Summary
このプロトコルの目的は、感染後にマウスの複数の器官からジカウイルスを分離および定量化することによってウイルス性疾患を調査するために使用される技術を実証することです。
Abstract
提示されている方法は、ジカウイルス感染動物からの臓器の単離およびウイルス負荷の定量化のための実験室手順を示す。この手順の目的は、感染後の異なる時点または異なる実験条件下でマウスの末梢およびCNS領域におけるウイルス力を定量化し、ジカウイルス感染を調節するウイルス学的および免疫学的要因を同定することです。実証された臓器分離手順は、ウイルス力価の焦点形成アッセイ定量と定量的PCR評価の両方を可能にする。急速な器官の隔離の技術はウイルスの間数の維持のために設計されている。フォーカス形成アッセイによるウイルスチター定量は、ジカウイルスの迅速なスループット評価を可能にする。焦点形成アッセイの利点は、感染性ウイルスの評価であり、このアッセイの限界は、検出の限界を減少する器官毒性の可能性である。ウイルス価価評価は定量的PCRと組み合わせられ、臓器内の組換えRNAコピー制御ウイルスゲノムコピー数を使用して検出の限界を低く評価する。全体的にこれらの技術は、ジカウイルス感染動物の周辺およびCNSにおけるジカウイルス力挙子の分析のための正確な迅速な高スループット法を提供し、ほとんどの感染動物の器官におけるウイルス力中剤の評価に適用することができるデングウイルスを含む病原体。
Introduction
ジカウイルス(ZIKV)は、フラボリダ科に属するアルボウイルスであり、ポワッサンウイルス(POWV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、および西ナイルウイルス(WNV)1などの重要な神経侵襲性ヒト病原体を含む。その隔離と同定に続いて、アフリカとアジア2、3、4、5、および中南米内の流行のヒトZIKV感染の定期的な報告があった(参照6)しかし、ZIKVが重篤な疾患7を引き起こすと考えられていたのは最近になってからでした。現在、ZIKV感染に関連する神経疾患および出生時欠損の症例が数千例ある。ZIKVの急速な出現は、疾患の重症度の増加がある理由、ZIKV感染に対する免疫学的反応とは何か、神経学的増加に関連するウイルスおよび/または免疫媒介病理があるか、に関連する多くの疑問を引き起こしている。症状と出生時欠損。現在、ZIKVに関連する中枢神経系(CNS)関連疾患と、ZIKVに対する抗ウイルスおよびワクチンの有効性を迅速にテストする必要性を理解するラッシュがあります。このような背景から、ZIKV特異的フォーカス成形アッセイ(FFA)を用いた周辺およびCNSの両方におけるZIKV力中剤の迅速な分析方法を開発したのです。
小動物モデルは、疾患の進行を理解し、ワクチン、治療薬、抗ウイルス剤の早期評価のために重要です。我々は、ウイルス病原体8、9、10、11に対するヒト感染と保護をモデル化するために様々なマウス株を使用して、アルボウイルス病の研究のための小動物モデルを確立しました。 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21、22。この経験を活かして、WNVおよびデングウイルス、CNS21、23の両方の末梢器官におけるZIKV力価の評価のための関連フラビウイルスの評価に用いられる技術を改変し始めました。24.他のアッセイに対するこれらの方法の利点: 1) 彼らは分析のための末梢とCNS臓器の両方を収穫する能力を組み合わせること;2)方法は、同じ器官内の同じ動物上のウイルス力と一緒に、自然および適応免疫応答の測定のために、フローサイトメトリーに適応可能である。3)収穫技術は組織学的分析に適応可能である。4)ZIKV FFAは、ウイルス力板分析のための急速な高スループット法です。5)これらの方法は、ほとんどの病原体25に感染した動物の器官におけるウイルス力学者の評価に適用することができる。
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Protocol
本研究のすべての手順は、セントルイス大学動物ケア・使用委員会が定めたガイドラインに従っています。SLUは、ラボアニマルケアインターナショナル(AAALAC)の評価と認定協会によって完全に認定されています。
1. 臓器分離
注:ウイルスは室温(RT)で安定していないため、一度に採取した動物の数は、ウイルスの水位を維持するために慎重に計画する必要があります。
