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Immunology and Infection

एक माउस में एकाधिक अंगों से ज़िका वायरस का अलगाव और परिमाणीकरण

Published: August 15, 2019 doi: 10.3791/59632
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Saint Louis University, 2School of Veterinary Medicine University of California Davis
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल का लक्ष्य संक्रमण के बाद एक माउस में कई अंगों से, जिका वायरस को अलग और परिमाणित करके वायरल रोग की जांच करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकों का प्रदर्शन करना है।

Abstract

प्रस्तुत किए जा रहे तरीकों से जिका वायरस संक्रमित जानवरों से अंगों के अलगाव और वायरल लोड के परिमाणीकरण के लिए प्रयोगशाला प्रक्रियाओं का प्रदर्शन होता है। प्रक्रिया का उद्देश्य अलग-अलग समय बिंदुओं पर संक्रमण के बाद या विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों में माउस के परिधीय और सीएनएस क्षेत्रों में वायरल titers मात्रा निर्धारित करने के लिए virologic और प्रतिरक्षा कारकों है कि जिका वायरस संक्रमण को विनियमित की पहचान करने के लिए है। अंग अलगाव प्रक्रियाओं का प्रदर्शन दोनों फोकस बनाने परख परिमाणीकरण और वायरल titers के मात्रात्मक पीसीआर मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं. तेजी से अंग अलगाव तकनीक वायरस titer के संरक्षण के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं. फोकस बनाने परख द्वारा वायरल titer परिमाणीकरण जिका वायरस के तेजी से थ्रूपुट मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है. फोकस बनाने परख का लाभ संक्रामक वायरस का आकलन है, इस परख की सीमा अंग विषाक्तता का पता लगाने की सीमा को कम करने के लिए क्षमता है. वायरल titer मूल्यांकन मात्रात्मक पीसीआर के साथ संयुक्त है, और अंग के भीतर एक पुनः संयोजक आरएनए प्रतिलिपि नियंत्रण वायरल जीनोम प्रतिलिपि संख्या का उपयोग कर पता लगाने की कम सीमा के साथ मूल्यांकन किया है. कुल मिलाकर इन तकनीकों की परिधि और जिका वायरस संक्रमित जानवरों के सीएनएस में जिका वायरल titers के विश्लेषण के लिए एक सटीक तेजी से उच्च थ्रूपुट विधि प्रदान करते हैं और सबसे से संक्रमित जानवरों के अंगों में वायरल titers के आकलन के लिए लागू किया जा सकता है डेंगू वायरस सहित रोगजनक।

Introduction

जिका वायरस (ज़िकवी) एक आर्बोवायरस है जो फ्लेविरिडी परिवार से संबंधित है, जिसमें महत्वपूर्ण न्यूरोसिव मानव रोगजनक जैसे पोवासन वायरस (पीओडब्ल्यूवी), जापानी एन्सेफलाइटिस वायरस (जेईवी), और वेस्ट नील नील वायरस (डब्ल्यूएनवी)1शामिल हैं। इसके अलगाव और पहचान के बाद, अफ्रीका और एशिया2,3,4,5, और मध्य और दक्षिण अमेरिका के भीतर महामारियों में मानव $IKV संक्रमण की आवधिक रिपोर्ट किया गया है (में समीक्षा की संदर्भ6). हालांकि, यह हाल तक नहीं था कि ]iKV गंभीर बीमारी7पैदा करने के लिए सोचा गया था. अब स्नायविक रोग और जन्म दोष के हजारों मामले हैं जो कि जेडआईकेवी संक्रमण से जुड़े हुए हैं। जेडआईकेवी के तेजी से उभरने से संबंधित कई सवाल पूछे गए हैं: रोग की गंभीरता में वृद्धि क्यों हुई है, जेडआईकेवी संक्रमण के प्रतिप्रतिरक्षात्मक प्रतिक्रिया क्या है और वहाँ वायरल और/या प्रतिरक्षा मध्यस्थता रोग हैं जो तंत्रिका विज्ञान में वृद्धि से जुड़े हुए हैं अभिव्यक्तियों और जन्म दोष. अब केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) से संबंधित बीमारी को समझने के साथ-साथ जेडआईकेवी के खिलाफ एंटीवायरल और टीकों की प्रभावकारिता का तेजी से परीक्षण करने की आवश्यकता है। यह इस पृष्ठभूमि के खिलाफ है कि हमने जेडआईवी टिटरों के तीव्र विश्लेषण के लिए दोनों परिधि और सीएनएस में एक जेडआईकेवी-विशिष्ट फोकस फोकस (एफएफए) का उपयोग करके तरीके विकसित किए हैं।

छोटे पशु मॉडल रोग प्रगति को समझने के लिए और टीकों, चिकित्सकीय, और विरोधी वायरल के प्रारंभिक मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण हैं। हमने मानव संक्रमण और वायरल रोगजनकों के विरुद्ध सुरक्षा के मॉडल के लिए विभिन्नमाउस उपभेदों का उपयोग करके आर्बोवायरस रोग के अध्ययन के लिए छोटे पशु मॉडल स्थापित किए हैं, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. इस पूर्व अनुभव का उपयोग करते हुए, हम WNV और डेंगू वायरस, दोनों परिधीय अंगों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सीएनएस21,23में जेडआईकेवी टिटर के आकलन के लिए एक संबंधित flavivirus के आकलन के लिए इस्तेमाल किया तकनीकको संशोधित करने के लिए शुरू किया, 24.अन्य परख की जाती है पर इन विधियों के फायदे हैं: 1) कि वे विश्लेषण के लिए परिधीय और सीएनएस दोनों अंगों को फसल की क्षमता को जोड़ते हैं; 2) तरीकों प्रवाह साइटोमेट्री के लिए अनुकूली हैं, सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की माप के लिए, एक ही अंग में एक ही जानवर पर वायरल titers के साथ; 3) फसल तकनीक हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए अनुकूलनीय है; 4) जेडआईकेवी एफएफए वायरल टिटर विश्लेषण के लिए एक तेजी से उच्च थ्रूपुट विधि है; और 5) इन विधियों को अधिकांश रोगजनकों से संक्रमित जानवरों के अंगों में वायरल titers के आकलन के लिए लागू किया जा सकता है25.

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Protocol

वर्तमान अध्ययन की सभी प्रक्रियाएं सेंट लुइस विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों के अनुसार हैं। SLU पूरी तरह से मूल्यांकन और प्रयोगशाला पशु देखभाल इंटरनेशनल (AAALAC) के प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन द्वारा मान्यता प्राप्त है.

