Summary
L'obiettivo del protocollo è quello di dimostrare le tecniche utilizzate per studiare la malattia virale isolando e quantificando il virus zoika, da più organi in un topo dopo l'infezione.
Abstract
I metodi presentati dimostrano le procedure di laboratorio per l'isolamento degli organi dagli animali infetti dal virus zika e la quantificazione del carico virale. Lo scopo della procedura è quello di quantificare i dispositivi virali nelle aree periferiche e del SNC del topo in diversi momenti dopo l'infezione o in diverse condizioni sperimentali per identificare i fattori virologici e immunologici che regolano l'infezione da virus zika. Le procedure di isolamento degli organi dimostrate consentono sia la quantificazione del saggio che la valutazione quantitativa della PCR dei titer virali. Le tecniche di isolamento rapido degli organi sono progettate per la conservazione del titro del virus. La quantificazione del titro virale per messa a fuoco formando il saggio consente la rapida valutazione della produttività del virus . Il vantaggio della formazione di analisi di fuoco è la valutazione del virus infettivo, la limitazione di questo saggio è il potenziale per la tossicità degli organi riducendo il limite di rilevamento. La valutazione del titro virale è combinata con la PCR quantitativa e l'utilizzo di un numero di copia virale del genoma del controllo dell'RNA ricombinante all'interno dell'organo viene valutato con un basso limite di rilevamento. Nel complesso, queste tecniche forniscono un metodo rapido ed accurato ad alto throughput rapido per l'analisi dei titoli virali di zika nella periferia e del SNC degli animali infetti del virus zika e possono essere applicati alla valutazione dei titoli virali negli organi degli animali infetti con la maggior parte agenti patogeni, tra cui il virus Dengue.
Introduction
Il virus del virus zika è un arbovirus appartenente alla famiglia flaviviridae, che comprende importanti patogeni umani neuroinvasivi come il virus Powassan (POWV), il virus dell'encefalite giapponese (JEV) e il virus del Nilo occidentale (WNV)1. A seguito del suo isolamento e della sua identificazione, sonostati periodici rapporti periodici di infezioni umane in Africa e Asia 2,3,4,5,ed epidemie all'interno dell'America centrale e meridionale (riviste in riferimento6). Tuttavia, non è stato fino a poco tempo fa che si pensava che la Malattia di IKV causasse una grave malattia7. Ora ci sono migliaia di casi di malattie neurologiche e difetti alla nascita legati alle infezioni da .IKV. La rapida comparsa dello ZiKV ha suscitato molte domande relative al: perché c'è un aumento della gravità della malattia, qual è la risposta immunologica all'infezione da manifestazioni e difetti alla nascita. Ora c'è fretta di comprendere la malattia correlata al sistema nervoso centrale (SNC) associata all'IKV, nonché la necessità di testare rapidamente l'efficacia degli antivirali e dei vaccini contro la . È in questo contesto che abbiamo sviluppato metodi per l'analisi rapida dei titoli di iKV sia nella periferia che nel CNS utilizzando un'attenzione specifica per la .IKV (FFA).
I modelli animali di piccole dimensioni sono importanti per comprendere la progressione della malattia e per la valutazione precoce di vaccini, terapie e anti-virali. Abbiamo stabilito piccoli modelli animali per lo studio della malattia da arbovirus utilizzando vari ceppi murini per modellare l'infezione umana e la protezione contro i patogeni virali8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Utilizzando questa precedente esperienza, abbiamo iniziato a modificare le tecniche utilizzate per la valutazione del virus WNV e Dengue, un flavivirus correlato per la valutazione del titro di . 24. I vantaggi di questi metodi rispetto ad altri saggi sono: 1) che essi combinano la capacità di raccogliere sia organi periferici che sNC per l'analisi; 2) i metodi sono adattabili per la citometria di flusso, per le misurazioni di risposte immunitarie innate e adattative, insieme a i titori virali sullo stesso animale nello stesso organo; 3) la tecnica del raccolto è adattabile per l'analisi istologica; 4) l'IKV FFA è un metodo rapido ad alta produttività per l'analisi del titro virale; e 5) questi metodi possono essere applicati alla valutazione dei titori virali negli organi degli animali infettati con la maggior parte degli agenti patogeni25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure del presente studio sono conformi alle linee guida stabilite dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della St. Louis University. SLU è pienamente accreditata dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento di Laboratorio Animal Care International (AAALAC).
1. Isolamento dell'organo
NOT: Il virus non è stabile a temperatura ambiente (RT), quindi il numero di animali raccolti contemporaneamente deve essere pianificato con attenzione per preservare i titers virali.
- Infettare i topi utilizzando la dose e il percorso scelti, in base al fenotipo richiesto. Per questo protocollo, infettare 8-10 settimana maschi e femmine di tipo I recettore dell'interferone deficient (Ifnar1-/-) C57BL/6 topi.
