Summary
프로토콜의 목표는 감염 다음 마우스에 있는 다중 기관에서 Zika 바이러스를 격리하고 정량화하여 바이러스성 질병을 조사하기 위하여 이용된 기술을 설명하는 것입니다.
Abstract
제시되는 방법은 Zika 바이러스 감염 동물에서 기관의 격리 및 바이러스 부하의 정량화를 위한 실험실 절차를 보여줍니다. 절차의 목적은 Zika 바이러스 감염을 통제하는 선인장 및 면역학 요인을 확인하기 위하여 감염 후 또는 다른 시험 조건 의 밑에 다른 시점 에서 마우스의 말초 및 CNS 지역에 있는 바이러스 성 역가를 정량화하는 것입니다. 입증된 기관 격리 절차는 바이러스 성 적기의 초점 형성 분석 정량화 및 정량적 PCR 평가를 모두 허용합니다. 급속한 기관 격리 기술은 바이러스 적기의 보존을 위해 디자인됩니다. 포커스 형성 분석에 의한 바이러스 성 적정정화는 Zika 바이러스의 신속한 처리량 평가를 허용합니다. 초점 형성 분석법의 이점은 전염성 바이러스의 평가이며, 이 분석법의 한계는 검출의 한계를 감소시키는 장기 독성에 대한 잠재력이다. 바이러스 적대자 평가는 정량적 PCR과 결합되고, 재조합 RNA 카피 대조군 바이러스 게놈 카피 번호를 사용하여 기관 내의 검출한계가 낮아 평가된다. 전반적으로 이러한 기술은 Zika 바이러스 감염 동물의 주변 및 CNS에서 Zika 바이러스 적시의 분석을 위한 정확한 빠른 높은 처리량 방법을 제공하고 대부분의 감염된 동물의 장기에서 바이러스 적기의 평가에 적용될 수 있습니다. 뎅기열 바이러스를 포함한 병원체.
Introduction
지카바이러스(ZIKV)는 플라비리대 패밀리에 속하는 아보바이러스로, 포와산 바이러스(POWV), 일본 뇌염 바이러스(JEV), 웨스트 나일 바이러스(WNV) 1과 같은 중요한신경침형 인간 병원체를 포함한다. 그것의 고립 및 확인에 따라, 아프리카와 아시아에 있는 인간 ZIKV 감염의 정기적인 보고가 있었다 2, 3,4,5,및 중남미 내의 전염병 (검토에서 참조6). 그러나, ZIKV가 심각한 질병을 일으키는 것으로 생각되었다 최근까지아니었다7. 지금 ZIKV 감염에 연결된 신경질병 및 출생 결함의 케이스의 수천이 있습니다. ZIKV의 급속한 출현은 관련있는 많은 질문을 자극했습니다: 왜 질병 엄격에 있는 증가가, ZIKV 감염에 면역학적인 반응은 무엇이고 신경학상에 있는 증가에 연결되는 바이러스성 및/또는 면역 중재한 병리학이 있습니다 증상 및 출생 결함. 이제 ZIKV와 관련된 중추 신경계 (CNS) 관련 질병뿐만 아니라 ZIKV에 대한 항 바이러스 및 백신의 효능을 신속하게 테스트 할 필요성을 이해하기 위해 서두르고 있습니다. 이러한 배경에서 우리는 ZIKV 특이적 초점 성형 분석법(FFA)을 사용하여 주변및 CNS 모두에서 ZIKV 적규자를 신속하게 분석하는 방법을 개발했습니다.
작은 동물 모형은 질병 진행을 이해하고 백신, 치료및 항바이러스제의 초기 평가를 위해 중요합니다. 우리는 바이러스 성 병원체에 대한 인간의 감염과 보호를 모델링하기 위해 다양한 마우스 균주를 사용하여arbovirus 질병의 연구를위한 작은 동물 모델을 설립했다 8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. 이러한 사전 경험을 사용하여, 우리는 WNV 및 뎅기열 바이러스, 두 말초 기관뿐만 아니라 CNS21,23에서 ZIKV 이터의 평가를위한 관련 플라비 바이러스의 평가에 사용되는 기술을 수정하기시작했다. 24. 다른 분석에 비해 이러한 방법의 장점은 다음과 같습니다 : 1) 분석을 위해 말초 및 CNS 장기를 모두 수확하는 능력을 결합하는 것; 2) 방법은 같은 기관에서 동일한 동물에 바이러스 역가와 함께, 선천적 및 적응 면역 반응의 측정을위한 유세포 분석에 적응; 3) 수확 기술은 조직학적 분석에 적응할 수 있다; 4) ZIKV FFA는 바이러스 성가자 분석을위한 빠른 높은 처리량 방법입니다; 및 5) 이들 방법은 대부분의 병원체에 감염된 동물의 장기에서 바이러스 성 적수의평가에 적용될 수 있다(25).
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Protocol
본 연구의 모든 절차는 세인트 루이스 대학 동물 관리 및 사용 위원회가 정한 지침에 따라 처리됩니다. SLU는 실험실 동물 관리 국제 (AAALAC)의 평가 및 인증 협회에 의해 완전히 인증됩니다.
1. 장기 격리
참고: 바이러스는 실온 (RT)에서 안정되지 않으므로 한 번에 수확 된 동물의 수는 바이러스 성가를 보존하기 위해 신중하게 계획해야합니다.