1. अंग अलगाव

नोट: वायरस कमरे के तापमान (आरटी) पर स्थिर नहीं है इसलिए वायरल titers को संरक्षित करने के लिए ध्यान से एक समय में काटा जानवरों की संख्या की योजना बनाई जानी चाहिए।

  1. चुने गए खुराक और मार्ग का उपयोग करके चूहों को संक्रमित करें, जो आवश्यक फीनोटाइप के आधार पर होते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए, संक्रमित 8-10 सप्ताह पुराने पुरुष और महिला प्रकार मैं interferon रिसेप्टर की कमी (Ifnar1-/-) C57BL/
    1. केटामाइन (90 मिलीग्राम/किग्रा) और Xylazine (10 मिलीग्राम/किग्रा) के कॉकटेल के साथ एनेस्थेटाइज इफनार1/- चूहों। संज्ञाहरण की पुष्टि करने के लिए एक फर्म के अंगुली चुटकी द्वारा टेस्ट पेडल पलटा। फुटपैड के माध्यम से 50 डिग्री एल उप-संक्षेप में (एससी) में जेडआईकेवी के 1 x 105 फोकस बनाने इकाइयों (एफएफयू) को प्रशासित करें।
  2. पहले दिन फसल के लिए आवश्यक सभी सामग्री तैयार करें: उपकरणों के कीटाणुशोधन के लिए 50 एमएल शंकु में 2 कैंची, संदंश और 70% इथेनॉल (EtOH) के 20 एमएल।
    1. सिरिंज और सुइयों को तैयार करें: परफ्यूजन के लिए 20 एमएल सिरिंज, 23 जी सुइयों (लगभग 1 पिंजरे प्रति) और 25 जी सुई (1 प्रति 3-5 माउस) के साथ 1 एमएल सिरिंज। ट्यूब वजन करने से पहले, स्टील मोती जोड़ें (हुड में) 1.5 एमएल ओ-अंगूठी पेंच टोपी ट्यूब (प्रत्येक अंग के लिए एक) के लिए। ट्यूब एकरूपता के लिए उपयुक्त होने की जरूरत है.
  3. फसल के दिन भ्रम और अंग ठंड के लिए आवश्यक सामग्री तैयार करें।
    1. सूखी बर्फ और 70% EtOH के साथ एक बर्फ बाल्टी भरें एक बर्फ स्नान करने के लिए. बाँझ फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (पीबीएस) यह मानते हुए तैयार करें कि प्रत्येक परफ्यूजन के लिए पीबीएस के प्रति माउस 25-30 एमएल की रीढ़ की हड्डी के लिए 5-10 एमएल की आवश्यकता होती है।। संज्ञाहरण, Ketamine और Xylazine का एक कॉकटेल प्राप्त करें, और मान 300 प्रति माउस $L. पशु सुविधा के लिए परिवहन के लिए एक माध्यमिक कंटेनर में सभी सामग्री और प्रवाह साइटोमेट्री, आदि के लिए आवश्यक किसी भी अतिरिक्त ट्यूब रखें।
  4. पशु सुविधा में प्रवेश और बाहर निकलने के दौरान दान और doffing व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों सहित प्रवेश के लिए सभी आवश्यक प्रक्रियाओं का पालन करें।
    चेतावनी: सभी प्रक्रियाओं को एक प्रमाणित जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशाला (बीएसएल-2) सुविधा के भीतर एक प्रमाणित जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना है।
  5. पशु के आकार और वजन के आधार पर संज्ञाहरण, 200-500 $L, इंट्रापरीटोनली को प्रशासित करें। अगर अकेले काम कर रहे हैं, एक समय में एक जानवर को संज्ञाहरण प्रशासन अंग फसल से पहले जानवरों को मारने से बचने के लिए.
    1. पेडल प्रतिवर्त का मूल्यांकन करने के लिए संदंश के साथ पिंच करके संज्ञाहरण खुराक की पुष्टि करें। जब तक कि पूरी तरह से गैर-जिम्मेदार न हो तब तक जारी न रखें। माउस को मोम बोर्ड पर सुरक्षित करने के लिए पिन का उपयोग करें. इस बिंदु पर, 70% इथेनॉल में माउस का उपयोग करने के लिए अंग फसल प्रक्रिया में बाल संदूषण से बचने के
  6. दिल पंचर से टर्मिनल ब्लीड।
    1. कैंची और संदंश का उपयोग करना, दिल को बेनकाब करने के लिए छाती गुहा के माध्यम से जानवर खोलें। दिल पंचर के माध्यम से रक्त ले लीजिए ($800 $L), यह नैदानिक रसायन विज्ञान सहित कई परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, hematology, प्रवाह साइटोमेट्री एंटीजन विशिष्ट प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए, और वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (QRT-पीसीआर) वायरल प्रतिलिपि संख्या के विश्लेषण के लिए.
    2. क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा वायरल आरएनए विश्लेषण के लिए, सीरम से निकालने पर पूरे रक्त से या माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में निकालने पर एक EDTA ट्यूब में रक्त एकत्र करें। (सीरम के लिए, सेंट्रीफ्यूज में अधिकतम गति से स्पिन ट्यूब, कमरे अस्थायी, 20 मिनट के लिए और एक अलग ट्यूब के लिए सीरम को हटा दें). परिष्करण के बाद सीरम नमूना करने के लिए एक वाहक के रूप में एक रैखिक polyacrylamide जोड़ें. आरएनए का विश्लेषण किया जा सकता है या बाद की तारीख में आगे की प्रक्रिया के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  7. पीबीएस के साथ 20 एमएल सिरिंज भरें, कमरे के तापमान पर (या 37 डिग्री सेल्सियस), और बाएं वेंट्रिकल में तितली की सुई डालने से चूहों perfuse. रक्त और पीबीएस को बाहर निकलने की अनुमति देने के लिए सही एट्रियम को पंचर करें। धीरे धीरे PBS प्रशासन जबकि जिगर के रंग की जाँच करने के लिए पुष्टि करें कि जानवर पूरी तरह से perfused है. लिवर को गहरे लाल से गुलाबी सामन रंग में बदलना चाहिए।
    1. यदि ऊतक विज्ञान के लिए अंगों की तैयारी, जगह में तितली सुई छोड़ दो और फिर बर्फ ठंड 4% paraformaldehyde के 20 एमएल के साथ perfuse. यदि हां, तो यह सीरिंज से जुड़े दोनों सिरिंजों के साथ एक 3-तरफा स्टॉपकॉक से जुड़ा हुआ है, वाल्व को चालू और बंद पीबीएस और पीएफए के बीच एक विकल्प के रूप में बदलना सुविधाजनक है।
  8. फसल के अंगों को लेबल, तौला हुआ ट्यूब में। परिधीय अंगों के लिए, फसल के लिए एक स्थापित आदेश का पालन करें: जिगर, तिल्ली, गुर्दे और फेफड़ों।
    1. जिगर से केवल एक पालि ले लो; यह कोई फर्क नहीं पड़ता जो एक है, लेकिन सभी प्रयोगों के लिए हमेशा एक ही आकार के टुकड़े के साथ एक ही पालि लेने की कोशिश. इसी तरह, गुर्दे और फेफड़ों के लिए, एक ही गुर्दे और फेफड़ों ले लो. यदि प्रवाह साइटोमेट्री भी पूरा किया जाना है, तो किसी भी अंग को आधे में काटा जा सकता है। फसल पूरा हो गया है जब तक कमरे के तापमान पर Roswell पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट मध्यम (RPMI) में cytometry के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए आधा स्टोर.
    2. फसल के तुरंत बाद, एक लेबल ट्यूब में प्रत्येक अंग डाल दिया और सूखी बर्फ स्नान में जगह है. वायरस टिटर कमरे के तापमान पर समय के साथ कम कर देता है, इसलिए अंगों को काटने में लगने वाले समय की मात्रा अत्यंत महत्वपूर्ण है। चूहों के बीच स्थिरता होनी चाहिए, इसलिए सुरक्षा के बाद, अगली प्राथमिकता गति है।
      नोट: यदि वायरल titers के लिए अंगों की कटाई, यह बहुत उपयोगी है एक दूसरे व्यक्ति फसल इस बिंदु पर मस्तिष्क है, वायरल titers को संरक्षित करने के लिए.
  9. रीढ़ और खोपड़ी तक पहुँच प्राप्त करने के लिए माउस शरीर गुहा से शेष अंगों को निकालें।
    1. बोर्ड से माउस निकालें और पथराव को हटा दें, इसके बाद हाथ और पैर हटा दिए गए।
      एक decapitation, कुंद या शल्य कैंची के साथ माउस के सिर निकालें रंकिले magnum के माध्यम से एक serated LaGrange कैंची के साथ खोपड़ी काटने से मस्तिष्क फसल के लिए. फिर, संदंश के साथ खोपड़ी को छील लें और एक स्पैचुला के साथ मस्तिष्क को बाहर निकाल लें।
    2. मजबूत, कुंद कैंची का उपयोग करना, पसलियों और रीढ़ की हड्डी के आसपास के अन्य हड्डियों को हटा दें। फिर, श्रोणि हड्डी भर में कटौती, काठ के स्तर पर कशेरुक रंमन को उजागर. रीढ़ की हड्डी के छोटे सिरे इस बिंदु पर दिखाई देना चाहिए.
    3. पीबीएस और एक 18 जी सुई से भरा एक 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करने के लिए एक पेट्री डिश पर ग्रीवा रीढ़ की हड्डी के लिए कटि से रस्सी "प्रवाह" द्वारा रीढ़ की हड्डी को निष्कासित करने के लिए.
    4. ध्यान से, कशेरुकी रंधिका के अंदर सुई की beveled टिप जगह, अत्यधिक दबाव से बचने के लिए सुई कशेरुक शरीर अतिक्रमण को रोकने के लिए. कशेरुकी शरीर और सुई पर दबाव डालने के लिए दृढ़ता से पकड़ो और कॉर्ड को निष्कासित करने के लिए सिरिंज प्लंजर को दबाएँ। तुरंत लेबल ट्यूब में रीढ़ की हड्डी हस्तांतरण और सूखी बर्फ स्नान में जगह है.
  10. फसल पूरा हो गया है जब तक सभी जानवरों के साथ प्रक्रिया को दोहराएँ. जानवरों के बीच 70% इथेनॉल में फसल उपकरण रखें। स्थिरता और गति पर ध्यान दें। प्रत्येक अंग फसल के बीच समय की लंबाई के अनुरूप रहना चाहिए ताकि वायरल titer परिणाम पूर्वाग्रह नहीं है.
  11. समाप्त होने पर, जैव सुरक्षा कैबिनेट और सभी सामग्री को पशु सुविधा से हटाने से पहले कीटाणुरहित करें।
  12. बर्फ स्नान से प्रत्येक ट्यूब निकालें और अंगों के वजन का निर्धारण करने के लिए ट्यूब वजन. अंगों के वजन का निर्धारण करने के लिए, ट्यूब युक्त अंग के वजन से खाली ट्यूब के वजन को घटाना।
    नोट: इस बिंदु पर अंगों को बाद की तारीख में आगे की प्रक्रिया के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है या अंगों को व्यक्तिगत एलिकोट को ठंडा करने से तुरंत पहले homogenized किया जा सकता है। फ्रीज thawing नमूने कई बार वायरल titer कम हो जाती है. इसलिए, यह एक ही परियोजना के भीतर सभी प्रयोगों के लिए एक ही प्रक्रिया करने के लिए महत्वपूर्ण है।