- Anestesizza ifnar1-/- topi con un cocktail di Ketamina (90 mg/kg) e Xylazina (10 mg/kg). Testare il riflesso del pedale da un pizzico fermo alla volta per confermare l'anestesia. Amministrare 1 x 105 unità di formazione di messa a fuoco (FFU) di .IKV in 50 - L sottocutaneamente (SC) tramite il footpad.
- Preparare tutti i materiali necessari per la raccolta il giorno prima: 2 forbici, pinze e 20 mL di 70% etanolo (EtOH) in un conico di 50 mL per la disinfezione degli utensili.
- Preparare siringhe e aghi: una siringa da 20 mL per la perfusione, 23 g di aghi (circa 1 per gabbia) e 1 mL di siringa con 25 G di ago (1 per 3-5 mouse). Prima di pesare i tubi, aggiungere perline d'acciaio (nel cofano) ai tubi a vite a vite o-ring Da 1,5 mL (uno per ogni organo). I tubi devono essere appropriati per l'omogeneizzazione.
- Preparare il giorno della raccolta i materiali necessari per la perfusione e il congelamento degli organi.
- Riempire un secchio di ghiaccio con ghiaccio secco e 70% EtOH per fare un bagno di ghiaccio. Preparare la salina tamponata da fosfato sterile (PBS) supponendo che siano necessari 25-30 mL per mouse di PBS per ogni perfusione per ogni perfusione. Ottenere l'anestesia, un cocktail di ketamina e Xylazina, e assumere 300 L per topo. Collocare tutti i materiali e gli eventuali tubi aggiuntivi necessari per la citometria di flusso, ecc., in un contenitore secondario per il trasporto all'impianto animale.
- Seguire tutte le procedure necessarie per l'ingresso, tra cui indossare e doffing attrezzature di protezione personale durante l'ingresso e l'uscita nell'impianto per animali.
ATTENZIONE: Tutte le procedure devono essere eseguite in un armadio di biosicurezza certificato all'interno di un laboratorio di biosicurezza 2 (BSL-2). - Somministrare l'anestesia, 200-500 l, intraperitamente a seconda delle dimensioni e del peso dell'animale. Se si lavora da soli, somministrare l'anestesia a un animale alla volta per evitare di uccidere gli animali prima della raccolta degli organi.
- Confermare la dose di anestesia pizzicando l'alto con le pinze per valutare il riflesso del pedale. Non continuare a meno che non risponda completamente. Utilizzare i perni per fissare il mouse a una scheda di cera. A questo punto, douse il topo nel 70% di etanolo per evitare la contaminazione dei capelli nella procedura di raccolta dell'organo
- Sanguinamento terminale dalla foratura del cuore.
- Utilizzando le forbici e le pinze, aprire l'animale attraverso la cavità toracica per esporre il cuore. Raccogliere il sangue attraverso la puntura del cuore (800 dollari l), questo può essere utilizzato per più saggi tra cui chimica clinica, ematologia, citometria di flusso per rilevare risposte specifiche dell'antigene e PCR quantitativo in tempo reale (qRT-PCR) per l'analisi del numero di copia virale.
- Per l'analisi dell'RNA virale da qRT-PCR, raccogliere il sangue in un tubo EDTA se estraendo dal sangue intero o in un tubo di microcentrifuga se estrarre dal siero. (Per il siero, tubo di spin alla massima velocità in centrifuga, temperatura ambiente, per 20 min e rimuovere il siero in un tubo separato). Aggiungere una poliacrilammide lineare come supporto al campione di siero dopo la finitura. L'RNA può quindi essere analizzato o immagazzinato a -80 gradi centigradi per elaborare ulteriormente in un secondo momento.
- Riempire la siringa da 20 mL con PBS, a temperatura ambiente (o 37 gradi centigradi) e perfondere i topi inserendo l'ago della farfalla nel ventricolo sinistro. Forare l'atrio destro per consentire l'uscita di sangue e PBS. Somministrare lentamente il PBS mentre si controlla il colore del fegato per confermare che l'animale è completamente perfuso. Il fegato dovrebbe cambiare dal colore del salmone rosso intenso a quello rosa.
- Se si preparano gli organi per l'istologia, lasciare l'ago delle farfalle in posizione e poi perfondere con 20 mL di ghiaccio freddo 4% paraformaldeide. In tal caso, è conveniente collegare la siringa a un stopcock a 3 vie con entrambe le siringhe attaccate ad essa, ruotando la valvola ON e OFF come si alternano tra PBS e PFA.
- Raccogliere organi in tubi etichettati e pesati. Per gli organi periferici, seguire un ordine stabilito per il raccolto: fegato, milza, rene e polmoni.
- Prendere solo un lobo dal fegato; non importa quale, ma per tutti gli esperimenti cercare sempre di prendere lo stesso lobo con lo stesso pezzo di dimensioni. Allo stesso modo, per reni e polmoni, prendere lo stesso rene e polmone. Se anche la citometria di flusso deve essere completata, qualsiasi organo può essere tagliato a metà. Conservare la metà da utilizzare per la citometria nel roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) a temperatura ambiente fino al completamento del raccolto.