- 필요한 표현형에 기초하여 선택한 투여량 및 경로를 사용하여 마우스를 감염시다. 이 프로토콜의 경우, 8-10주 령 의 남성 및 여성 형 I 인터페론 수용체 결핍(Ifnar1-/-) C57BL/6 마우스를 감염시켰다.
- 케타민 (90 mg /kg)과 자일라진 (10 mg / kg)의 칵테일로 Ifnar1-/- 마우스를 마취하십시오. 단단한 발가락 핀치에 의하여 시험 페달 반사는 마취를 확인하기 위하여. 풋패드를 통해 50 μL 피하(SC)에서 ZIKV의 1 x 105 초점 성형 유닛(FFU)을 투여합니다.
- 전날 수확에 필요한 모든 재료를 준비하십시오 : 도구 소독을위해 50 mL원추형에 가위, 집게 및 70 % 에탄올 (EtOH)의 20 mL.
- 주사기와 바늘을 준비하십시오 : 관류를위한 20 mL 주사기, 23 G 바늘 (케이지 당 약 1) 및 25 G 바늘 (3-5 마우스 당 1)으로 1 mL 주사기. 튜브를 계량하기 전에 강철 비드(후드)를 1.5mL O-링 스크류 캡 튜브(각 오르간마다 하나씩)에 추가합니다. 튜브는 균질화에 적합해야합니다.
- 수확의 날을 준비관과 장기 동결에 필요한 재료.
- 아이스 버킷에 드라이 아이스와 70% EtOH를 채우고 얼음 목욕을 합니다. 멸균 인산염 완충식염수(PBS)를 준비하여 각 관류에 대해 PBS의 마우스당 25-30 mL이 척수에 대해 5-10 mL가 필요하다고 가정합니다. 케타민과 자일라진의 칵테일인 마취를 얻고 마우스 당 300 μL을 가정합니다. 유세포분석 등에 필요한 모든 재료와 추가 튜브를 보조 용기에 넣고 동물 시설로 운반합니다.
- 동물 시설에 입국 및 출입하는 동안 개인 보호 장비를 착용하고 벗는 것을 포함하여 필요한 모든 절차를 따르십시오.
주의 사항: 모든 절차는 생물 안전 수준 2 실험실 (BSL-2) 시설 내에서 인증 된 생물 안전 캐비닛에서 수행되어야합니다. - 마취를 투여, 200-500 μL, 동물의 크기와 무게에 따라 복강 내. 혼자 일하는 경우, 장기 수확 전에 동물을 죽이는 것을 피하기 위해 한 번에 한 마리의 동물에게 마취를 투여하십시오.
- 페달 반사를 평가하기 위해 집게로 발가락을 꼬집어 마취 용량을 확인하십시오. 완전히 응답하지 않는 한 계속하지 마십시오. 핀을 사용하여 마우스를 왁스 보드에 고정합니다. 이 시점에서, 장기 수확 절차에서 머리 오염을 피하기 위해 70% 에탄올에 마우스를 사용
- 심장 천자에 의해 말단 출혈.
- 가위와 집게를 사용하여 가슴 구멍을 통해 동물을 열어 심장을 노출시다. 심장 천자(~800 μL)를 통해 혈액을 수집하면 항원 특이적 반응을 검출하기 위한 임상 화학, 혈액학, 유세포 분석, 바이러스 카피 수 분석을 위한 실시간 정량적 PCR(qRT-PCR)을 포함한 다중 분석에 사용할 수 있습니다.
- qRT-PCR에 의한 바이러스 RNA 분석을 위해, 혈청에서 추출하는 경우에 전혈 또는 마이크로 원심 분리관에서 추출하는 경우에 EDTA 관에서 혈액을 수집합니다. (세럼의 경우, 원심분리기, 실내 온도에서 최대 속도로 튜브를 스핀하고 20 분 동안 별도의 튜브에 세럼을 제거하십시오). 마무리 후 혈청 샘플에 캐리어로 선형 폴리아크릴아미드를 추가합니다. RNA는 나중에 추가 처리하기 위해 -80 °C에서 분석되거나 저장될 수 있습니다.
- 20 mL 주사기를 PBS로 채우고, 실온(또는 37°C)에서, 좌심실에 나비 바늘을 삽입하여 마우스를 침전시한다. 혈액과 PBS가 빠져 나갈 수 있도록 오른쪽 심방을 뚫습니다. 동물이 완전히 관전되어 있는지 확인하기 위해 간 색을 확인하면서 PBS를 천천히 투여하십시오. 간은 진한 빨강에서 분홍색 연어 색깔로 바뀝니다.
- 역학을 위해 장기를 준비하는 경우 나비 바늘을 제자리에 두고 20 mL의 얼음 차가운 4 % 파라 포름 알데히드를 주입하십시오. 그렇다면 주사기를 3방향 스톱콕에 연결하여 두 주사기를 부착하여 PBS와 PFA 를 번갈아 가며 밸브 를 켜고 OFF하는 것이 편리합니다.
- 표지된 계량 튜브로 장기를 수확합니다. 말초 장기의 경우, 수확을 위해 확립 된 순서를 따르십시오 : 간, 비장, 신장 및 폐.