2. अंग होमोजेनाइजेशन

  1. प्रत्येक अंग के लिए 3 लेबल, 1.5 एमएल स्नैप-कैप्ड ट्यूब तैयार करें।
  2. यदि फसल के तुरंत बाद नमूनों को समरूप नहीं किया जा रहा है, तो -80 डिग्री सेल्सियस से ट्यूब निकालें। नमूनों homogenize करने के लिए thawed करने की जरूरत नहीं है।
  3. वायरल टिटर हानि को कम करने के लिए उन्हें ठंडा रखने के लिए बर्फ पर नमूने रखो। फिर, ट्यूब युक्त प्रत्येक अंग के लिए 5% FBS युक्त ठंड DMEM के 1 एमएल जोड़ें.
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार तुरंत मनका beater में ट्यूबों को हराया। एक मनका-homogenizer साधन में इस्पात मोती के साथ सभी अंगों homogenize. प्रत्येक अंग पूरी तरह से homogenized किया गया है सुनिश्चित करने के लिए जाँच करें.
  5. माइक्रोफ्यूज में अंग के मलबे को माइक्रोफ्यूज में 12,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए स्पिन करें जिसे 8 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया गया है। फिर बर्फ बाल्टी के लिए ट्यूब ों को वापस. जैव सुरक्षा कैबिनेट में, आवश्यक assays के लिए ट्यूबों में alicot नमूने. फिर बर्फ बाल्टी के लिए ट्यूब ों को वापस.
  6. परख बनाने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, एक लेबल ट्यूब में aliquot 500 $L. फिर एक बर्फ बाल्टी पर रैक में ट्यूब जगह है. वायरल जीनोम की नकल संख्या को मापने के लिए फ्लोरोजेनिक मात्रात्मक आरटी-पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) के लिए आरएनए के लिए एक ट्यूब में अलीकोट 50 जेडएल।
  7. एक वाणिज्यिक आरएनए अलगाव किट का उपयोग कर संक्रमित जानवरों के अंगों से कुल आरएनए अलग। फ्लैविवायरस वायरल आरएनए का निर्धारण प्राइमर जांच सेट का उपयोग करके जेडआईकेवी के लिए विशिष्ट सेट करें, जो प्रत्येक फ्लेविवायरस जीनोम में अद्वितीय दृश्यों को पहचानता है। एक प्रतिलिपि नियंत्रण प्लाज्मिड का उपयोग कर वायरल प्रतिलिपि संख्या निर्धारित एक परिभाषित सकारात्मक एकल फैला आरएनए इन विट्रो में उत्पन्न का उपयोग कर युक्त T7 polymerase युक्त $IKV लक्ष्य दृश्यों.
  8. अलीकोट शेष नमूना, जो लगभग 300 डिग्री सेल्सियस है, तीसरे ट्यूब में और यदि आवश्यक हो तो -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    नोट: यदि नमूने पहले जमे हुए नहीं थे, -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज. यदि नमूने पहले जमे हुए थे, तो रोकने से पहलेपरख और/या आरएनए अलगाव बनाने पर ध्यान केंद्रित जारी रखें।