- Subito dopo la raccolta, mettere ogni organo in un tubo etichettato e mettere nel bagno di ghiaccio secco. Il titro dei virus si riduce nel tempo a temperatura ambiente, quindi la quantità di tempo necessaria per raccogliere gli organi è estremamente importante. Ci deve essere coerenza tra i topi, quindi dopo la sicurezza, la prossima priorità è la velocità.
NOT: Se la raccolta di organi per i titers virali, è molto utile avere un secondo raccolto individuale del cervello a questo punto, per preservare i titers virali.
- Rimuovere gli organi rimanenti dalla cavità del corpo del topo per ottenere l'accesso alla colonna vertebrale e al cranio.
- Rimuovere il mouse dalla scheda e rimuovere la pelle, seguita dalla rimozione delle braccia e delle gambe.
Rimuovere la testa del topo con una decapitazione, forbici smussate o chirurgiche per raccogliere il cervello tagliando il cranio con una forbice LaGrange seghettata attraverso il forame magnum. Quindi, staccare il cranio con le pinze e raccogliere il cervello con una spatola. - Utilizzando forbici forti e smussate, rimuovere le costole e altre ossa che circondano la colonna vertebrale. Quindi, tagliare l'osso pelvico, esponendo il forame vertebrale a livello lombare. La piccola punta del midollo spinale dovrebbe essere visibile a questo punto.
- Utilizzare una siringa da 10 mL riempita con PBS e un ago da 18 G per espellere il midollo spinale "svuotando" il midollo dallo zombi alla colonna vertebrale cervicale su una parabola Petri.
- Con attenzione, posizionare la punta smussata dell'ago all'interno del forame vertebrale, evitando una pressione eccessiva per evitare che l'ago superi il corpo vertebrale. Tenere fortemente per esercitare pressione sul corpo vertebrale e l'ago e premere lo stantuffo siringa per espellere il cavo. Trasferire immediatamente il midollo spinale nel tubo etichettato e metterlo nel bagno di ghiaccio secco.
- Rimuovere il mouse dalla scheda e rimuovere la pelle, seguita dalla rimozione delle braccia e delle gambe.
- Ripetere la procedura con tutti gli animali fino al completamento della raccolta. Posizionare gli strumenti di raccolta nel 70% di etanolo tra gli animali. Concentrati sulla coerenza e la velocità. Il periodo di tempo tra ogni raccolto di organi deve rimanere costante in modo da non bias risultati titra virali.
- Al termine, disinfettare l'armadio di biosicurezza e tutto il materiale prima di rimuoverlo dall'impianto animale.
- Rimuovere ogni tubo dal bagno di ghiaccio e pesare tubi per determinare il peso degli organi. Per determinare il peso degli organi, sottrarre il peso del tubo vuoto dal peso dell'organo contenente.
NOT: A questo punto gli organi possono essere congelati a -80 gradi per ulteriore elaborare in un secondo momento o gli organi possono essere omogeneizzati immediatamente prima del congelamento di singoli individui. Congelare i campioni di scongelamento più volte diminuisce il titro virale. Pertanto, è importante eseguire la stessa procedura per tutti gli esperimenti all'interno di un singolo progetto.
2. Omogeneizzazione degli organi
- Preparare 3 tubi a scatto etichettati da 1,5 mL per ogni organo da omogeneizzare.
- Se i campioni non vengono omogeneizzati subito dopo il raccolto, rimuovere i tubi da -80 gradi centigradi. Non è necessario che i campioni vengano scongelati per omogeneizzare.
- Mettere i campioni sul ghiaccio per tenerli freddi per ridurre al minimo la perdita virale titer. Quindi, aggiungere 1 mL di DMEM freddo contenente il 5% di FBS ad ogni organo contenente tubi.
- Battere immediatamente i tubi in battitore di perline secondo le istruzioni del produttore. Omogeneizzare tutti gli organi con perline d'acciaio in uno strumento omogeneizzato perline. Verificare che ogni organo sia stato completamente omogeneizzato.
- Abbassare i detriti di organo in microfuge a 12.000 x g per 5 min in un microfuge che è stato raffreddato a 8 gradi centigradi. Quindi riportare i tubi al secchio di ghiaccio. Nell'armadietto della biosicurezza, i campioni di aliquota in tubi per i test necessari. Quindi riportare i tubi al secchio di ghiaccio.
- Per la messa a fuoco formando il saggio, aliquota 500 L in un tubo etichettato. Quindi posizionare i tubi nel rack su un secchio di ghiaccio. Aliquota 50 -L in un tubo per RNA per quantitativo fluorogenico RT-PCR (qRT-PCR) per misurare il numero di copia del genoma virale.