- 간에서 하나의 엽을 가져 가라; 어느 것이 든 중요하지 않지만 모든 실험에서 항상 동일한 크기의 조각으로 동일한 로브를 가져 가려고합니다. 마찬가지로 신장과 폐의 경우 동일한 신장과 폐를 복용하십시오. 유세포분석이 완료될 경우, 모든 장기를 반으로 절단할 수 있습니다. 수확이 완료 될 때까지 실온에서 로스웰 공원 기념 연구소 매체 (RPMI)에서 세포 측정에 사용되는 절반을 저장합니다.
- 수확 직후, 각 장기를 라벨이 붙은 튜브에 넣고 드라이 아이스 욕조에 넣습니다. 바이러스 적재기는 실온에서 시간이 지남에 따라 감소하므로 장기를 수확하는 데 걸리는 시간이 매우 중요합니다. 마우스 사이에 일관성이 있어야하므로 안전 후 다음 우선 순위는 속도입니다.
참고: 바이러스 성가자에 대 한 장기를 수확 하는 경우, 그것은 두 번째 개별 이 시점에서 뇌를 수확 하는 것이 매우 도움이 됩니다., 바이러스 성 기를 보존 하기 위해.
- 마우스 몸 구멍에서 남은 장기를 제거하여 척추와 두개골에 액세스하십시오.
- 보드에서 마우스를 제거하고 팔과 다리를 제거 한 다음 펠트를 제거합니다.
참수, 무딘 또는 수술 가위로 마우스의 머리를 제거하여 톱니 모양의 LaGrange 가위로 두개골을 절단하여 뇌를 수확하십시오. 그런 다음 집게로 두개골을 벗기고 주걱으로 뇌를 떠냅니다. - 강하고 무딘 가위를 사용하여 갈비뼈와 척추를 둘러싼 다른 뼈를 제거하십시오. 그런 다음 골반 뼈를 가로 질러 자르고 요추 수준에서 척추 포라멘을 노출시하십시오. 척수의 작은 끝은이 시점에서 볼 수 있어야합니다.
- PBS로 채워진 10 mL 주사기와 18 G 바늘을 사용하여 페트리 접시 위에 요추에서 자궁 경부 척추까지 코드를 "플러시"하여 척수를 추방하십시오.
- 조심스럽게, 척추 포어맨 내부에 바늘의 경마 끝을 배치, 척추 몸을 침입하는 바늘을 방지하기 위해 과도한 압력을 피. 척추 몸과 바늘에 압력을 가하고 주사기 플런저를 눌러 코드를 추방하십시오. 즉시 라벨이 부착 된 튜브에 척수를 옮기고 드라이 아이스 욕조에 놓습니다.
- 보드에서 마우스를 제거하고 팔과 다리를 제거 한 다음 펠트를 제거합니다.
- 수확이 완료 될 때까지 모든 동물과 절차를 반복합니다. 수확 도구를 동물 사이에 70% 에탄올에 놓습니다. 일관성과 속도에 초점을 맞춥니다. 각 장기 수확 사이의 시간의 길이는 바이러스 성가 대 결과 편향 하지 않도록 일관 된 유지 해야 합니다.
- 작업이 끝나면 동물 시설에서 제거하기 전에 생체 안전 캐비닛과 모든 재료를 소독하십시오.
- 얼음 욕조에서 각 튜브를 제거하고 튜브를 계량하여 장기 의 무게를 결정합니다. 장기 의 무게를 결정하려면 튜브를 포함하는 기관의 무게에서 빈 튜브의 무게를 뺍니다.
참고: 이 시점에서 장기는 -80 °C에서 동결되어 나중에 추가 로 처리하거나 기관은 개별 aliquots를 동결하기 직전에 균질화 될 수 있습니다. 동결 해동 샘플 여러 번 바이러스 성기를 감소. 따라서 단일 프로젝트 내의 모든 실험에 대해 동일한 절차를 수행하는 것이 중요합니다.
2. 기관 균질화
- 각 장기가 균질화될 수 있도록 3개의 라벨이 부착된 1.5 mL 스냅 캡 튜브를 준비합니다.
- 시료가 수확 직후 균질화되지 않으면 -80°C에서 튜브를 제거합니다. 샘플은 균질화하기 위해 해동될 필요가 없습니다.
- 바이러스 성가자 손실을 최소화하기 위해 얼음에 샘플을 넣어 차가운 유지합니다. 그런 다음 튜브를 함유한 각 장기에 5% FBS를 함유한 차가운 DMEM 1 mL을 추가합니다.
- 즉시 제조업체의 지침에 따라 비드 비터에 튜브를 이길. 비드 균질화 기기에 강철 구슬로 모든 장기를 균질화하십시오. 각 장기가 완전히 균질화되었는지 확인하십시오.
- 8°C로 냉각된 마이크로퍼지에서 5분 동안 12,000 x g에서 마이크로퍼지의 장기 파편을 스핀다운합니다. 그런 다음 튜브를 얼음 양동이로 되돌려 보냅니다. 생물 안전 성 캐비닛에서 필요한 검정을 위해 튜브로 시료를 aliquot. 그런 다음 튜브를 얼음 양동이로 되돌려 보냅니다.
- 포커스 형성 분석의 경우, aliquot 500 μL을 표지된 튜브로 넣습니다. 그런 다음 얼음 양동이에 랙에 튜브를 놓습니다. Aliquot 50 μL은 바이러스 게놈 카피 수를 측정하기 위해 형광 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)을 위한 RNA용 튜브내로.