3. ज़िका वायरस फोकस बनाने परख26

नोट: यह एक नहीं वायरस नियंत्रण और एक सकारात्मक नियंत्रण शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है. सकारात्मक नियंत्रण एक ज्ञात एकाग्रता के साथ एक वायरस स्टॉक की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला है. नहीं सभी नियंत्रण एक ही थाली पर होने की जरूरत है, लेकिन परख के रूप में 5 प्लेटों से बड़ा हो जाता है, और अधिक नियंत्रण जोड़ा जाना चाहिए, और प्लेटों के बीच फैला. ध्यान रखना या तो पाइप टिप्स के साथ या जोरदार धोने से मोनोलेयर खरोंच करने के लिए नहीं। एक ही दिन या अलग-अलग दिनों में कई अंगों को titered किया जा सकता है। लेकिन एक व्यक्ति अंग कई दिनों से अधिक titered नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि विभिन्न परख शर्तों वायरल titer प्रभावित कर सकते हैं. यह दृढ़ता से एक ही दिन पर एक व्यक्ति अंग चलाने के लिए सिफारिश की है.

  1. परख के दिन से पहले, परख बनाने ध्यान के लिए आवश्यक कोशिकाओं और अभिकर्मकों को तैयार.
    1. 5 एमएल एचईपीएस और एफबीएस के 25 एमएल के साथ 500 एमएल डीएमईएम युक्त विकास मीडिया तैयार करें। क्या वेरो-विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) कोशिकाओं 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 परख की शुरुआत से पहले विकास मीडिया में बढ़ रही है। Vero कोशिकाओं को एक उच्च मार्ग या कभी परख की शुरुआत से पहले 100% संगम से अधिक हो जाना नहीं होना चाहिए.
    2. 10 ग्राम मिथाइलसेलुलोस के साथ 1 एल ग्लास मीडिया की बोतल और एक बड़ी हलचल पट्टी और 500 एमएल के साथ एक अलग 1एल ग्लास मीडिया बोतल के साथ एक 2% मिथाइलसेलुलोस समाधान के 500 एमएल तैयार करें। यदि ऑटोक्लेव्ड पानी माइक्रोवेव में फिर से गरम हो गया है जब तक बोतल स्पर्श करने के लिए गर्म है, लेकिन उबलते नहीं.
    3. ऊतक संस्कृति हुड में जबकि मिथाइलसेलुलोस की बोतल में गर्म /गर्म पानी डालना। आंशिक रूप से टोपी की बोतल और hotplate पर हलचल जब तक methylcellulose समाधान में है (1-4 ज). एलिकोट 2% मेथिलसेलुलोस विलयन बाँझ 50 एमएल शंकु ट्यूब में। 2% मिथाइलसेलुलोस को आवश्यकता पड़ने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. प्लेटों को ठीक करने के लिए पीबीएस में 5% पैराफॉर्मेल्डिहाइड समाधान तैयार करें और आवश्यकता होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें। पीबीएस के लिए 0.05% ट्राइटन एक्स-100 जोड़कर और आरटी में संग्रहीत करके परख धोने बफर बनाने के लिए 1x फोकस तैयार करें। पीबीएस में 1 मिलीग्राम/एमएल सैपोनिन जोड़कर 1x एफएफए धुंधला बफर तैयार करें और आवश्यकता होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें। इन्हें एक-दो सप्ताह पहले तैयार किया जा सकता है।
  2. परख के लिए आवश्यक फ्लैट-नीचे 96 अच्छी प्लेटों की संख्या की गणना करें कि प्रत्येक अंग को त्रिफला में चढ़ाया जाता है। सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के लिए पर्याप्त अतिरिक्त कुओं को शामिल करें.
    1. डिजाइन परख को पूरा करने के लिए विकास मीडिया में पर्याप्त वेरो कोशिकाओं को बढ़ाएँ. Vero कोशिकाओं trypsinize और उन्हें 1.5 x 105 कोशिकाओं विकास मीडिया में प्रति एमएल पर resssssin. प्लेट वेरो कोशिकाओं में 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेटों में 3.0 x 104 Vero-डब्ल्यूएचओ कोशिकाओं /
    2. 5% सीओ2 रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें, सुनिश्चित करें कि प्लेटें इनक्यूबेटर में स्तर हैं ताकि कोशिकाओं को समान रूप से अच्छी तरह से भीतर वितरित किया जाता है।
      नोट: प्रत्येक प्रयोगशाला Vero कोशिकाओं थोड़ा अलग ढंग से बढ़ता है; लक्ष्य एक 90-95% प्रत्येक अच्छी तरह से में confluent monolayer है जिका वायरस के लिए परख के दिन.
  3. डिल्यूट जिका वायरस परख के दिन के नमूने. यदि अंग के नमूने पहले homogenized किया गया था, -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से नमूने को हटाने और उन्हें परख के लिए बर्फ पर नमूने रखने से पहले thaw करने के लिए अनुमति देते हैं.
    1. बर्फ पर, एच छोड़ने पंक्ति एक खाली के माध्यम से पंक्तियों बी करने के लिए ठंड विकास मीडिया के 180 डिग्री सेल्सियस जोड़कर एक दौर नीचे 96 अच्छी तरह से प्लेट तैयार करते हैं। गोल नीचे प्लेट की पंक्ति ए में प्रत्येक समजोजनीकृत अंग नमूने का 150 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    2. एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग कर, प्रत्येक नमूने के धारावाहिक 10 गुना कमजोर पड़ने तैयार करें। विकास मीडिया के 180 डिग्री एल में नमूना के 20 डिग्री एल जोड़कर एक दौर नीचे 96 अच्छी तरह से थाली में पतला नमूने, प्रत्येक कमजोर पड़ने के बीच पिपेट युक्तियाँ बदल रहा है।
