Summary
Målet med protokollen er å demonstrere teknikker som brukes til å undersøke viral sykdom ved å isolere og kvantifisere Zika virus, fra flere organer i en mus etter infeksjon.
Abstract
Metodene blir presentert demonstrere laboratorie prosedyrer for isolering av organer fra Zika virusinfiserte dyr og kvantifisering av viral belastning. Formålet med prosedyren er å kvantifisere viral titers i perifere og CNS områder av musen på ulike tidspunkt poeng etter smitte eller under ulike eksperimentelle forhold for å identifisere virologisk og immunologiske faktorer som regulerer Zika virus infeksjon. Organ isolasjons prosedyrene viste gir mulighet for både fokus forming av analyse kvantifisering og kvantitativ PCR-vurdering av viral titers. De raske organ isolasjons teknikkene er utviklet for å bevare virus titer. Viral titer kvantifisering av fokus forming analysen gjør det mulig for rask gjennomstrømming vurdering av Zika virus. Fordelen med fokus forming analysen er vurderingen av smittsomme virus, er begrensningen av denne analysen potensialet for organ toksisitet redusere grensen for deteksjon. Viral titer vurdering er kombinert med kvantitativ PCR, og ved hjelp av et rekombinant RNA kopi kontroll viral Genova kopi nummer innenfor orgelet er vurdert med lav grense for påvisning. Samlet disse teknikkene gir en nøyaktig rask høy gjennomstrømning metode for analyse av Zika viral titers i periferien og CNS av Zika virusinfiserte dyr og kan brukes til vurdering av viral titers i organer av dyr smittet med de fleste patogener, inkludert Dengue virus.
Introduction
Zika virus (ZIKV) er en arbovirus som tilhører den hvilken familien, som inkluderer viktige neuroinvasive menneskelige patogener som Woodstock virus (POWV), japansk encefalitt virus (JEV), og West Nile virus (WNV)1. Etter sin isolasjon og identifisering, har det vært periodiske rapporter om menneskelige ZIKV infeksjoner i Afrika og Asia2,3,4,5, og epidemier i Sentral-og Sør-Amerika (omtalt i Referanse6). Men det var ikke før nylig at ZIKV ble antatt å forårsake alvorlig sykdom7. Nå er det tusenvis av tilfeller av nevrologiske sykdommer og fødselsskader knyttet til ZIKV infeksjoner. Den raske fremveksten av ZIKV har bedt om mange spørsmål knyttet til: hvorfor det er en økning i sykdoms alvorlighetsgrad, hva er det immunologiske svaret på ZIKV infeksjon og er det viral og/eller immune mediert patologi knyttet til økningen i nevrologiske manifestasjoner og fødselsskader. Det er nå et rush å forstå sentralnervesystemet (CNS) relatert sykdom forbundet med ZIKV samt behovet for å raskt teste effekten av antivirale midler og vaksiner mot ZIKV. Det er mot denne bakgrunnen at vi har utviklet metoder for rask analyse av ZIKV titers i både periferien og CNS ved hjelp av en ZIKV-spesifikk fokus forming analyser (FFA).
Små dyremodeller er viktige for å forstå sykdomsprogresjon og for tidlig evaluering av vaksiner, legemiddel, og anti-Virals. Vi har etablert små dyremodeller for studiet av arbovirus sykdom ved hjelp av ulike mus belastninger for å modellere menneskelig infeksjon og beskyttelse mot viral patogener8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Ved hjelp av denne tidligere erfaring, begynte vi å endre teknikker som brukes for vurdering av WNV og Dengue virus, en relatert Flavivirus for vurdering av ZIKV titer i både perifere organer, samt CNS21,23, 24. fordelene med disse metodene fremfor andre analyser er: 1) at de kombinerer evnen til å høste både PERIFERE og CNS organer for analysen; 2) metodene er tilpasningsdyktige for Flow flowcytometri, for målinger av medfødte og adaptive immunresponser, sammen med viral titers på samme dyret i samme organ; 3) innhøstingen teknikken er tilpasningsdyktig for histologiske analyse; 4) ZIKV FFA er en rask høy gjennomstrømning metode for viral titer analyse; og 5) disse metodene kan brukes til vurdering av viral titers i organer av dyr smittet med de fleste patogener25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer i denne studien er i samsvar med retningslinjene fastsatt av St. Louis University Animal Care og use Committee. SLU er fullt akkreditert av foreningen for vurdering og akkreditering av laboratorium Animal Care International (AAALAC).