- 상용 RNA 격리 키트를 사용하여 감염된 동물의 장기로부터 총 RNA를 분리합니다. 각 플라비바이러스 게놈에서 독특한 서열을 인식하는 ZIKV에 특이적인 프라이머 프로브 세트를 사용하여 플라비바이러스 바이러스 RNA를 결정합니다. ZIKV 표적 서열을 함유하는 T7 폴리머라제를 사용하여 시험관 내에서 생성된 정의된 양성 단일 가닥 RNA를 포함하는 카피 제어 플라스미드를 사용하여 바이러스 카피 번호를 결정한다.
- 나머지 시료를 약 300 μL인 Aliquot를 세 번째 튜브에 넣고 필요한 경우 -80°C에 보관합니다.
참고: 시료가 이전에 동결되지 않은 경우 -80°C에서 동결합니다. 견본이 이전에 동결된 경우에, 정지하기 전에초점 형성 분석 및/또는 RNA 격리에 계속하십시오.
3. 지카 바이러스 포커스 형성 분석26
참고: 바이러스 제어 및 긍정적 인 제어를 포함하는 것이 중요합니다. 양성 대조군은 공지된 농도를 가진 바이러스 스톡의 희석 시리즈이다. 모든 컨트롤이 동일한 플레이트에 있어야 하는 것은 아니지만 분석이 5플레이트보다 커지면 더 많은 컨트롤을 추가하고 플레이트 사이에 분산시켜야 합니다. 파이펫 팁이나 격렬한 세척으로 단층이 긁히지 않도록 주의하십시오. 여러 장기는 같은 날 또는 다른 날에 터질 수 있습니다. 그러나 개별 기관은 다른 분석 조건이 바이러스성 적당에 영향을 미칠 수 있기 때문에 여러 날에 걸쳐 성수기해서는 안됩니다. 하루에 개별 장기를 실행하는 것이 좋습니다.
- 분석의 날 전에, 초점 형성 분석에 필요한 세포 및 시약을 준비한다.
- 5mL의 HEPES와 25 mL의 FBS로 500 mL의 DMEM을 포함하는 성장 매체를 준비합니다. 베로-세계보건기구(WHO) 세포가 분석이 시작되기 전에 37°C, 5% CO2에서 성장하였다. Vero 세포는 분석의 개시 의 앞에 높은 통로 또는 100% confluency 이상 이제까지 성장해서는 안됩니다.
- 메틸셀룰로오스 10g과 대형 교반바, 500 mL의 H2 O를 가진 별도의 1L 유리 매체 병을 오토클레이브하여 2% 메틸셀룰로오스용액의 500 mL을 준비한다. 오토클레이브 워터가 식은 경우 병이 뜨거워질 때까지 전자레인지에서 다시 가열하지만 끓지 않습니다.
- 티슈 배양 후드에 있는 동안 따뜻한/뜨거운 물을 메틸셀룰로오스 병에 부드럽게 붓습니다. 메틸셀룰로오스가 용액(1-4시간)이 될 때까지 병을 부분적으로 뚜껑을 씌우고 핫플레이트에 저어줍니다. 2% 메틸셀룰로오스 용액을 멸균 50 mL 원추형 튜브에 Aliquot. 2% 메틸셀룰로오스는 필요할 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.
- 플레이트를 고정하기 위해 PBS에서 5% 파라포름알데히드 용액을 준비하고 필요할 때까지 4°C에서 보관하였다. PBS에 0.05% 트리톤 X-100을 첨가하여 1x 포커스 형성 분석 세척 버퍼를 준비하고 RT에 보관합니다. 이들은 1- 2 주 전에 준비할 수 있습니다.
- 각 기관이 삼중으로 도금되도록 분석에 필요한 평평한 바닥 96 웰 플레이트의 수를 계산합니다. 긍정적 및 부정적 대조를 위해 충분한 추가 웰을 포함합니다.
- 성장 매체에서 충분한 베로 세포를 성장시키고 설계된 분석기를 완성한다. Vero 세포를 트립시니화하고 성장 매체에 있는 mL 당 1.5 x 105 세포에서 그(것)들을 다시 중단하는 것을 계수합니다. 플레이트 베로 세포는 3.0 x 104 Vero-WHO 세포에서 96개의 잘 평평한 바닥 판에서 웰당 200 μL을 첨가하여 성장 매체에서 잘 한다.
- 5% CO2에서 37°C에서 하룻밤 동안 플레이트를 인큐베이터에 인큐베이팅하고, 세포가 우물 내에 균등하게 분포되도록 플레이트가 인큐베이터에 수평이 되도록 하십시오.
참고: 각 실험실 은 베로 세포를 약간 다르게 성장; 표적은 지카 바이러스에 대한 분석의 날에 각각의 웰에서 90-95% 동시 단층이다.
- 희석 Zika 바이러스는 분석의 날을 샘플링합니다. 장기 샘플이 이전에 균질화되었다면, -80°C 냉동고에서 샘플을 제거하고 분석용 얼음에 샘플을 놓기 전에 해동되도록 하십시오.
- 얼음위에서, H를 통해 B행에 180 μL의 냉성장 매체를 추가하여 둥근 바닥 96웰 플레이트를 준비하여 A행을 비워둔다. 둥근 바닥 판의 행 A에 각 균질화된 기관 샘플의 150 μL을 추가합니다.
