestuderen van opkomende infectieziekten. De FFA is om verschillende redenen meer cumulatief kosteneffectief. Hoewel antilichamen duurder zijn dan neutraalrood of kristalviolet, zijn we in staat om meer monsters per plaat te analyseren waardoor het kostenverschil wordt geëlimineerd. In termen van arbeids toewijzing geautomatiseerde spot telling en eenvoudige gegevensinvoer voor analyse beperkt de arbeidskosten en de mogelijkheid om een lange-termijn imago als een record is moeilijk te kwantificeren. De toekomst van deze test kan zijn om te verhuizen naar een TL-gebaseerde Foci voor een uitlezen in tegenstelling tot HRP. De fluorescerende intensiteit van de quantitating samen met het spot nummer zal het nut van de FFA uitbreiden dan wat momenteel wordt bestudeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Dr. Pinto wordt gefinancierd door een Seed Grant van de Saint Louis University School of Medicine en Startup funds van de Saint Louis University School of Medicine. Dr. Brien wordt gefinancierd door een K22AI104794 Early Investigator Award van de NIH NIAID en een Seed Grant van de University School van Saint Louis. Voor alle gefinancierde individuen hadden de financiers geen rol in studie ontwerp, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie of voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18 G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1 cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37 °C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96 well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5 mL eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| Curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose With 4,500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5 mL EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| O-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| One step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| Spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| Straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
References
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
- McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
- Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
- Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
- Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
- Brien, J. D. Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , Oregon Health & Science University. (2007).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
- Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
- Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
- Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
- Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
- Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
- Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
- Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
- Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
- Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
- Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).