- 選択した用量および経路を使用してマウスに感染し、必要な表現型に基づく。このプロトコルでは、8-10週齢の男性および雌型Iインターフェロン受容体欠損(Ifnar1-/-)C57BL/6マウスに感染する。
- ケタミン(90mg/kg)とキシラジン(10mg/kg)のカクテルでIfnar1-/-マウスを麻酔する。麻酔を確認するためにしっかりしたつま先のピンチによるテストペダル反射。フットパッドを介して50μL皮下(SC)でZIKVの1 x 105フォーカス形成ユニット(FFU)を投与する。
- 前日の収穫に必要なすべての材料を準備する:ツールの消毒のための50 mL円錐形で2ハサミ、鉗子と70%エタノール(EtOH)の20 mL。
- 注射器および針を準備する:灌流のための20 mLの注射器、23 Gの針(ケージごとのおよそ1)および25 Gの針が付いている1 mLの注射器(3-5マウスごとに1つ)。チューブの計量の前に、1.5 mL Oリングスクリューキャップチューブ(各器官に1つ)にスチールビーズ(フード内)を追加します。チューブは均質化に適している必要があります。
- 灌流と臓器凍結に必要な材料を収穫の日を準備します。
- アイスバケツにドライアイスと70%のEtOHを入れ、氷浴を作ります。各灌流に対してPBSのマウス当たり25〜30mLが脊髄に対して5〜10mL必要であると仮定して、無菌リン酸緩衝生理食生(PBS)を調製する。ケタミンとキシラジンのカクテルである麻酔を得て、マウス当たり300μLを仮定する。すべての材料とフローサイトメトリーなどに必要な追加チューブを二次容器に入れ、動物施設に輸送します。
- 動物施設への入退館時に個人用保護具のドニングや脱ぎ捨てを含む、入国に必要なすべての手続きに従ってください。
注意:すべての手順は、バイオセーフティレベル2ラボ(BSL-2)施設内の認定バイオセーフティキャビネットで行われる予定です。 - 動物の大きさおよび重量に応じて、200〜500 μL、経後経口麻酔を投与する。一人で働く場合は、臓器収穫前に動物を殺すことを避けるために、一度に1匹の動物に麻酔を投与する。
- ペダル反射を評価するために鉗子でつま先をつまむことで麻酔用量を確認します。完全に応答しない場合を除き、続行しないでください。ピンを使用して、マウスをワックスボードに固定します。この時点で、臓器収穫手順で毛髪汚染を避けるために、70%のエタノールでマウスを使用します。
- 心臓穿刺で出血した
- はさみと鉗子を使用して、胸腔を通して動物を開き、心臓を露出させます。心臓穿刺(〜800 μL)を介して血液を収集し、これは、臨床化学、血液学、抗原特異的応答を検出するためのフローサイトメトリー、およびウイルスコピー数の分析のためのリアルタイム定量PCR(qRT-PCR)を含む複数のアッセイに使用することができます。
- qRT-PCRによるウイルスRNA分析の場合は、全血から抽出する場合はEDTAチューブまたはマイクロ遠心管で血液を採取し、血清から抽出する場合は、EDTAチューブに血液を採取する。(血清の場合は、遠心分離機で最高速度でチューブをスピンし、室温、20分間、別のチューブに血清を取り除きます。仕上げ後の血清試料にキャリアとして線形ポリアクリルアミドを添加する。RNAは、後日さらに処理するために-80°Cで分析または保存することができます。
- 20 mL注射器を室温(または37°C)でPBSで充填し、蝶の針を左心室に挿入してマウスを透過させます。血液とPBSが出るように右のアトリウムを穿刺する。動物が完全に浸透していることを確認するために、肝臓の色を確認しながら、ゆっくりとPBSを投与します。肝臓は深い赤からピンクのサーモンの色に変わるべきです。
- 組織学のための器官を準備する場合は、所定の位置に蝶の針を残し、氷冷4%パラホルムアルデヒドの20 mLを注入します。その場合は、両方の注射器を取り付けた3ウェイストップコックにシリンジを接続し、PBSとPFAの間で交互にバルブをONとOFFにすると便利です。
- 標識された、重量を量ったチューブに器官を収穫する。末梢臓器の場合は、肝臓、脾臓、腎臓、肺:収穫のための確立された順序に従ってください。
- 肝臓から 1 つのローブだけを取る;それはどちらでもかまいませんが、すべての実験のために常に同じサイズのピースで同じローブを取ろうとします。同様に、腎臓と肺の場合、同じ腎臓と肺を取る。フローサイトメトリーも完了する場合は、任意の臓器を半分にカットすることができます。収穫が完了するまで、室温でロズウェルパーク記念研究所媒体(RPMI)にサイトメトリーに使用する半分を保存します。