- 다중 채널 파이펫을 사용하여 각 샘플의 직렬 10배 희석을 준비합니다. 180 μL의 성장 매체에 20 μL의 샘플을 추가하여 둥근 바닥 96 웰 플레이트에서 샘플을 희석하고 각 희석 사이에 파이펫 팁을 변경합니다.
- Vero 세포를 덮는 평평한 바닥(96)웰 플레이트로부터 매폐를 제거하여 포커스 형성 플레이트를 준비한다. 단일층이 건조하지 않도록 바이러스 샘플을 추가하기 전에 즉시 이 작업을 수행하십시오.
- Vero 플레이트의 각 우물에 100 μL의 바이러스 희석을 첨가합니다. 가장 낮은 농도에서 가장 높은 농도로 이동하여 팁의 동일한 세트를 사용하여 샘플을 추가합니다. 바위 판은 좌우로 2~4회 소용돌이하지 않도록 주의합니다.
- 37 °C에서 배양, 1-2 시간 동안 5 % CO2. 플레이트가 인큐베이터 내에 있는지 확인하십시오. 인큐베이션 동안 RT로 2% 메틸셀룰로오스를 예열한다.
- 성장 매체에 2 % 메틸 셀룰로오스 용액을 희석. 희석은 성장 매체에 2% 메틸셀룰로오스의 약 2:1의 비율로 되어야 한다. 사용할 시간이 될 때까지 실내 온도에서 유지하십시오. 메틸셀룰로오스의 1-2 방울/웰(파이펫을 125 μL로 설정)을 추가합니다: 96웰 플레이트의 각 웰에 성장 매체를 추가합니다.
- 37 °C에서 32-40 h, 5% CO2에서 배양하십시오. 모든 사람의 Vero 세포가 약간 다르게 증가하고 Zika 바이러스의 세포 결합 및 긴장을 포함하여 요인이 인큐베이션 시간을 바꿀 수 있기 때문에.
- 제조된 5% 파라포름알데히드 용액을 사용하여 베로 세포를 고정한다.
- 5% 파라포름알데히드의 50 μL을 생체 안전성 캐비닛의 메틸셀룰로오스 층 상단에 잘 추가합니다. RT에서 60 분 동안 인큐베이션하십시오. 고정은 4 °C에서 하룻밤 갈 수 있지만 증발을 줄이기 위해 파라 필름으로 플레이트를 덮을 수 있습니다.
- 오버레이를 덤프하고 세포를 바이오 안전 성 캐비닛 내부의 폐기 용기에 넣습니다. PBS, 150 μL/well으로 부드럽게 씻으십시오. 플레이트에서 PBS를 제거하고 BSL-2에서 플레이트를 제거합니다.
- PBS 워시를 2x 반복하여 150 μL/well을 추가합니다. 그런 다음 PBS를 제거합니다. 150 μL/well 1x FFA 세척 버퍼를 추가하고 RT에서 5-10분 동안 앉아서 고정 된 세포를 투과시하십시오.
- 1 차적인 Zika 항체를 사용하여 감염을 검출합니다. 1차 항체 4G2(D1-4G2-4-15)를 FFA 염색 완충액에서 1 mg/mL의 농도로 준비한다. 전체 분석에 대한 충분한 항체를 준비하십시오.
참고: 섬유가 초점의 화상 진찰에 부정적인 영향을 미치기 때문에 실험실 기저귀 또는 그밖 높은 보풀 흡수물 물자에서 멀리 하십시오.- 플레이트에서 FFA 세척 버퍼를 제거합니다. FFA 염색 완충액에 1차 항체의 50 μL/well을 추가합니다. 파라필름으로 플레이트를 밀봉하고 흔들 플랫폼에서 4°C에서 밤새 배양합니다. 분석은 RT에서 2 시간 동안 인큐베이션으로 수행 할 수 있습니다.
- 이차 HRP 공액 항체의 첨가에 의해 감염을 가시화. FFA 염색 완충액에서 1:5,000의 농도로 이차 염소 항마우스 HRP 표지 항체를 준비한다. 전체 분석에 대한 충분한 항체를 준비하십시오.
- FFA 세척 버퍼로 셀을 3x 세척하고 매번 싱크대에 가볍게 하여 세척 버퍼를 제거합니다. FFA 염색 버퍼에서 이차 항체로 세포를 50 μL /well에서 염색합니다. RT에서 1-2 시간 인큐베이션.
- FFA 세척 버퍼로 셀을 3x 세척하고 매번 싱크대에 가볍게 하여 세척 버퍼를 제거합니다. 트루블루 기판의 50 μL/웰을 추가합니다.
- 스팟이 완전히 정의되고 최소한의 배경이 될 때까지 2-15 분 동안 조심스럽게 접시를 보십시오. 반점이 보이면 손으로 물로 부드럽게 씻어 내고, 단층의 물 흐르는 힘을 보호하십시오. 종이 타월(기저귀 아님)과 이미지를 가능한 한 빨리 두드려 두드려 주세요.
- 스팟은 수동으로 계산하거나 자동 스팟 카운터를 사용하여 계산할 수 있습니다. 수동으로 계산하는 경우 시각화를 지원하기 위해 해부 범위를 사용할 수 있습니다.
- 각 샘플에 대해 쉽게 구별되는 초점(예: 웰당 20~200개)으로 희석을 선택하고 중복 웰의 평균을 사용하여 mL당 초점 형성 단위(FFU/ml)에서 적시를 계산합니다: FFU/mL = (평균 초점/웰) × (희석 인자) ∞ (mL 접종).