  4. वेरो कोशिकाओं को कवर फ्लैट-नीचे 96 अच्छी तरह से प्लेट से मीडिया को हटाने के द्वारा ध्यान बनाने प्लेट तैयार करें। मोनोलेयर को सुखाने से रोकने के लिए वायरस के नमूनों को जोड़ने से तुरंत पहले ऐसा करें।
    1. वेरो प्लेट में प्रत्येक को 100 डिग्री सेल्सियस वायरस कमजोर पड़ने दें। सबसे कम से उच्चतम एकाग्रता के लिए जा रहा द्वारा सुझावों का एक ही सेट का उपयोग नमूना जोड़ें. रॉक प्लेटें पक्ष से साइड 2-4 बार चक्कर नहीं सावधान किया जा रहा है.
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 1-2 ज के लिए 5% सीओ2। सुनिश्चित करें कि प्लेटें इनक्यूबेटर के भीतर स्तर हैं। ऊष्मायन के दौरान आरटी के लिए 2% मिथाइलसेलुलोस गर्म।
    3. विकास मीडिया में 2% मेथिलसेलुलोस समाधान को विलेन करें। कमजोर पड़ने के विकास मीडिया के लिए 2% मिथाइलसेलुलोस के लगभग 2:1 के अनुपात में होना चाहिए. कमरे अस्थायी पर रखें जब तक यह इसका इस्तेमाल करने के लिए समय है. methylcellulose के 1-2 बूँदें / अच्छी तरह से जोड़ें (पाइप को 125 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट करें): 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से विकास मीडिया।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 32-40 एच इनक्यूबेट, 5% सीओ2| के रूप में हर किसी की वेरो कोशिकाओं को थोड़ा अलग हो जाना और सेल संगम और जिका वायरस के तनाव सहित कारकों ऊष्मायन समय बदल सकते हैं.
  5. तैयार 5% पैराफॉर्मेल्डिहाइड समाधान का उपयोग करके वेरो कोशिकाओं को ठीक करें।
    1. जैव सुरक्षा कैबिनेट में मेथिलसेलुलोस परत के शीर्ष पर प्रत्येक के लिए 5% पैराफॉर्मेल्डिहाइड का 50 डिग्री एल जोड़ें। आरटी में 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट। फिक्सिंग रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर जा सकती है लेकिन वाष्पीकरण को कम करने के लिए पैराफिल्म के साथ प्लेट को कवर कर सकती है।
    2. जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर एक निपटान कंटेनर में बंद ओवरले और मीडिया बंद। पीबीएस, 150 डिग्री सेल्सियस/ प्लेटों से पीबीएस निकालें और बीएसएल-2 से प्लेट निकालें।
    3. पीबीएस धोने 2x 150 डिग्री सेल्सियस / फिर PBS निकालें। 150 डिग्री सेल्सियस/अच्छी तरह से 1x एफएफए धोने बफर जोड़ें और निश्चित कोशिकाओं permebilize करने के लिए आरटी पर 5-10 मिनट के लिए बैठते हैं।
  6. प्राथमिक ज़िका एंटीबॉडी का उपयोग करके संक्रमण का पता लगाएं। प्राथमिक एंटीबॉडी 4G2 (D1-4G2-4-15) की एकाग्रता पर तैयार 1 mg/mL में FFA धुंधला बफर. पूरे परख के लिए पर्याप्त एंटीबॉडी तैयार करें.
    नोट: फाइबर नकारात्मक foci की इमेजिंग को प्रभावित करेगा के रूप में प्रयोगशाला डायपर या अन्य उच्च-लिंट शोषक सामग्री से दूर रहो।
    1. प्लेटों से एफएफए धोने बफर निकालें. एफएफए धुंधला बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी के 50 डिग्री एल / पैराफिल्म के साथ प्लेटों को सील करें और एक रॉकिंग प्लेटफॉर्म पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। परख आरटी में 2 एच के लिए एक ऊष्मायन के साथ किया जा सकता है।
  7. एक माध्यमिक एचआरपी संयुग्मी एंटीबॉडी के अलावा द्वारा संक्रमण कल्पना. FFA धुंधला बफर में 1:5,000 की एकाग्रता पर माध्यमिक बकरी विरोधी माउस एचआरपी लेबल एंटीबॉडी तैयार करें। पूरे परख के लिए पर्याप्त एंटीबॉडी तैयार करें.
    1. FFA धोने बफर के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें, हर बार सिंक में flicking द्वारा धोने बफर को हटाने. 50 डिग्री सेल्सियस/ आरटी में 1-2 एच इनक्यूबेट।
    2. FFA धोने बफर के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें, हर बार सिंक में flicking द्वारा धोने बफर को हटाने. Trueblue Substrate के 50 $L/well जोड़ें.
    3. प्लेटों को ध्यान से देखो, 2-15 मिनट इंतजार कर जब तक स्पॉट पूरी तरह से परिभाषित किया गया है और कम से कम पृष्ठभूमि. स्पॉट दिखाई दे रहे हैं के बाद, पानी के साथ धीरे धोने, एक हाथ का उपयोग करने के लिए पानी चल के बल से मोनोलेयर ढाल. जितनी जल्दी हो सके कागज तौलिए (NOT DIAPERS) और छवि पर सूखी टैप करें।
    4. स्पॉट मैन्युअल रूप से या एक स्वचालित स्थान काउंटर का उपयोग कर गिना जा सकता है. यदि मैन्युअल रूप से गिना जाता है, तो दृश्यावलोकन में सहायता करने के लिए विच्छेदन क्षेत्र का उपयोग किया जा सकता है.
    5. प्रत्येक नमूने के लिए, आसानी से प्रतिष्ठित फॉसी (उदाहरण के लिए, 20 से 200 प्रति अच्छी तरह) के साथ एक कमजोर पड़ने का चयन करें और प्रति एमएल (FFU/ml) फोकस बनाने इकाइयों में टिटर की गणना करें, डुप्लिकेट कुओं के औसत का उपयोग करते हुए: FFU/mL ( mean foci/well) ] (mL inoculum)