- 収穫直後、ラベル付きチューブに各臓器を入れ、ドライアイスバスに入れます。ウイルス力は室温で時間の経過とともに減少するので、臓器の収穫にかかる時間は非常に重要です。マウス間に一貫性が必要なので、安全性の後、次の優先事項は速度です。
注:ウイルスの有人のための器官を収穫する場合、ウイルスの有人を維持するために、この時点で脳を収穫する第二の個人を持つことは非常に有用である。
- マウスの体腔から残りの臓器を取り除き、脊椎と頭蓋骨にアクセスします。
- ボードからマウスを取り外し、ペルトを取り外し、その後腕と脚を取り外します。
頭蓋骨、鈍い、または外科的なはさみでマウスの頭部を取り除き、頭蓋骨を鋸歯状のラグランジはさみで切断して脳を収穫します。その後、鉗子で頭蓋骨を剥がし、へらで脳をすくい取ります。 - 強く鈍いはさみを使用して、背骨を囲む肋骨および他の骨を取り除く。次いで、骨盤骨を横切って切断し、腰椎レベルで椎体前駆体を露出させる。脊髄の小さな先端は、この時点で表示される必要があります。
- PBSで満たされた10 mL注射器と18Gの針を使用して、ペトリ皿の上に腰椎から頸椎にコードを「洗い流す」ことで脊髄を排出します。
- 慎重に、脊椎前駆体の内側に針のベベル先端を置き、脊椎体に侵入する針を防ぐために過度の圧力を避けます。椎骨体と針に圧力をかけ、注射器プランジャーを押してコードを吐き出します。直ちにラベル付きチューブ内の脊髄を移し、ドライアイスバスに入れます。
- ボードからマウスを取り外し、ペルトを取り外し、その後腕と脚を取り外します。
- 収穫が完了するまで、すべての動物と手順を繰り返します。収穫道具を動物の間の70%エタノールに入れなさい。一貫性とスピードに重点を置く。各臓器収穫の間の時間の長さは、ウイルスのチターの結果を偏らないように一貫性を保つべきである。
- 完成したら、動物施設から取り出す前に、バイオセーフティキャビネットとすべての材料を消毒してください。
- 氷浴から各チューブを取り外し、チューブの重量を量り、臓器の重量を決定します。臓器重量を決定するには、空のチューブの重量をチューブを含む器官の重量から減算する。
注:この時点で臓器は-80°Cで凍結することができ、後日さらに処理するか、または個々のアリコートを凍結する直前に器官を均質化することができる。解凍サンプルを複数回凍結すると、ウイルスの定率が低下する。したがって、1 つのプロジェクト内のすべての実験に対して同じ手順を実行することが重要です。
2. 臓器均質化
- 均質化される各器官のための3つの標識された、1.5 mLのスナップキャップチューブを準備する。
- サンプルが収穫直後に均質化されていない場合は、-80°Cからチューブを取り除きます。サンプルは均質化するために解凍する必要はない。
- ウイルスの水手の損失を最小限に抑えるために、それらを冷たく保つために氷の上にサンプルを置きます。次に、チューブを含む各器官に5%FBSを含む冷たいDMEMを1mL加える。
- メーカーの指示に従って、すぐにビーズビーターでチューブを打ちます。ビーズホモジナイザー器具にスチールビーズですべての器官を均質化します。各臓器が完全に均質化されていることを確認します。
- 8°Cに冷やしたマイクロフュージで12,000 x gで5分間、マイクロフュージでオルガンの破片をスピンダウンします。その後、チューブをアイスバケツに戻します。バイオセーフティキャビネットでは、必要なアッセイのためにアリコートサンプルをチューブに入れます。その後、チューブをアイスバケツに戻します。
- フォーカス成形アッセイの場合、アリコート500μLを標識チューブに入れます。その後、アイスバケツのラックにチューブを置きます。ウイルスゲノムコピー数を測定するフッ素性定量RT-PCR(qRT-PCR)用RNA用チューブにアリコート50μL。
- 市販のRNA単離キットを使用して、感染した動物の臓器から総RNAを単離します。各フラビウイルスゲノムの一意の配列を認識するZIKVに特異的なプライマープローブセットを使用してフラビウイルスウイルスRNAを決定する。ZIKV標的配列を含むT7ポリメラーゼを用いてインビトロで生成された定義された正の一本鎖RNAを含むコピーコントロールプラスミドを用いてウイルスコピー番号を決定する。
- 残りのサンプル(約300μL)を第3管に入れ、必要に応じて-80°Cで保存します。
注:サンプルが以前に凍結されていない場合は、-80 °Cで凍結します。サンプルが以前に凍結されていた場合は、停止する前にフォーカス形成アッセイおよび/またはRNA単離に進みます。
3. ジカウイルスフォーカス形成アッセイ26