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Representative Results
위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 ZIKV 역가를 평가하기 위해 Ifnar1-/-마우스는 풋패드에 피하(SC) 주사를 통해 ZIKV(PRVABC59)에 감염되었다. 여기서, ZIKV의 1 x 105 FFU를 8-12주 령 Ifnar1-/-마우스 SC의 투여는 치명적이지 않지만 바이러스는 주변및 CNS 모두에서 복제할 수 있다. 이 복용량 및 경로 호스트 병원 체 면역 반응 및 병원 성을 연구 하는 데 사용 됩니다. 1 x 105 ZiKV의 FFU를 8-12주 령 Ifnar1-/- 마우스 정맥내(IV) 주사는 80~100% 치명적이며, 동물은 8~14일 사이의 감염에 굴복하여 바이러스 주사를 한다. 우리는 정기적으로 항 바이러스 및 치료제의 효능뿐만 아니라 전임상 백신 후보 테스트를 결정하기 위해이 투여 경로를 사용합니다.
4개의 10-12주 령 Ifnar1-/- 마우스는 ZIKV SC및 비장, 간, 신장, 척수 및 뇌의 1 x 105 FFU에 감염되었고, 상기에 상세히 설명된 방법에 의해 감염 후 4일간 수확하였다(도 1). 조직에서 ZIKV의 양은 전술한 바와 같이 96 웰 형식으로 베로 세포를 이용한 초점 형성 분석(FFA)에 의해 분석되었다. FFA를 사용하여, 조직 바이러스 하중은 조직의 g당 포커스 형성 단위(FFU)로 발현된다. Ifnar1의ZIKV 감염의 이전 연구에서 관찰 된 것과 유사-/- 26,우리는 다른 장기에서 바이러스 성 적기의 샘플링 다음 viremia 를 보았다 4 일 후 ZIKV 감염. 이러한 결과는 초점 형성 분석에 의해 장기 수확 및 티터링에 사용되는 방법이 동일한 동물 내의 말초 장기 및 CNS 모두에서 적시를 검출하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다. 흥미롭게도, 우리는 Ifnar1-/- 모든 Ifnar1-/-이 투여량 및 경로로 ZIKV 감염을 생존하기 때문에 Ifnar1-/- 마우스에서 4일 간 감염 후 주변 및 CNS 모두에서 높은 바이러스 역가를 볼 것으로 기대하지 않았다. 우리는 ZIKV가 치사성을 일으키지 않고 Ifnar1의 CNS에서 복제를 계속할 수 있는 방법을 이해하기 위하여 이 관측을 탐구하는 것을 계속하고 있습니다.
포커스 형성 분석 (FFA)을 수행 할 때, 조사관이 할 수있는 여러 기술적 인 실수가 있으며, 이는 최적이 아닌 FFA 결과를 초래할 것입니다. 가장 흔한 실수는 다음과 같습니다 : 1) 장기 독성; 2) 활발한 파이펫팅; 3) 섬유 오염; 4) 잘못된 셀 도금 밀도. 아래에서 이러한 각 문제를 논의하고 그림 2의결과를 설명합니다. FFA 및 플라크 분석모두에서 발생하는 보다 일반적인 문제 중 하나는 장기 독성이다(도2A 적색 화살표). 우리는 기관 독성이 기관 균질화 도중 풀어 놓인 세포내 분대의 고농도에 의해 주도된다고 믿습니다. 장기 독성은 기관에 따라 다르며 감염되지 않은 동물에서 수확 한 기관에서 볼 수 있으며 간이 가장 독성이 있고 비장이 가장 적습니다. 기관이 FFA 플레이트에서 연속적으로 희석됨에 따라 독성이 감소됩니다. 그러나 독성은 분석법의 민감도를 변화시켜 검출한계의 변화를 초래한다. 도 2A에 도시된 바와 같이 장기내의 바이러스 성가자가 독성보다 낮으면 FFA는 바이러스 적규자를 정확하게 기록할 수 없을 것이다. 도 2B는 웰 a1-4에서 독성을 나타냈지만, 바이러스 역가는 웰 b3 및 b4에서 볼 수 있는 바와 같이 장기 독성을 극복하기에 충분히 높다. FFA에서 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 또한 기관 역가 샘플에 정량적 실시간 PCR을 수행합니다. 그림 2C에서는몇 가지 일반적인 기술적 오류를 보여 줍니다. 활발한 파이펫팅 또는 세척은 단층(그림2C, *)을 제거할 수 있으며, 이러한 데이터가 초점우물에서 발생하면 데이터가 손실되어 역가 결과에 대한 부정확한 보고가 발생할 수 있습니다. 실험실 벤치 흡수 제 종이에 존재하는 섬유 또는 머리카락은 개별 우물을 오염시킬 수 있습니다 (그림2C, $) 이것은 자동화 된 계수 프로그램을 사용하는 경우 상당한 오류를 일으킬 수 있습니다. 대부분의 자동화 된 계수 프로그램은 섬유 배제 옵션을 가지고 있지만, 우리는 분석에서 섬유를 제외에 매우 효과적인 것으로 나타났습니다. 이에 대한 해결책은 우물을 수동으로 계산하는 것이며, 이는 매우 시간이 많이 소요될 수 있으며 큰 분석 분석에는 실용적이지 않습니다. 세포 밀도는 초점 형성 분석법의 성공에 극적으로 영향을 미칠 수 있는 또 다른 문제이다(도 2D). 세포가 분석의 시작 부분에 적당한 조밀도에 있지 않다면 반점의 수와 크기는 영향을 받을 것이다. 도 2D에도시된 바와 같이, 컬럼 1-3, 90% 합류 컬럼에서 도금된 세포에 비해 분석의 시작 시 약 60% 동률에서 세포 4-6은 초점 형성 분석에 극적으로 영향을 미칠 것이다. 이 장애물을 극복하기 위하여 작은 파일럿 분석은 개별적인 실험실 조건이 분석의 성공에 영향을 미칠 것이기 때문에 세포 조밀도 및 고정 시간을 낙관하기 위하여 실행되어야 합니다.