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Representative Results

Ifnar1के ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर ]IKV titers का मूल्यांकन करने के लिए - चूहों के नीचे (एससी) के माध्यम से footpad करने के लिए $iKV (PRVABC59) से संक्रमित थे. यहाँ, 8-12 सप्ताह पुराने Ifnar1करने के लिए $iKV के 1 x 105 FFU के प्रशासन- चूहों अनुसूचित जाति घातक नहीं है, लेकिन वायरस दोनों परिधि और सीएनएस में दोहराने कर सकते हैं. इस खुराक और मार्ग का उपयोग मेजबान रोगज़नक़ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और रोगजनकता का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। एक 8-12 सप्ताह पुराने Ifnar1 करने के लिए 1 x 105 FFU का प्रशासन Ifnar1 -/- माउस अंतःशिरा (IV) इंजेक्शन 80 से 100% घातक के बीच है, जानवर के बीच संक्रमण के शिकार के साथ 8 से 14 दिनों के बाद वायरस इंजेक्शन. हम नियमित रूप से antivirals और चिकित्सकीय की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए इस प्रशासन मार्ग का उपयोग करें, साथ ही पूर्व नैदानिक टीका उम्मीदवार परीक्षण.

चार 10-12 सप्ताह पुराने Ifnar1-/- चूहों से संक्रमित थे 1 x 105 FFU के $iKV अनुसूचित जाति और तिल्ली, जिगर, गुर्दे, रीढ़ की हड्डी और दिमाग के बाद चार दिन के बाद संक्रमण के ऊपर विस्तृत तरीकों द्वारा काटा गया (चित्र 1). ऊतकों में $IKV की मात्रा ऊपर वर्णित के रूप में एक 96 अच्छी तरह से प्रारूप में Vero कोशिकाओं का उपयोग कर परख (FFA) फोकस बनाने द्वारा परख किया गया था. एफएफए का उपयोग करते हुए, ऊतक वायरल लोड को ऊतक के प्रति ग्राम फोकस बनाने वाली इकाइयों (एफएफयू) के रूप में व्यक्त किया जाता है। Ifnar1के एक पिछले अध्ययन में क्या देखा गया था के समान-/- 26, हम viremia विभिन्न अंगों में वायरल titers के एक नमूने के बाद देखा चार दिन के बाद ]iKV संक्रमण. इन परिणामों से संकेत मिलता है कि अंग फसल और ध्यान बनाने परख द्वारा tittering के लिए इस्तेमाल किया तरीकों दोनों परिधीय अंगों और एक ही जानवर के भीतर सीएनएस में titer का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दिलचस्प है, हम दोनों परिधि में उच्च वायरल titers देखने की उम्मीद नहीं थी और CNS चार दिन Ifnar1में संक्रमण के बाद- चूहों क्योंकि Ifnar1के सभी/ हम इस अवलोकन का पता लगाने के लिए जारी कर रहे हैं समझने के लिए कैसे iKV Ifnar1के सीएनएस में दोहराने के लिए जारी रख सकते हैं-- घातकता के कारण के बिना.

जब ध्यान बनाने परख (FFA) प्रदर्शन, वहाँ कई तकनीकी गलतियों एक अन्वेषक जो suboptimal FFA परिणाम में परिणाम होगा कर सकते हैं. सबसे आम गलतियों हैं: 1) अंग विषाक्तता; 2) जोरदार पाइपिंग; 3) फाइबर संदूषण; और 4) गलत सेल चढ़ाना घनत्व। हम नीचे दिए गए प्रत्येक मुद्दे पर चर्चा करते हैं और इसके परिणाम को चित्र 2में स्पष्ट करते हैं . अधिक आम मुद्दों में से एक है कि दोनों FFA और पट्टिका परख के साथ होता है अंग विषाक्तता है (चित्र 2A लाल तीर). हमारा मानना है कि अंग विषाक्तता अंग homogenization के दौरान जारी intracellular घटकों की उच्च एकाग्रता से प्रेरित है. अंग विषाक्तता अंग पर आधारित होता है और uninfected जानवरों से काटा अंगों में देखा जाता है, जिगर के साथ सबसे विषाक्त और तिल्ली कम से कम किया जा रहा है. विषाक्तता कम हो जाती है क्योंकि अंग को एफएफए प्लेट पर क्रमिक रूप से पतला किया जाता है। हालांकि, विषाक्तता का पता लगाने की सीमा में परिवर्तन में जिसके परिणामस्वरूप परख की संवेदनशीलता को बदल देता है. के रूप में चित्रा 2A में दिखाया गया है अगर अंग में वायरल titer विषाक्तता से कम है FFA सही वायरल titers रिकॉर्ड करने में सक्षम नहीं होगा. चित्र 2ख कुओं में विषाक्तता को दिखाता है a1-4, लेकिन वायरल titer पर्याप्त रूप से अंग विषाक्तता पर काबू पाने के रूप में कुओं b3 और b4 में देखा उच्च है. एफएफए में इस सीमा को दूर करने के लिए, हम अंग टिटर नमूनों पर मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर भी करते हैं। चित्र 2C मेंहम कई सामान्य तकनीकी त्रुटियों का वर्णन करते हैं. जोरदार पाइपिंग या धोने मोनोलेयर को हटा सकते हैं (चित्र 2C, *), यदि यह फॉसी के साथ कुओं में होता है कि डेटा को titer परिणामों की गलत रिपोर्टिंग के लिए अग्रणी खो जाएगा। फाइबर या बाल, कि प्रयोगशाला बेंच शोषक कागज में मौजूद हैं व्यक्तिगत कुओं को दूषित कर सकते हैं (चित्र 2C, $) यह महत्वपूर्ण त्रुटियों का कारण बन सकता है अगर एक स्वचालित गिनती कार्यक्रम का उपयोग कर. जबकि सबसे स्वचालित गिनती कार्यक्रमों फाइबर बहिष्करण विकल्प है, हम इसे विश्लेषण से फाइबर को छोड़कर में अत्यधिक प्रभावी होने के लिए नहीं मिला है. इस के लिए समाधान के लिए मैन्युअल रूप से कुओं, जो बहुत समय लगता है और बड़े assays के विश्लेषण के लिए व्यावहारिक नहीं हो सकता है गिनती है. कोशिका घनत्व एक अन्य मुद्दा है जो फोकस बनाने की परख की सफलता को नाटकीय रूप से प्रभावित कर सकता है (चित्र 2D)| यदि कोशिकाओं परख की शुरुआत में सही घनत्व पर नहीं हैं संख्या और स्थानों के आकार को प्रभावित किया जाएगा. चित्र 2 Dमें दिखाया गया है के रूप में, कॉलम 1-3, परख के शुरू में लगभग 60% संगम पर कोशिकाओं 90% संगम कॉलम 4-6 पर चढ़ाया कोशिकाओं की तुलना में नाटकीय रूप से ध्यान बनाने परख को प्रभावित करेगा. इस बाधा को दूर करने के लिए छोटे पायलट परख सेल घनत्व और निर्धारण बार का अनुकूलन करने के लिए चलाया जाना चाहिए के रूप में व्यक्तिगत प्रयोगशाला शर्तों परख के लिए सफलता को प्रभावित करेगा.

अध्ययन के लिए जब संक्रमित जानवरों के विभिन्न समूहों की तुलना में कर रहे हैं, सांख्यिकीय विश्लेषण है कि प्रदर्शन किया जाता है डेटा के वितरण पर निर्भर है. सांख्यिकीय महत्व का आकलन करने के लिए या तो पैरामीट्रिक या गैर-पैरामीट्रिक परीक्षणों का उपयोग किया जाता है। पैरामीट्रिक परीक्षणों के लिए, ANOVA समग्र प्रभाव का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है, और व्यक्तिगत उपचार समूहों डन के परीक्षण का उपयोग कर तुलना की जाएगी। यदि आंकड़ों का वितरण पैरामीट्रिक विश्लेषण के लिए आवश्यकताओं को पूरा नहीं करता है, तो गैर-पैरामीट्रिक परीक्षण नियोजित किए जाते हैं। Kruskal-Wallis परीक्षण समग्र उपचार प्रभाव का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है, और मान Whitney यू परीक्षण जोड़ी वार तुलना प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यहाँ मौजूद परिणामों के लिए हम एक दूसरे डेटा इस समय बिंदु पर काटा सेट के साथ जानवरों की तुलना नहीं किया तो हम दिखाया डेटा सेट पर सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन नहीं किया.