注:ウイルス制御なしと陽性コントロールを含める必要があります。陽性対照は、既知の濃度を有するウイルスストックの希釈系列である。すべてのコントロールが同じプレート上にある必要はありませんが、アッセイが5プレートより大きくなるにつれて、より多くのコントロールを追加し、プレート間に広げる必要があります。ピペ状の先端や激しい洗浄で単層を傷つけないように注意してください。複数の臓器は、同じ日または異なる日につらすことができます。しかし、異なるアッセイ条件がウイルスの太る色合いに影響を与える可能性があるため、個々の臓器を複数日にわたって動かすべきではありません。1日に個々の臓器を動かすことを強くお勧めします。
- アッセイの日の前に、焦点形成アッセイに必要な細胞および試薬を調記する。
- 500 mLのDMEMを5mLのHEPESと25mLのFBSで含む成長培った培画像を調調します。ベロ世界保健機関(WHO)細胞は、アッセイ開始前に37°C、5%CO2で増殖する細胞を持っています。Vero細胞は、アッセイの開始前に高い通路またはこれまでに100%の合流性以上に成長してはなりません。
- 1Lガラス媒体ボトルを10gのメチルセルロースと大きな攪拌棒とH2Oの500mLの別個の1Lガラス媒体ボトルでオートクレーブで500mLの2%メチルセルロース溶液を調製する。オートクレーブ水が電子レンジで再加熱した場合は、ボトルが熱くなるまで、沸騰しません。
- 組織培養フードの中でメチルセルロースのボトルに温かい/お湯を穏やかに注ぎます。部分的にキャップボトルとメチルセルロースが溶液(1-4 h)になるまでホットプレート上でかき混ぜます。アリコート2%メチルセルロース溶液を無菌50mL円錐管に入れます。2%メチルセルロースは、必要になるまで4°Cで保存することができる。
- PBSで5%パラホルムアルデヒド溶液を調作し、必要になるまで4°Cで保存します。PBSに0.05%のトリトンX-100を加えて1xフォーカス成形アッセイ洗浄バッファーを準備し、RTで保存し、PBSに1mg/mLサポニンを加えて1x FFA染色バッファーを調製し、必要になるまで4°Cで保存します。これらは1~2週間前に用意できます。
- 各器官が三つ三つ毛でめっきされるようなアッセイに必要なフラットボトム96ウェルプレートの数を計算します。正と負のコントロールに十分な追加のウェルを含めます。
- 成長培養中に十分なベロ細胞を育て、設計されたアッセイを完了します。ベロ細胞をトリプシン化し、成長培地中のmL当たり1.5 x 105細胞でそれらを再中断して数えます。3.0 x 104 Vero-WHO細胞/ウェルウェル当たり200μLを加えることによって成長培地中の96ウェルフラットボトムプレート中のプレートベロ細胞。
- 一晩5%CO2で37°Cでプレートをインキュベートし、細胞が井戸内で均等に分布するように、プレートがインキュベーター内の水平であることを確認してください。
注:各研究室は、わずかに異なるベロ細胞を成長させる;標的はジカウイルスのアッセイの日に各井戸で90〜95%のコンフルエント単層である。
- 希釈ジカウイルスは、アッセイの日をサンプルします。臓器サンプルが以前に均質化されていた場合は、-80°C冷凍庫からサンプルを取り出し、アッセイのためにサンプルを氷の上に置く前に解凍できるようにします。
- 氷上で、180μLの冷間成長培地を行Bに加えてH列Aを空にして丸い底96ウェルプレートを準備する。丸底板の行Aに各均質化臓器サンプルの150 μLを追加します。
- マルチチャンネルピペットを使用して、各サンプルのシリアル10倍の希釈を準備します。丸い底96ウェルプレートでサンプルを希釈し、20μLのサンプルを180μLの成長培地に加え、各希釈の間にピペットの先端を変化させます。
- ベロ細胞を覆う平底96ウェルプレートから培地を取り出してフォーカス成形板を準備する。単層が乾燥するのを防ぐために、ウイルスサンプルを追加する直前にこれを行います。
- ベロプレートの各井戸にウイルス希釈の100 μLを追加します。最も低い濃度から最高濃度に行くことによって、ヒントの同じセットを使用してサンプルを追加します。ロックプレートは左右に2〜4回旋回しないように注意してください。
- 37 °C でインキュベートし、5% CO2を 1-2 h. プレートがインキュベーター内の水平であることを確認します。インキュベーション中にRTに2%メチルセルロースをウォームアップ。