감염된 동물의 다른 그룹을 비교할 때 연구의 경우, 수행되는 통계 분석은 데이터의 분포에 따라 달라집니다. 파라메트릭 또는 비모수성 검사는 통계적 유의성을 평가하는 데 사용됩니다. 파라메트릭 테스트의 경우, ANOVA는 전반적인 효과를 감지하는 데 활용되며, 개별 치료 그룹은 Dunn의 테스트를 사용하여 비교됩니다. 데이터 분포가 파라메트릭 분석에 대한 요구 사항을 충족하지 않는 경우 비모수성 테스트가 사용됩니다. Kruskal-Wallis 시험은 전반적인 처리 효력을 검출하기 위하여 이용되고, Mann-Whitney U 시험은 쌍 으로 비교를 능력을 발휘하기 위하여 이용됩니다. 여기에 존재하는 결과를 위해 우리는 이 시점에서 수확된 두 번째 데이터 세트와 동물을 비교하지 않았므로 표시된 데이터 세트에 대한 통계 분석을 수행하지 않았습니다.
그림 1: 주변 및 CNS에서의 바이러스 복제. IFNAR1후 말초 및 CNS 조직에서의 바이러스 부담은 ZIKV SC의 1x105 FFU를 부여한다. 4일째(그룹당 n =4) 감염 후 장기를 수확하고, 스냅 냉동, 계량 및 균질화하였다. 바이러스의 수준은 초점 형성 분석에 의해 정량화되었다. 검출의 한계는 기관에 근거를 둔 100-500 FFU/그램입니다. 데이터는 조직의 그램 당 로그10 포커스 형성 단위로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 포커스 형성 분석과 일반적인 어려움. 바이러스 성 항원항을 나타낸 모든 초점 형성 분석실험에 대해 항플라비바이러스 MAb로 검출되었고, 이어서 면역페록시다아제 염색(purple)이 뒤따랐다. (A) 베로 세포는 90% 동률로 성장하였고, 8주령 C57BL/6 마우스로부터 수확한 간으로부터 상피의 10배 직렬 희석에 감염되었고, IV는 4일 전에 ZIKV의 5 x 107 FFU에 감염되었다. 빨간색 화살표는 이 농도에서 독성을 나타내는 간 상판의 최고 또는 "깔끔한" 농도를 나타냅니다. (B) 베로 세포를 90% 동률로 성장시키고 ZIKV 감염 신장 세포로부터 상피의 10배 희석으로 감염하였다. 이 경우 열 1과 2의 샘플은 C57BL/6 마우스에서, col 3 및 4는 Ifnar1에서온 것입니다 ./-. 두 마우스 모두 ZIKV IV의 1 x 105 FFU에 감염된 8주 령으로 감염되었고 4일 후 감염을 희생하였다. (A)와 유사하게 가장 높은 농도(행 a)에서 볼 수 있는 독성이 있지만, 컬럼 3 및 4에서 관찰된 바이러스 성 역가가 검출 문제의 한계를 극복하여 정확한 적수를 검출할 수 있도록 한다. (C) 베로 세포를 도금하였다. 선택한 웰은 일반적인 기술적 오류를 보여줍니다. *는 격렬한 파이펫팅으로 인해 단층이 제거된 영역을 보여 줍니다. $는 섬유를 볼 수있는 우물 위에 놓입니다. (D) 베로 세포 농도는 분석의 민감도에 영향을 미친다. 이 플레이트에서 Vero 세포는 컬럼 1-3 및 3.0 x 104 Vero-WHO 세포/웰 에서 1.0 x 104 세포/웰에서 1-0 x 10 로 도금하였다. 이어서 플레이트를 ZIKV PRVABC59 스톡의 10배 희석에 감염되었다. 가장 높은 바이러스 농도 샘플은 행 A에 있고 아래로 희석되고, 각 행은 10 배 희석을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
ZIKV 감염은 신경 질환을 일으킬 수 있으므로 현재 동물 모델은 병인, 면역 반응 및 백신 및 항 바이러스의 보호 효능을 연구하기 위해 CNS 내의 바이러스 제어에 집중할 필요가 있다. CNS 질병에 초점에 있는 도전의 한가지는 말초 감염을 공부하는 비용으로 수시로 온다입니다. 여기에 제안된 기관 격리 방법은 CNS 중재ZIKV 관련 질병을 평가하고 항바이러스제, 치료 및 전임상 시험을 위한 모형을 확립하기 위하여 둘 다에 있는 ZIKV 감염을 급속하게 평가하는 필요에 집중합니다 백신. 이 기술의 추가 적인 이점은 또한 ZIKV에 면역학 반응의 결합한 연구 또는 감염의 조직학 분석을 포함하여 융통성의 높은 정도를 허용한다는 것입니다. 이 기술은 단지 ZIKV에 한정되지 않고 또한 뎅기열 바이러스21,원숭이 두배 및 ectromelia 같이 orthopoxviruses와 같은 플라비바이러스를 포함하여 호스트 병원체 상호 작용의 범위를 공부하기 위하여 보편적으로 적용될 수 있습니다. 이러한 수확 기법의 고려 사항과 단점은 주로 실험자의 능력에 초점을 맞춘다. ZIKV는 실온에서 장시간 동안 안정되지 않기 때문에 관류 후 장기를 수확하는 데 걸리는 시간은 결과의 품질에 크게 영향을 미칠 수 있습니다. 우리가 수행 한 대부분의 실험에 대해, 우리는 두 가지 조건으로 치료 마우스에서 바이러스 성 역가를 비교, 그래서 우리는 속도에하지 장기 수확 사이의 시간의 일관성에 우리의 노력을 집중. 이런 식으로 동일한 사람은 일관성을 유지하기 위해 전체 실험에 대해 동일한 절차를 수행합니다. 이 절차와 다른 주요 고려 사항은 안전, 우리는 쉽게 BSL-2 (ZIKV, 뎅기열 바이러스) 및 BSL-3 (WNV, 치쿤구냐 바이러스) 병원체와 이러한 방법을 수행했다. 소독제가 있는 깨끗하고 잘 관리되고 인증된 생체 안전 캐비닛에서 모든 절차를 수행하는 것이 매우 중요합니다.