Figure 1
चित्र 1: परिधि और सीएनएस में वायरल प्रतिकृति. IFNAR1के बाद परिधीय और सीएनएस ऊतकों में वायरल बोझ - चूहों को जेडआईकेवी अनुसूचित जाति के 1x105 एफएफयू दिए जाते हैं। 4 दिन (एन $ 4 प्रति समूह) संक्रमण के बाद अंगों काटा गया, तस्वीर जमे हुए, तौला, और homogenized. वायरस के स्तर परख बनाने फोकस द्वारा परिमाणित किया गया. पता लगाने की सीमा अंग पर आधारित 100-500 एफएफयू/ग्राम है। डेटा ऊतक के प्रति ग्राम लॉग10 फोकस बनाने इकाई के रूप में दिखाया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: फोकस बनाने परख के साथ आम कठिनाइयों. सभी फोकस बनाने के लिए परख दिखाया वायरल प्रतिजन एक विरोधी flavivirus MAb के साथ पता चला था, इम्यूनोपर्क्सीडेज धुंधला द्वारा पीछा किया (purple). (क) वेरो कोशिकाओं को 90% संगम के लिए विकसित किया गया था और 4 दिन पहले 4 दिन पहले 5 x 107 एफएफयू से संक्रमित 8 सप्ताह पुराने C57BL/6 माउस से काटा गया जिगर से सुपरनेंट के 10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने से संक्रमित थे। लाल तीर इस एकाग्रता में विषाक्तता का प्रदर्शन जिगर supernatant के उच्चतम या "नीट" एकाग्रता इंगित करता है. (ख) वेरो कोशिकाओं को 90% संगम तक उगाया गया और जेडआईकेवी संक्रमित गुर्दे की कोशिकाओं से सुपरनेटेंट के 10 गुना कमजोर पड़ने से संक्रमित किया गया. इस मामले में कॉलम 1 और 2 में नमूने एक C57BL/6 माउस और कोल 3 और 4 से हैं एक Ifnar1-/ दोनों चूहों 8 सप्ताह पुराने थे 1 x 105 FFU के साथ संक्रमित ]IKV चतुर्थ और बलिदान 4 दिन के बाद संक्रमण. (ए) के समान कुछ विषाक्तता उच्चतम एकाग्रता पर देखा जाता है (पंक्ति एक) लेकिन वायरल titers स्तंभ 3 और 4 में मनाया सटीक titers का पता लगाने के लिए अनुमति देने के मुद्दों की सीमा पर काबू पाने. (ग) वेरो कोशिकाओं को चढ़ाया गया था । चयनित कुओं आम तकनीकी त्रुटियों को दिखाने के लिए. * एक क्षेत्र है जहां मोनोलेयर जोरदार पाइपिंग के कारण हटा दिया गया था दर्शाता है. एक फाइबर देखा जा सकता है, जहां एक अच्छी तरह से पर रखा गया है. (घ) वेरो सेल सांद्रता परख की संवेदनशीलता को प्रभावित करती है। इस प्लेट में वेरो कोशिकाओं को कॉलम 1-3 और 3.0 x 104 वेरो-डब्ल्यूएचओ कोशिकाओं/अच्छी कॉलम 4-6 में 1.0 x 104 कोशिकाओं/अच्छी तरह से चढ़ाया गया था। तब प्लेट जेडआईकेवी PRVABC59 स्टॉक के 10 गुना कमजोर पड़ने से संक्रमित था। उच्चतम वायरल एकाग्रता नमूने पंक्ति ए में हैं और नीचे पतला, प्रत्येक पंक्ति के साथ एक 10 गुना कमजोर पड़ने का प्रतिनिधित्व. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

जेडआईकेवी संक्रमण एक न्यूरोलॉजिकल बीमारी का कारण बन सकता है इसलिए वर्तमान पशु मॉडल रोगजनन का अध्ययन करने के लिए, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और टीकों और एंटीवायरल की सुरक्षात्मक प्रभावकारिता सीएनएस के भीतर वायरल नियंत्रण पर ध्यान केंद्रित करने की आवश्यकता है। सीएनएस रोग पर ध्यान केंद्रित करने में चुनौतियों में से एक यह है कि यह अक्सर परिधीय संक्रमण का अध्ययन करने की कीमत पर आता है। यहाँ प्रस्तावित अंग अलगाव के तरीकों को तेजी से दोनों परिधि और सीएनएस में जेडआईकेवी संक्रमण का मूल्यांकन करने की आवश्यकता पर केंद्रित है ताकि सीएनएस मध्यस्थता ]IKV जुड़े रोग का आकलन करने और antivirals के पूर्व नैदानिक परीक्षण के लिए एक मॉडल स्थापित करने के लिए, चिकित्सकीय और टीके. इस तकनीक का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि यह भी लचीलापन के एक उच्च डिग्री के लिए अनुमति देता है, iKV या संक्रमण के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण करने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के संयुक्त अध्ययन सहित. इस तकनीक, सिर्फ $iKV तक ही सीमित नहीं है, लेकिन यह भी सार्वभौमिक मेजबान-रोगजन बातचीत की एक श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे डेंगू वायरस21,orthopoxवायरस जैसे monkeypox और ectromelia जैसे flaviviruses सहित. मुख्य रूप से प्रयोगकर्ता की क्षमताओं का ध्यान कटाई की इस तकनीक के लिए विचार और कमियां. के रूप में $IKV कमरे के तापमान पर समय की लंबी अवधि के लिए स्थिर नहीं है, समय की राशि यह perfusion के बाद अंगों फसल के लिए लेता है काफी परिणामों की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं. अधिकांश प्रयोगों है कि हम प्रदर्शन किया है के लिए, हम दो शर्तों के साथ इलाज चूहों से वायरल titers तुलना, तो हम गति पर नहीं अंग फसल के बीच समय की स्थिरता पर हमारे प्रयासों पर ध्यान केंद्रित. इस तरह एक ही व्यक्ति स्थिरता बनाए रखने के लिए पूरे प्रयोग के लिए एक ही प्रक्रिया करता है. इस प्रक्रिया के साथ अन्य प्रमुख विचार सुरक्षा है, हम आसानी से बीएसएल -2 (ज़िकेवी, डेंगू वायरस) और बीएसएल-3 (WNV, चिकनगुनिया वायरस) रोगजनकों के साथ इन तरीकों का प्रदर्शन किया है। कीटाणुनाशक के साथ एक स्वच्छ, अच्छी तरह से बनाए रखा, प्रमाणित जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करना बहुत महत्वपूर्ण है।