- 成長培養培養液中の2%メチルセルロース溶液を希釈する。希釈は、成長培地に対する2%メチルセルロースの約2:1の比率であるべきである。使用する時間になるまで、部屋の温度に保ちます。メチルセルロースの1-2滴/ウェル(ピペを125μLに設定)を追加します:成長培地を96ウェルプレートの各ウェルに追加します。
- 37 °C で 32-40 h をインキュベート, 5% CO2.誰もがベロ細胞がわずかに異なって成長し、ジカウイルスの細胞合流や株を含む要因がインキュベーション時間を変更することができます。
- 調製した5%パラホルムアルデヒド溶液を用いてベロ細胞を固定する。
- バイオセーフティキャビネット内のメチルセルロース層の上に、5%のパラホルムアルデヒドの50 μLを各ウェルに追加します。RTで60分間インキュベートします。固定は4 °Cで一晩行くことができますが、蒸発を減らすためにパラフィルムでプレートを覆うことができます。
- バイオセーフティキャビネット内の廃棄容器にセルをダンプし、培体をオフにします。PBS、150 μL/ウェルで穏やかに洗浄します。プレートからPBSを取り出し、BSL-2からプレートを取り外します。
- 150 μL/ウェルを追加するPBS洗浄2xを繰り返します。次に、PBS を削除します。150 μL/ウェル1x FFA洗浄バッファを追加し、固定細胞を透過するためにRTで5〜10分間座らせます。
- 一次ジカ抗体を用いて感染を検出する。一次抗体4G2(D1-4G2-4-15)をFFA染色バッファー中に1mg/mLの濃度で調製する。アッセイ全体に十分な抗体を準備します。
注:繊維が病巣のイメージングに悪影響を及ぼすので、ラボのおむつやその他の高糸くず吸収性物質から離れてください。- プレートからFFA洗浄バッファを取り外します。FFA染色バッファーに一次抗体の50 μL/ウェルを添加します。パラフィルムでプレートを密封し、ロッキングプラットフォーム上で4°Cで一晩インキュベートします。アッセイはRTで2時間のインキュベーションで行うことができる。
- 二次HRP共役抗体を添加して感染を可視化する。FFA染色バッファー中に1:5,000の濃度で二次ヤギ抗マウスHRP標識抗体を調製する。アッセイ全体に十分な抗体を準備します。
- FFA洗浄バッファーでセルを3x洗浄し、毎回シンクにフリックして洗浄バッファを除去します。50 μL/ウェルでFFA染色バッファーの二次抗体で細胞を染色します。RTで1-2時間をインキュベートします。
- FFA洗浄バッファーでセルを3x洗浄し、毎回シンクにフリックして洗浄バッファを除去します。真青基板の50 μL/ウェルを追加します。
- スポットが完全に定義され、最小限の背景になるまで2-15分待って、プレートを注意深く見てください。斑点が見えたら、手を使って水でやさしく洗い、水の力から単層を保護します。ペーパータオル(DIAPERSではない)と画像をできるだけ早くタップします。
- スポットは手動でカウントすることも、自動スポットカウンターを使用してカウントすることもできます。手動でカウントする場合は、解剖スコープを使用して視覚化に役立てることができます。
- 各サンプルについて、容易に区別された病巣(例えば、ウェル当たり20〜200)を用いて希釈を選択し、重複ウェルの平均を用いてmL当たりの焦点形成単位(FFU/ml)で力を計算する:FFU/mL=(平均病巣/ウェル)×(希釈因子)÷(mL接種)。
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Representative Results
上記のIfnar1-/-マウスを用いてZIKV力電力を評価し、フットパッドへの皮下(SC)注射を介してZIKV(PRVABC59)に感染した。ここで、ZIKVの1 x 105 FFUを8〜12週齢のIfnar1-/-マウスSCに投与しても致死的ではないが、ウイルスは周辺およびCNSの両方で複製することができる。この用量および経路は、宿主病原体免疫応答および病原性を研究するために使用される。8-12週齢のIfnar1-/-マウス静脈内注射(IV)注射に対するZIKVの1 x 105 FFUの投与は80〜100%致死的であり、動物はウイルス注射後8〜14日の間に感染に屈する。この投与経路を日常的に使用して、抗ウイルス薬や治療薬の有効性、ならびに前臨床ワクチン候補試験の有効性を判断します。