- Isolare l'RNA totale dagli organi degli animali infetti utilizzando un kit commerciale di isolamento dell'RNA. Determinare l'RNA virale del flavivirus utilizzando la sonda primer imposta specifiche per la svelazione, che riconosce sequenze uniche in ogni genoma del flavivirus. Determinare il numero di copia virale utilizzando un plasmide di controllo della copia contenente un RNA positivo a filamento singolo definito generato in vitro utilizzando la polimerasi T7 contenente le sequenze bersaglio di .
- Aliquota il campione rimanente, che è di circa 300 gradi centigradi, nel terzo tubo e conservare a -80 gradi centigradi se necessario.
NOT: Se i campioni non sono stati congelati in precedenza, congelare a -80 gradi centigradi. Se i campioni erano stati precedentemente congelati, continuare sulla messa a fuoco formando saggio e/o isolamento dell'RNA prima di fermarsi.
3. Il saggio di messa a fuoco del virus zika26
NOT: È importante includere un controllo senza virus e un controllo positivo. Il controllo positivo è una serie di diluizione di uno stock di virus con una concentrazione nota. Non tutti i controlli devono essere sulla stessa piastra, ma come l'asino diventa più grande di 5 piastre, più controlli devono essere aggiunti, e sparsi tra le piastre. Fare attenzione a non graffiare il monostrato con le punte pipet o con lavaggio vigoroso. Più organi possono essere titeriti nello stesso giorno o in giorni diversi. Ma un singolo organo non dovrebbe essere titolato per più giorni perché diverse condizioni di analisi possono avere un impatto sul titro virale. Si raccomanda vivamente di eseguire un singolo organo in un solo giorno.
- Prima del giorno del saggio, preparare le cellule e i reagenti necessari per la formazione del saggio di messa a fuoco.
- Preparare supporti di crescita contenenti 500 mL di DMEM con 5 mL di HEPES e 25 mL di FBS. Avere cellule vero-Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) in crescita nei media di crescita a 37 gradi centigradi, 5% DI CO2 prima dell'inizio del saggio. Le cellule Vero non devono essere un passaggio elevato o mai coltivate oltre la confluenza del 100% prima dell'inizio del saggio.
- Preparare 500 mL di una soluzione di metilcellulosa 2% autoclavando una bottiglia di 1 L di vetro media con 10 g di metilcellulosa e una grande barra di stir e una bottiglia di vetro da 1 L separata con 500 mL di H2O. Se l'acqua autoclaved ha raffreddato il riscaldamento nel microonde fino a quando la bottiglia è calda al tatto, ma non bollente.
- Versare delicatamente acqua calda/calda in bottiglia di metilcellulosa mentre si trova nella cappa di coltura dei tessuti. Parzialmente tappo bottiglia e mescolare sulla piastra calda fino a quando la metilcellulosa è in soluzione (1-4 h). Aliquota la soluzione di metilcellulosa 2% in tubo conico sterile da 50 mL. 2% La metilcellulosa può essere conservata a 4 gradi centigradi fino a quando necessario.
- Preparare una soluzione di paraformaldeide del 5% in PBS per il fissaggio delle piastre e conservata a 4 gradi centigradi fino a quando necessario. Preparare un buffer di lavaggio di scansione di formazione di 1x aggiungendo 0,05% Triton X-100 a PBS e memorizzato in RTS. Preparare un buffer di colorazione 1x FFA aggiungendo 1 mg /mL di saponina al PBS e conservato a 4 gradi centigradi fino a quando necessario. Questi possono essere preparati con una o due settimane di anticipo.
- Calcolare il numero di 96 lastre ben piastre piatte necessarie per l'analisi in modo che ogni organo è placcato in triplice copia. Includere abbastanza pozzi aggiuntivi per controlli positivi e negativi.
- Crescere abbastanza vero cellule nei media di crescita per completare il saggio progettato. Provare le cellule Vero e contarle risuspendendole a 1,5 x 105 cellule per mL nei media di crescita. Cellule di piastre Vero nelle 96 lastre ben piatte a 3,0 x 104 cellule Vero-Oche/bene nei mezzi di crescita aggiungendo 200 l per pozzo.
- Incubare le piastre a 37 gradi centigradi al 5% di CO2 durante la notte, assicurarsi che le piastre siano livellate nell'incubatrice in modo che le cellule siano distribuite equamente all'interno del pozzo.
NOT: Ogni laboratorio cresce le cellule Vero in modo leggermente diverso; l'obiettivo è un monostrato confluente del 90-95% in ogni pozzo il giorno dell'estrutraggio per il virus .
- Diluire i campioni del virus zika il giorno del test. Se i campioni d'organo erano stati precedentemente omogeneizzati, rimuovere i campioni dal congelatore -80 gradi centigradi e lasciarli scongelare prima di posizionare i campioni sul ghiaccio per il saggio.
- Sul ghiaccio, preparate una piastra rotonda di 96 pozzetto aggiungendo 180 l di mezzi di crescita freddi alle file da B a H lasciando vuota la fila A. Aggiungere 150 l di ogni campione di organo omogeneizzato alla fila A della piastra inferiore rotonda.