FFA는 플라크 가 아닌 감염된 세포의 초점을 확인하기 위해 과산화아제 면역 염색을 사용한다는 점을 제외하고는 플라크 분석과 유사합니다. 내 실험실뿐만 아니라 여러 다른 실험실은 이제 성공적으로 우리의 모든 tittering 실험11,14,15,17,26,27에 대한 FFA를 사용하여 전환했습니다 ,28. FFA는 전통적인 플라크 분석에 비해 여러 가지 장점을 갖는다: a) FFA는 플라크 분석에 비해 더 짧은 배양을 요구, b) 또한 더 높은 처리량, 96 웰 플레이트에서 수행되고. 96 웰 플레이트 형식은 더 적은 양의 시동 재료를 수용할 수도 있습니다. 또한, c) FFA는 자동 플레이트 와셔 및 자동 스팟 카운터의 사용과 호환되어 분석에 필요한 노동력과 시간을 크게 줄입니다. FFA는 감염 후 더 많은 단계를 가지고 있지만, d) 멀티 채널 파이펫, 또는 파이펫 팅 로봇의 사용과 함께, 고정 후 대부분의 분석 단계에 대한 타이밍은 유연하고 분석은 밤새 또는 더 이상 일시 중지 될 수있다. 마지막으로, e) 뎅기열 바이러스와 같은 명확한 플라크를 형성하지 않는 바이러스 균주에 특히 유용할 수 있다. FFA의 한 가지 단점은 다양한 바이러스 균주 또는 돌연변이 바이러스를 고려할 때 혼란스러울 수 있는 바이러스 감염 세포를 검출하기 위해 특정 항체가 필요하다는 것입니다. 플라크 분석과 마찬가지로 FFA의 경우 감염 시 세포 단층의 밀도는 분석의 성공을 위해 중요하다. 세포는 고정하기 전에 시간의 단축 된 길이로 인해 플라크 분석과 비교하여 FFA에 대한 더 높은 합류에서 사용되어야한다. FFA가 처리량이 높기 때문에 기존의 플라크 분석보다 더 비용 효율적이고 빠르기 때문에 실험실에서 새로운 전염병 연구를 위한 데이터를 신속하게 분석할 수 있습니다. FFA는 여러 가지 이유로 더 누적적으로 더 비용 효율적입니다. 항체는 중성 적색 또는 크리스탈 보라색보다 더 비싸지 만, 우리는 비용 차이를 제거하는 플레이트 당 더 많은 샘플을 분석 할 수 있습니다. 인건비 배분 의 관점에서 자동 스팟 카운트 및 분석을 위한 간편한 데이터 입력은 인건비를 제한하고 기록으로서의 장기적인 이미지를 가질 수 있는 능력은 정량화하기 어렵다. 이 분석의 미래는 HRP가 아닌 판독을 위한 형광 기반 초점으로 이동하는 것일 수 있습니다. 현물 번호와 함께 형광 강도를 양량화하면 현재 연구된 것 이상으로 FFA의 유용성을 확장할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다
Acknowledgments
핀토 박사는 세인트 루이스 의과 대학의 종자 보조금과 세인트 루이스 의과 대학의 창업 기금으로 자금을 지원받습니다. Brien 박사는 NIH NIAID의 K22AI104794 초기 조사자 상과 세인트 루이스 대학 학교의 종자 보조금으로 자금을 지원받습니다. 모든 기금이 투자된 개인의 경우, 기금 모금자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을 하지 않았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18 G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1 cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37 °C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96 well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5 mL eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| Curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose With 4,500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5 mL EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| O-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| One step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| Spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| Straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
References
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