10-12週齢のIfnar1-/-マウス4匹をZIKV SCの1 x 105 FFUに感染させ、脾臓、肝臓、腎臓、脊髄および脳を4日後に採取した(図1)。組織中のZIKVの量は、上述したように96ウェルフォーマットでベロ細胞を用いたフォーカス形成アッセイ(FFA)によってアッセイした。FFAを用いて、組織ウイルス負荷は、組織のg当たりの焦点形成単位(FFU)として発現される。Ifnar1-/- 26のZIKV感染の以前の研究で観察されたものと同様に、我々はZIKV感染後4日後に異なる器官のウイルス力学者のサンプリングに続くウイルス血症を見た。これらの結果は、焦点形成アッセイによる臓器収穫およびちらつきに使用される方法が、同じ動物内の末梢器官およびCNSの両方のツタを検出するために使用できることを示している。興味深いことに、我々は、Ifnar1 -/-マウスの4日後の感染後、周辺およびCNSの両方で高いウイルス性チターを見ることを期待していなかった。 我々は、ZIKVが致死性を引き起こすことなく、Ifnar1-/-のCNSでどのように複製し続けることができるかを理解するために、この観察を探求し続けています。
フォーカスフォーミングアッセイ(FFA)を行う場合、研究者が行うことができる複数の技術的な間違いがあり、その結果、最適でないFFA結果が生じます。最も一般的な間違いは:1)臓器毒性。2)活発なピペッティング;3)繊維汚染;4)正しくない細胞めっき密度。これらの各問題について以下で説明し、図 2の結果を示します。FFAおよびプラークアッセイの両方で発生するより一般的な問題の1つは、臓器毒性です(図2A赤い矢印)。臓器毒性は、臓器均質化中に放出される高濃度の細胞内成分によって引き起こされたと考えています。臓器毒性は器官によって異なり、感染していない動物から採取された器官で見られ、肝臓は最も毒性が高く、脾臓は最も少ない。器官がFFAプレート上で連続的に希釈されると、毒性が減少します。しかし、毒性はアッセイの感度を変化させ、検出の限界に変化をもたらす。図2Aに示すように、臓器内のウイルス系のツタが毒性よりも低い場合、FFAはウイルス系の系タンターを正確に記録することができない。図2Bは、ウェルa1〜4における毒性を示すが、ウイルス系の二乗は、ウェルb3およびb4に見られるように器官毒性を克服するのに十分に高い。FFAのこの限界を克服するために、我々はまた、臓器価水価サンプルに定量的なリアルタイムPCRを実行します。図 2Cでは、いくつかの一般的な技術的エラーを示します。活発なピペッティングまたは洗浄は、単層(図2C、*)を除去することができ、これが病巣のある井戸で発生した場合、データが失われ、力付け結果の不正確な報告につながります。ラボベンチに存在する繊維または毛毛は、個々のウェルを汚染する可能性があります(図2C、$)これは、自動計数プログラムを使用する場合に重大なエラーを引き起こす可能性があります。ほとんどの自動計数プログラムには繊維除外オプションがありますが、分析から繊維を除外する上で非常に効果的であることがわかったわけではありません。これに対する解決策は、非常に時間がかかり、大規模なアッセイの分析には実用的ではないウェルを手動でカウントすることです。細胞密度は、フォーカス形成アッセイの成功に劇的に影響を与えることができるもう一つの問題です(図2D)。アッセイの開始時にセルが適切な密度でない場合、スポットの数とサイズが影響を受けます。図2Dに示すように、列1-3は、90%の合流列4-6でめっきされた細胞と比較してアッセイの開始時に約60%の合流性を持つ細胞が、焦点形成アッセイに劇的に影響を与える。この障害を克服するためには、個々の実験室の条件がアッセイの成功に影響を与えるため、細胞密度と固定時間を最適化するために、小さなパイロットアッセイを実行する必要があります。
感染した動物の異なるグループを比較する研究では、実行される統計分析はデータの分布に依存します。パラメトリック検定またはノンパラメトリック検定は、統計的有意性を評価するために使用されます。パラメトリックテストでは、ANOVAを使用して全体的な効果を検出し、個々の治療グループをダンのテストを使用して比較します。データの分布がパラメトリック解析の要件を満たさない場合は、ノンパラメトリック検定が採用されます。Kruskal-Wallisテストは、全体的な治療効果を検出するために使用され、マンホイットニーUテストは、ペアワイズ比較を実行するために使用されます。ここに存在する結果については、この時点で収集された2番目のデータセットと動物を比較しなかったので、示されたデータセットに対して統計分析を行わなかった。