- Preparare le diluizioni seriali di 10 volte di ogni campione, utilizzando una pipetta multicanale. Diluire i campioni in una piastra rotonda inferiore 96 pozzo aggiungendo 20 l di campione in 180 l di mezzi di crescita, cambiando punte pipette tra ogni diluizione.
- Preparare la piastra di formazione della messa a fuoco rimuovendo il supporto dal piatto piatto 96 bene piastra che copre le cellule Vero. Eseguire questa operazione immediatamente prima di aggiungere i campioni di virus per evitare che il monostrato si secchi.
- Aggiungere 100 l di luizione a ciascun pozzo nella piastra Vero. Aggiungere il campione utilizzando lo stesso set di punte passando dalla concentrazione più bassa a quella più alta. Piatti rocciosi da un lato all'altro 2-4 volte facendo attenzione a non turbinare.
- Incubare a 37 gradi centigradi, 5% DI CO2 per 1-2 h. Assicurarsi che le piastre siano livellate all'interno dell'incubatrice. Durante l'incubazione riscaldare 2% metilcellulosa a RT.
- Diluire la soluzione di metilcellulosa del 2% nei mezzi di crescita. La diluizione dovrebbe essere pari a circa 2,1 di metilcellulosa del 2% e dei media di crescita. Tenere in camera temporanea fino a quando non è il momento di usarlo. Aggiungere 1-2 gocce/pozza (impostare il pipet a 125 l) della metilcellulosa: mezzi di crescita per ogni pozzo del pozzo 96.
- Incubare 32-40 h a 37 , 5% CO2. Poiché le cellule Vero di tutti crescono in modo leggermente diverso e fattori, tra cui la confluenza cellulare e il ceppo del virus zoika, possono cambiare il tempo di incubazione.
- Fissare le cellule Vero utilizzando la soluzione di paraformaldeide preparata 5%.
- Aggiungete 50 L del 5% di paraformaldeide a ogni ben sopra la cima dello strato di metilcellulosa nell'armadietto della biosicurezza. Incubare per 60 min a RT. Il fissaggio può andare durante la notte a 4 gradi centigradi, ma coprire la piastra con parafilm per ridurre l'evaporazione.
- Dump overlay e supporti fuori le cellule in un contenitore di smaltimento all'interno dell'armadietto della biosicurezza. Lavare delicatamente con PBS, 150 gradi/pozzo. Rimuovere PBS dalle piastre e rimuovere la piastra dal BSL-2.
- Ripetere il lavaggio PBS 2x aggiungendo 150 l/pozzo. Quindi rimuovere il PBS. Aggiungete 150 l/po 1x buffer di lavaggio FFA e lasciate sporre per 5-10 min a RT per permeabilizzare le cellule fisse.
- Rilevare l'infezione usando l'anticorpo primario di zika. Preparare l'anticorpo primario 4G2 (D1-4G2-4-15) ad una concentrazione di 1 mg/mL nel buffer di colorazione FFA. Preparare abbastanza anticorpo per l'intero saggio.
NOT: Stare lontano dai pannolini da laboratorio o da altro materiale assorbente ad alta influenza, poiché le fibre avranno un impatto negativo sull'imaging dei foci.- Rimuovere il buffer di lavaggio FFA dalle piastre. Aggiungere 50 l/pozzedell'anticorpo primario nel tampone di colorazione FFA. Sigillare le piastre con il parafilm e incubare durante la notte a 4 gradi centigradi su una piattaforma a dondolo. Il saggio può essere fatto con un'incubazione per 2 h a RT.
- Visualizza l'infezione con l'aggiunta di un anticorpo coniugato HRP secondario. Preparare l'anticorpo secondario con etichetta HRP con etichetta HRP con etichetta 1:5.000 nel buffer di colorazione FFA. Preparare abbastanza anticorpo per l'intero saggio.
- Lavare le celle 3x con buffer di lavaggio FFA, rimuovendo il buffer di lavaggio sfogliando ogni volta nel lavandino. Macchiare le cellule con l'anticorpo secondario nel tampone di colorazione FFA a 50 . Incubare 1-2 h a RT.
- Lavare le celle 3x con buffer di lavaggio FFA, rimuovendo il buffer di lavaggio sfogliando ogni volta nel lavandino. Aggiungete 50 l/pozzetto del substrato Trueblue.
- Guarda le piastre con attenzione, aspettando 2-15 min fino a quando le macchie sono completamente definite e sfondo minimo. Dopo che le macchie sono visibili, lavare delicatamente con acqua, utilizzando una mano per proteggere il monostrato dalla forza dell'acqua che scorre. Toccare asciugare su carta assorbente (NOT DIAPERS) e l'immagine il prima possibile.
- I punti possono essere conteggiati manualmente o utilizzando un contatore spot automatizzato. Se conteggiato manualmente, un ambito di sezionato può essere utilizzato per facilitare la visualizzazione.