एक एफएफए प्लेक परख के समानांतर है, सिवाय इसके कि यह प्लेक के बजाय संक्रमित कोशिकाओं की फॉसी की पहचान करने के लिए peroxidase इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग करता है। मेरी प्रयोगशाला के साथ-साथ कई अन्य प्रयोगशालाओं ने अब हमारे सभी टिटरिंग प्रयोगों11,14,15,17,26,27 के लिए एफएफएस का उपयोग करने में सफलतापूर्वक कार्य किया है ,28. एफएफए पारंपरिक पट्टिका परख पर कई फायदे हैं: एक) एफएफए तेजी से है, एक पट्टिका परख की तुलना में एक छोटी ऊष्मायन की आवश्यकता होती है, ख) यह भी उच्च-थ्रूपुट है, 96-वेल प्लेटों में किया जा रहा है। 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप भी शुरू सामग्री के छोटे संस्करणों को समायोजित कर सकते हैं. इसके अलावा, ग) FFA एक स्वचालित प्लेट वॉशर और स्वचालित स्थान काउंटर के उपयोग के साथ संगत है, बहुत श्रम और परख के लिए आवश्यक समय को कम करने. FFA संक्रमण के बाद और अधिक कदम है, लेकिन d) multichannel pipets, या यहां तक कि एक pipeting रोबोट के उपयोग के साथ, निर्धारण के बाद परख कदम के अधिकांश के लिए समय लचीला कर रहे हैं और परख रात भर या लंबे समय के लिए रोका जा सकता है. अंत में, ई) यह वायरस उपभेदों के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जो स्पष्ट प्लेक नहीं बनाते हैं, जैसे कि डेंगू वायरस। एफएफए का एक नुकसान यह है कि यह वायरस संक्रमित कोशिकाओं का पता लगाने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता है, जो विविध वायरस उपभेदों या उत्परिवर्ती वायरस पर विचार करते समय confounding हो सकता है. FFA के लिए के रूप में पट्टिका परख के साथ संक्रमण के समय सेल मोनोलेयर के घनत्व परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. कोशिकाओं को एक पट्टिका परख की तुलना में एक एफएफए के लिए उच्च संगम पर इस्तेमाल किया जाना चाहिए, निर्धारण से पहले समय की छोटी लंबाई के कारण। के रूप में FFA अधिक throughput है, और अधिक लागत प्रभावी और पारंपरिक पट्टिका परख की तुलना में तेजी से यह मेरी प्रयोगशाला तेजी से उभरते संक्रामक रोगों के अध्ययन के लिए डेटा का विश्लेषण करने की अनुमति देता है. एफएफए कई कारणों से अधिक संचयी रूप से अधिक लागत प्रभावी है। हालांकि एंटीबॉडी तटस्थ लाल या क्रिस्टल बैंगनी की तुलना में अधिक महंगे हैं, हम प्रति प्लेट अधिक नमूनों का विश्लेषण करने में सक्षम हैं जो लागत अंतर को समाप्त करता है। श्रम आवंटन के संदर्भ में स्वचालित स्थान गिनती और विश्लेषण के लिए आसान डेटा प्रविष्टि सीमा श्रम लागत और एक रिकॉर्ड के रूप में एक लंबी अवधि की छवि है करने की क्षमता मात्रा निर्धारित करने के लिए मुश्किल है. इस परख का भविष्य एचआरपी के विरोध के रूप में एक readout के लिए एक फ्लोरोसेंट आधारित foci के लिए स्थानांतरित करने के लिए हो सकता है. हाजिर संख्या के साथ-साथ फ्लोरोसेंट तीव्रता वर्तमान में अध्ययन से परे एफएफए की उपयोगिता का विस्तार करेगी।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है

Acknowledgments

डॉ पिंटो चिकित्सा के सेंट लुइस विश्वविद्यालय स्कूल और सेंट लुइस विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन से स्टार्टअप धन से एक बीज अनुदान द्वारा वित्त पोषित है। डॉ Brien NIH NIAID से एक K22AI104794 जल्दी अन्वेषक पुरस्कार के रूप में अच्छी तरह से सेंट लुइस विश्वविद्यालय स्कूल से एक बीज अनुदान द्वारा वित्त पोषित है. सभी वित्त पोषित व्यक्तियों के लिए funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-bromo-3-chloropropane (BCP) MRC gene BP151
10 cc syringe Thermo Fisher Scientific BD 309642
18 G needle Thermo Fisher Scientific 22-557-145
1 cc TB syringe Thermo Fisher Scientific 14-823-16H
20 cc syringe Thermo Fisher Scientific 05-561-66
24 tube beadmill Thermo Fisher Scientific 15 340 163
3.2 mm stainless steel beads Thermo Fisher Scientific NC9084634
37 °C Tissue Culture incubator Nuair 5800
4G2 antibody in house
96 well flat bottom plates Midsci TP92696
96 well round bottom plates Midsci TP92697
Basix 1.5 mL eppendorf tubes Thermo Fisher Scientific 02-682-002
Concentrated Germicidal Bleach Staples 30966CT
CTL S6 Analyzer CTL CTL S6 Universal Analyzer
Curved cutting scissors Fine Science Tools 14061-11
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose With 4,500 mg/L glucose MilliporeSigma D5671
Ethanol (molecular biology-grade) MilliporeSigma e7023
Fetal Bovine Serum MilliporeSigma F0926-500ML
Forceps Fine Science Tools 11036-20
Glacial acetic acid MilliporeSigma 537020
Goat anti-mouse HRP-labeled antibody MilliporeSigma 8924
HEPES 1 M MilliporeSigma H3537-100ML
Isopropanol (molecular biology-grade) MilliporeSigma I9516
Ketamine/Xylazine cocktail Comparative Medicine
L-glutamine MilliporeSigma g7513
Magmax RNA purification kit Thermo Fisher Scientific AM1830
Methylcellulose MilliporeSigma M0512
Microcentrifuge Ependorf 5424R
MiniCollect 0.5 mL EDTA tubes Bio-one 450480
O-ring tubes Thermo Fisher Scientific 21-403-195
One step q RT-PCR mix Thermo Fisher Scientific 4392938
Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific EMS- 15713-S
Phosphate Buffered Saline MilliporeSigma d8537-500ml
Proline multichannel pipettes Sartorius 72230/72240
Proline single channel pipettes Sartorius 728230
RNAse free water Thermo Fisher Scientific 10-977-023
RNAzol BD MRC gene RB192
Rocking Platform Thermo Fisher Scientific 11-676-333
RPMI 1640 Fisher MT10040CV
Saponin MilliporeSigma s7900
Spoon/spatula Fine Science Tools 10090-17
Straight cutting scissors Fine Science Tools 14060-11
Triton X-100 MilliporeSigma t8787
True Blue Substrate VWR 95059-168
Trypsin MilliporeSigma T3924-100ML

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References

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JoVE में इस महीने अंक 150 जिका वायरस मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी गुर्दे तिल्ली जिगर वायरल titer फोकस बनाने परख मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर पैर पैड संक्रमण
एक माउस में एकाधिक अंगों से ज़िका वायरस का अलगाव और परिमाणीकरण
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Brien, J. D., Hassert, M., Stone, E. … More

Brien, J. D., Hassert, M., Stone, E. T., Geerling, E., Cruz-Orengo, L., Pinto, A. K. Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse. J. Vis. Exp. (150), e59632, doi:10.3791/59632 (2019).

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