図1:周辺およびCNSにおけるウイルス複製。IFNAR1-/-マウス後の末梢およびCNS組織におけるウイルス負荷は、ZIKV SCの1x105 FFUを与えられる。4日目(n=4群)感染後の臓器を採取し、凍結し、計量し、均質化した。ウイルスのレベルは、焦点形成アッセイによって定量化された。検出の限界は器官に基づいて100-500 FFU/グラムである。データは、組織のグラム当たりLog10フォーカス形成単位として示される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:フォーカス形成アッセイに関する一般的な難しさ。ウイルス抗原を示した全ての焦点形成アッセイについて、抗フラビウイルスMAbで検出し、続いて免疫ペルオキシダーゼ染色(紫)を行った。(A)ベロ細胞を90%合流に増殖させ、8週齢のC57BL/6マウスから採取した肝臓から上清の10倍の連続希釈に感染し、IVは4日前にZIKVの5 x 107 FFUに感染した。赤い矢印は、この濃度で毒性を示す肝上清の最高または「きちんとした」濃度を示す。(B)ベロ細胞を90%合流に増殖させ、ZIKV感染腎臓細胞から上清の10倍希釈に感染させた。この場合、列 1 および 2 のサンプルは C57BL/6 マウスからのサンプルであり、col 3 および 4 は Ifnar1-/-からのものです。両方のマウスは、ZIKV IVの1 x 105 FFUに感染した8週齢であり、感染後4日間を犠牲にした。(A)と同様に、最高濃度(行a)で見られるいくつかの毒性があるが、列3および4で観察されたウイルス力は、正確な力料を検出することを可能にする検出の問題の限界を克服する。(C)ベロ細胞をめっきした。選択したウェルは、一般的な技術的エラーを示します。*は、活発なピペッティングのために単層が除去された領域を示す。$ は繊維が見える井戸の上に置かれる。(D)ベロ細胞濃度はアッセイの感度に影響を与える。このプレートでは、ベロ細胞をカラム1-3および3.0 x 104 Vero-WHO細胞/4-6で1.0 x 104細胞/ウェルでめっきした。その後、プレートはZIKV PRVABC59ストックの10倍希釈に感染した。最も高いウイルス濃度サンプルは行Aで希釈され、各行は10倍の希釈を表す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ZIKV感染は神経疾患を引き起こす可能性があるため、現在の動物モデルは、ワクチンおよび抗ウイルス剤の病因、免疫応答および保護有効性を研究するために、CNS内のウイルス制御に焦点を当てる必要がある。CNS疾患に焦点を当てる上での課題の一つは、多くの場合、末梢感染症の研究を犠牲にして来るということです。ここで提案される臓器分離方法は、CNS媒介性ZIKV関連疾患を評価し、抗ウイルス薬、治療および前臨床試験のためのモデルを確立するために、周辺およびCNSの両方でZIKV感染を迅速に評価する必要性に焦点を当てています。ワクチン。この技術の付加的な利点はまた、ZIKVに対する免疫学的応答の組み合わせ研究や感染の組織学的分析を含む、高い柔軟性を可能にすることです。この技術は、ZIKVだけに限定されるものではなく、デングウイルス21などのフラビウイルス、サルポックスおよびエトロメリアのようなオルソポックスウイルスを含む宿主病原体相互作用の範囲を研究するために普遍的に適用することができる。この収穫技術の考慮事項と欠点は、主に実験者の能力に焦点を当てる。ZIKVは室温で長期間安定していないため、灌流後の臓器の収穫にかかる時間は、結果の品質に大きな影響を与える可能性があります。これまでに行ったほとんどの実験では、2つの条件で処理したマウスのウイルス力を比較し、速度ではなく臓器収穫の時間の一貫性に焦点を当てています。このようにして、同じ人物が一貫性を維持するために実験全体に対して同じ手順を実行します。この手順のもう一つの主要な考慮事項は安全性であり、我々は容易にBSL-2(ZIKV、デングウイルス)およびBSL-3(WNV、チクングニアウイルス)病原体でこれらの方法を行っている。消毒剤が付いているきれいな、よく維持され、証明されたバイオセーフティキャビネットのすべてのプロシージャを行うことが非常に重要である。