- Per ogni campione, selezionare una diluizione con foci facilmente distinguibili (ad esempio, da 20 a 200 per pozzo) e calcolare il titer in unità di messa a fuoco per mL (FFU/ml), utilizzando la media dei pozzetti duplicati: FFU/mL (media foci/bene) ( fattore di diluizione) (mL inoculum).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Per valutare i titori di iKV utilizzando il protocollo descritto sopra Ifnar1-/- i topi sono stati infettati con l'iKV (PRVABC59) tramite iniezione sottocutanea (SC) al footpad. Qui, l'amministrazione di 1 x 105 FFU di IKV a 8-12 settimana di età Ifnar1-/- topi SC non è letale, ma il virus può replicare sia nella periferia e CNS. Questa dose e percorso vengono utilizzati per studiare le risposte immunitarie dei patogeni ospiti e la patogenicità. L'inserimento di 1 x 105 FFU di IKV a un'iniezione intravenosa (IV) di 8-12 settimane è compresa tra l'80 e il 100%, con l'animale che soccombe all'infezione tra 8-14 giorni dopo l'iniezione di virus. Usiamo abitualmente questo percorso di somministrazione per determinare l'efficacia degli antivirali e delle terapie, nonché il test preclinico dei candidati al vaccino.
Quattro topi Ifnar1-//- di 10-12 settimane sono stati infettati con 1 x 105 FFU di IKV SC e milza, fegati, reni, midollo spinali e cervelli sono stati raccolti quattro giorni dopo l'infezione con i metodi descritti sopra (Figura 1). La quantità di iKV nei tessuti è stata studiata formando il saggio di messa a fuoco (FFA) utilizzando le cellule Vero in un formato ben 96 come descritto sopra. Utilizzando l'AFF, il carico virale dei tessuti è espresso come unità di formazione di messa a fuoco (FFU) per g di tessuto. Simile a quello che è stato osservato in un precedente studio dell'infezione da IKV di Ifnar1-/- 26, abbiamo visto la viremia a seguito di un campionamento di titori virali in diversi organi quattro giorni dopo l'infezione da .IKV. Questi risultati indicano che i metodi utilizzati per la raccolta degli organi e tittering da attenzione formando saggio può essere utilizzato per rilevare titro in entrambi gli organi periferici e il SNC all'interno dello stesso animale. È interessante notare che, non ci aspettavamo di vedere alti titori virali sia in periferia e il CNS quattro giorni dopo l'infezione nei topi Ifnar1-/- perché tutti i Tostici Ifnar1-/- sopravvivono all'infezione da IKV con questa dose e percorso. Stiamo continuando a esplorare questa osservazione per capire come la .IKV possa continuare a replicarsi nel CNS di Ifnar1-/- senza causare letalità.
Quando si esegue l'esecuzione della messa a fuoco formando test (FFA), ci sono più errori tecnici che uno investigatore può fare che si tradurrà in risultati FFA non ottimali. Gli errori più comuni sono: 1) tossicità degli organi; 2) tubi vigorosi; 3) contaminazione da fibre; e 4) densità di placcatura cellulare non corretta. Discutere ciascuno di questi problemi di seguito e illustrare il risultato in Figura 2. Uno dei problemi più comuni che si verifica sia con il FFA e placca ssay è la tossicità degli organi (Figura2A freccia rossa). Crediamo che la tossicità degli organi sia guidata dall'alta concentrazione di componenti intracellulari rilasciati durante l'omogeneizzazione degli organi. La tossicità degli organi varia in base all'organo ed è osservata negli organi raccolti da animali non infetti, con il fegato che è il più tossico e la milza meno. La tossicità è ridotta in quanto l'organo viene diluito in serie sulla piastra FFA. Tuttavia, la tossicità altera la sensibilità del saggio con conseguente cambiamento nel limite di rilevamento. Come mostrato nella Figura 2A se il titolo virale nell'organo è inferiore alla tossicità, l'FFA non sarà in grado di registrare con precisione i titori virali. La figura 2B illustra la tossicità nei pozzi a1-4, ma il titolo virale è sufficientemente alto da superare la tossicità degli organi, come si vede nei pozzi b3 e b4. Per superare questa limitazione nell'AFF, eseguiamo anche la PCR quantitativa in tempo reale su campioni di titro degli organi. Nella figura 2Cvengono illustrati diversi errori tecnici comuni. La pipettatura o il lavaggio vigoroso possono rimuovere il monostrato (Figura 2C, ) se ciò si verifica in pozzi con foci, i dati andranno persi portando a una segnalazione imprecisa dei risultati del titratore. Fibre o peli, che sono presenti in carta assorbente banco laboratorio può contaminare singoli pozzi (Figura 2C, ) questo può causare errori significativi se si utilizza un programma di conteggio automatizzato. Mentre la maggior parte dei programmi di conteggio automatizzato hanno opzioni di esclusione della fibra, non abbiamo trovato altamente efficace nell'escludere fibre dall'analisi. La soluzione a questo è quello di contare manualmente i pozzi, che può richiedere molto tempo e non è pratico per l'analisi di grandi saggi. La densità cellulare è un altro problema che può avere un impatto drammatico sul successo di un analisi di messa a fuoco (Figura 2D). Se le celle non sono alla giusta densità all'inizio del saggio, il numero e le dimensioni delle macchie saranno influenzati. Come mostrato nella Figura 2D, le colonne 1-3, le cellule a circa il 60% di confluenza all'inizio del saggio rispetto alle cellule placcate al 90% colonne di confluenza 4-6 avranno un impatto drammatico sul saggio di messa a fuoco. Per superare questo ostacolo, piccoli saggi pilota dovrebbero essere eseguiti per ottimizzare la densità delle cellule e i tempi di fissaggio, poiché le singole condizioni di laboratorio avranno un impatto sul successo del saggio.
Per gli studi in cui vengono confrontati diversi gruppi di animali infetti, l'analisi statistica eseguita dipende dalla distribuzione dei dati. I test parametrici o non parametrici vengono utilizzati per valutare la significatività statistica. Per i test parametrici, ANOVA viene utilizzato per rilevare l'effetto complessivo e singoli gruppi di trattamento verranno confrontati utilizzando il test di Dunn. Nel caso in cui la distribuzione dei dati non soddisfi i requisiti per l'analisi parametrica, vengono utilizzati test non parametrici. Il test Kruskal-Wallis viene utilizzato per rilevare l'effetto del trattamento complessivo, e il test Mann-Whitney U viene utilizzato per eseguire confronti a coppie. Per i risultati qui presenti non abbiamo confrontato gli animali con un secondo set di dati raccolto in questo momento, quindi non abbiamo eseguito analisi statistiche sul set di dati mostrato.
Figura 1: Replica virale nella periferia e nel SNC. L'onere virale nei tessuti periferici e CNS dopo IFNAR1-/- topi sono dati 1x105 FFU di IKV SC. Il giorno 4 (n 4 per gruppo) sono stati raccolti organi post-infezione, snap congelati, pesati e omogeneizzati. I livelli di virus sono stati quantificati dalla messa a fuoco formando saggio. Il limite di rilevazione è 100-500 FFU/grammo basato sull'organo. I dati vengono visualizzati come Log10 focus-forming unit per grammo di tessuto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Difficoltà comuni con il saggio di formazione della messa a fuoco. Per tutti i saggi di formazione mostrati l'antigene virale è stato rilevato con un MAb anti-flavivirus, seguito da colorazione immunoperossidasi (viola). (A) Le cellule Vero sono state coltivate fino a una confluenza del 90% e infettate da una diluizione seriale di 10 volte del supernatante dal fegato raccolto da un topo C57BL/6 di 8 settimane, IV infettato da 5 x 107 FFU di IKV 4 giorni prima. La freccia rossa indica la più alta o "neat" concentrazione di epatico supernatante che dimostra la tossicità a questa concentrazione. (B) Le cellule vero sono cresciute fino a una confluenza del 90% e infettate da una diluizione di 10 volte di supernatante da cellule renali infette da IKV. In questo caso i campioni nelle colonne 1 e 2 provengono da un mouse C57BL/6 e col 3 e 4 provengono da ifnar1-/-. Entrambi i topi erano 8 settimane infettati con 1 x 105 FFU di IKV IV e sacrificato 4 giorni dopo l'infezione. Simile a (A) c'è una certa tossicità osservata alla più alta concentrazione (riga a), ma i titer virali osservati nella colonna 3 e 4 superano il limite di problemi di rilevamento che consentono di rilevare titer accurati. (C) Le cellule Vero sono state placcate. I pozzi selezionati mostrano errori tecnici comuni. Il simbolo : mostra un'area in cui il monostrato è stato rimosso a causa di una vigorosa pipettatura. Il s è posto su un pozzo dove si può vedere una fibra. (D) La concentrazione delle cellule vero influisce sulla sensibilità dell'analisi. In questo piatto le cellule Vero erano placcate a 1,0 x 104 celle / bene nella colonna 1-3 e 3,0 x 104 cellule Vero-OMS / bene nella colonna 4-6. Poi la piastra è stata infettata con diluizioni di 10 volte di prVABC59. I campioni di concentrazione virale più alti sono nella fila A e diluiti verso il basso, con ogni riga che rappresenta una diluizione di 10 volte. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'infezione da IKV può causare una malattia neurologica, quindi gli attuali modelli animali per studiare la patogenesi, le risposte immunitarie e l'efficacia protettiva dei vaccini e degli antivirali devono concentrarsi sul controllo virale all'interno del SNC. Una delle sfide nel concentrarsi sulla malattia del SNC è che spesso va a scapito dello studio dell'infezione periferica. I metodi di isolamento dell'organo qui proposti si concentrano sulla necessità di valutare rapidamente l'infezione da IKV sia nella periferia che nel SNC al fine di valutare la malattia associata a Vaccini. Un ulteriore vantaggio di questa tecnica è che consente anche un alto grado di flessibilità, compreso lo studio combinato delle risposte immunologiche allo ziKV o l'analisi istologica dell'infezione. Questa tecnica, non è limitata solo a iKV, ma può anche essere universalmente applicata per studiare una serie di interazioni ospite-patogeni, tra cui flavivirus come il virus Dengue21, ortopoxvirus come il vaiolo delle scimmie e l'ectromelia. Le considerazioni e gli svantaggi di questa tecnica di raccolta si concentrano principalmente sulle capacità dello sperimentatore. Dato che la temperatura ambiente non è stabile per lunghi periodi di tempo, la quantità di tempo necessaria per raccogliere gli organi dopo la perfusione può influire in modo significativo sulla qualità dei risultati. Per la maggior parte degli esperimenti che abbiamo eseguito, confrontiamo i titoli virali dei topi trattati con due condizioni, quindi concentriamo i nostri sforzi sulla coerenza del tempo tra i raccolti degli organi non sulla velocità. In questo modo la stessa persona esegue la stessa procedura per l'intero esperimento per mantenere la coerenza. L'altra considerazione principale con questa procedura è la sicurezza, abbiamo prontamente eseguito questi metodi con agenti patogeni BSL-2 (virus Dengue) e BSL-3 (WNV, virus Chikungunya). È molto importante eseguire tutte le procedure in un armadio di biosicurezza pulito, ben mantenuto e certificato con disinfettante.