FFAはプラークアッセイを平行にするが、ペルオキシダーゼ免疫染色を使用して、プラークではなく感染細胞の病巣を同定する点を除く。私の研究室だけでなく、複数の他の研究室は、現在、すべての私たちのちらつき実験11、14、15、17、26、27のためのFFAの使用に正常に切り替えました 、28.FFAは、従来のプラークアッセイに比べて複数の利点を有する:a)FFAはより速く、プラークアッセイに比べてより短いインキュベーションを必要とし、b)それはまた、より高いスループットであり、96ウェルプレートで行われている。96ウェルプレートフォーマットは、出発材料の小さなボリュームにも対応できます。さらに、c)FFAは、自動プレートワッシャーと自動スポットカウンターの使用と互換性があり、アッセイに必要な労力と時間を大幅に削減します。FFAは、感染後のより多くのステップを有するが、d)マルチチャンネルピペ、あるいはピペッティングロボットを使用して、固定後のアッセイステップの大部分のタイミングは柔軟であり、アッセイは一晩または長く一時停止することができる。最後に、e)デングウイルスのような明確なプラークを形成しないウイルス株に特に有用である可能性がある。FFAの欠点の1つは、ウイルス感染細胞を検出するために特定の抗体を必要とし、多様なウイルス株または変異型ウイルスを検討する際に混乱する可能性があることです。プラークアッセイと同様にFFAにとって、感染時の細胞単層の密度はアッセイの成功のために重要である。細胞は、固定前の時間の短縮により、プラークアッセイと比較してFFAの合流点が高く使用されるべきである。FFAはスループットが高く、従来のプラークアッセイよりも費用対効果が高く、より速く、私の研究室は新たな感染症を研究するためのデータを迅速に分析することができます。FFA は、いくつかの理由により、より累積的に費用対効果が高くなります。抗体は中性赤色や結晶バイオレットよりも高価ですが、プレートあたりのサンプル数を増やしてコスト差を解消することができます。人件費配分の自動化されたスポットカウントと分析のための簡単なデータ入力の面では、人件費を制限し、記録として長期的なイメージを持つ能力を定量化することは困難です。このアッセイの将来は、HRPとは対照的に、読み出しのために蛍光ベースの病巣に移動することである可能性があります。スポット数と共に蛍光強度を定量することは、現在研究されているものを超えてFFAの有用性を拡張します。
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Disclosures
著者は開示するものが何もない
Acknowledgments
ピント博士は、セントルイス大学医学部のシード助成金とセントルイス大学医学部のスタートアップ資金から資金を提供しています。ブライアン博士は、NIH NIAIDからK22AI104794早期調査者賞とセントルイス大学学校からの種子助成金によって資金提供されています。資金提供を受けたすべての個人に対して、資金提供者は、研究の設計、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に役割を持ちなかった。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18 G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1 cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37 °C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96 well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5 mL eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| Curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose With 4,500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5 mL EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| O-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| One step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| Spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| Straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
References
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