Un FFA è parallelo al saggio della placca, ad eccezione del fatto che utilizza l'immunostaining perossidasi per identificare i fomi delle cellule infette, piuttosto che le placche. Il mio laboratorio e molti altri laboratori sono ora passati con successo all'utilizzo di FFA per tutti i nostri esperimenti tittering11,14,15,17,26,27 ,28. L'AFF ha molteplici vantaggi rispetto al tradizionale saggio della placca: a) L'FFA è più veloce, richiedendo un'incubazione più breve rispetto a un analisi della placca, b) è anche una maggiore produttività, eseguita in piastre di 96 pozzetti. Il formato 96 pozzo può anche ospitare piccoli volumi di materiale di partenza. Inoltre, c) l'FFA è compatibile con l'uso di una lavatrice a lamiera automatizzata e di un contatore spot automatizzato, riducendo notevolmente il lavoro e il tempo necessari per il saggio. L'AFF ha più passaggi dopo l'infezione, ma d) con l'uso di pipet multicanale, o anche un robot pipettaggio, i tempi per la maggior parte dei passi di analisi dopo la fissazione sono flessibili e il saggio può essere sospeso durante la notte o più a lungo. Infine, e) può essere particolarmente utile per i ceppi di virus che non formano placche chiare, come il virus Dengue. Uno svantaggio dell'AFF è che richiede anticorpi specifici per rilevare le cellule infettate da virus, che possono essere confusi quando si considerano diversi ceppi di virus o virus mutanti. Per l'AFF come con il saggio placca la densità del monostrato cellulare al momento dell'infezione è fondamentale per il successo del saggio. Le cellule devono essere utilizzate a confluenza più elevata per un FFA rispetto a un saggio di placca, a causa del periodo di tempo ridotto prima della fissazione. Poiché l'AFFè è una maggiore produttività, più conveniente e più veloce rispetto al tradizionale test della placca, consente al mio laboratorio di analizzare rapidamente i dati per studiare le malattie infettive emergenti. L'AFF è più cumulativamente più conveniente per diversi motivi. Anche se gli anticorpi sono più costosi del rosso neutro o del viola cristallo, siamo in grado di analizzare più campioni per piastra che elimina la differenza di costo. In termini di allocazione della manodopera, il conteggio automatico degli spot e la facile immissione dei dati per l'analisi limitano i costi della manodopera e la possibilità di avere un'immagine a lungo termine come record è difficile da quantificare. Il futuro di questo saggio potrebbe essere quello di passare a un foci fluorescente per una lettura al contrario di HRP. Quantitante l'intensità fluorescente insieme al numero spot estenderanno l'utilità dell'FFA oltre a quanto attualmente studiato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Acknowledgments
Dr. Pinto è finanziato da una sovvenzione di seme della Saint Louis University School of Medicine e fondi di avvio dalla Saint Louis University School of Medicine. Il Dr. Brien è finanziato da un K22AI104794 premio ricercatore precoce dal NIH NIAID e una sovvenzione di seme dalla Saint Louis University School. Per tutte le persone finanziate, i finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18 G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1 cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37 °C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96 well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5 mL eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| Curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose With 4,500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5 mL EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| O-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| One step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| Spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| Straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
References
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
- McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
- Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
- Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
- Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
- Brien, J. D. Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , Oregon Health & Science University. (2007).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
- Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
- Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
- Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
- Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
- Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
- Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
- Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
- Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
- Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
- Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).