1. organ isolasjon
Merk: Viruset er ikke stabilt ved romtemperatur (RT), slik at antall dyr høstes på en gang må planlegges nøye for å bevare viral titers.
- Infisere mus ved hjelp av valgt dose og rute, basert på fenotype som kreves. For denne protokollen, infisere 8-10 uke gammel mannlig og kvinnelig type jeg interferon reseptor mangelfull (Ifnar1-/-) C57BL/6 mus.
- Bedøve Ifnar1-/- mus med en cocktail av ketamin (90 mg/kg) og Xylazine (10 mg/kg). Test pedal refleks av en fast tå knipe for å bekrefte anestesi. Administrer 1 x 105 fokus forming SENHETER (FFU) av ZIKV i 50 μL SUBKUTANT (SC) via footpad.
- Forbered alle materialer som trengs for innhøsting dagen før: 2 saks, tang og 20 mL 70% etanol (EtOH) i en 50 mL konisk for desinfeksjon av verktøy.
- Forbered sprøyter og nåler: en 20 mL sprøyte for å holde, 23 G nåler (ca 1 per bur) og 1 mL sprøyte med 25 G nål (1 per 3-5 mus). Før veie rør, tilsett stål perler (i hette) til 1,5 mL O-ring skrulokk rør (ett for hvert organ). Rørene må være passende for homogenisering.
- Forbered dagen for innhøstingen materialene som trengs for å og orgel frysing.
- Fyll en is bøtte med tørr is og 70% EtOH å lage et is bad. Forbered sterilt fosfat-bufret saltvann (PBS) forutsatt at 25-30 mL per mus av PBS for hver av dem er nødvendig 5-10 mL for ryggmargen). Skaff anestesi, en cocktail av ketamin og Xylazine, og anta 300 μL per mus. Plasser alle materialer og eventuelle ekstra rør som kreves for Flow flowcytometri, etc., i en sekundær container til transport til dyret anlegget.
- Følg alle nødvendige prosedyrer for å komme inn, inkludert å ta på og doffing personlig verneutstyr under innreise og gå ut i dyre anlegget.
Forsiktig: Alle prosedyrene skal utføres i en sertifisert biosafety kabinett innenfor en biosafety nivå 2 laboratorium (BSL-2) anlegget. - Administreres anestesi, 200-500 μL, intraperitonealt avhengig av størrelsen og vekten av dyret. Hvis arbeider alene, administrere anestesi å ettall dyr med ett tid å unngå mordene dyrene tidligere organ innhøsting.
- Bekreft anestesi dosen ved å knipe tå med tang for å evaluere pedal refleks. Ikke Fortsett med mindre helt avslutte. Bruk pins for å feste musen til et voks brett. På dette punktet, slukke musen i 70% etanol for å unngå hår forurensning i organ Harvest prosedyre
- Uhelbredelig blødning av hjerte punktering.
- Ved hjelp av saksen og tang, åpne dyret gjennom brystet hulrom for å avdekke hjertet. Samle blod via hjerte punktering (~ 800 μL), kan dette brukes til flere analyser inkludert Klinisk kjemi, hematologi, Flow flowcytometri å oppdage antigen spesifikke reaksjoner, og sanntids kvantitativ PCR (qRT-PCR) for analyse av viral kopi nummer.
- For viral RNA-analyse ved qRT-PCR samler du blod i et EDTA-rør hvis du trekker ut fra hele blod eller i et mikrosentrifugen rør hvis du trekker ut fra serum. (For serum, spin tube med maksimal hastighet i sentrifuge, rom temp, i 20 min og fjerne serum til et eget rør). Legg til en lineær polyakrylamid som en transportør i serum prøven etter endt. RNA kan deretter analyseres eller lagres ved-80 ° c til videre behandling på et senere tidspunkt.
- Fyll 20 mL sprøyte med PBS, i romtemperatur (eller 37 ° c), og perfuse mus ved å sette sommerfugl nålen inn i venstre ventrikkel. Punktering høyre Atrium for å tillate blod og PBS å avslutte. Sakte administrere PBS mens du sjekker fargen på leveren for å bekrefte at dyret er helt perfusert. Leveren bør endres fra dyp rød til rosa laks farge.
- Hvis du forbereder organene for histologi, la sommerfugl nålen på plass og deretter perfuse med 20 mL iskald 4% paraformaldehyde. I så fall er det praktisk å ha sprøyten koblet til en 3-veis stopcock med begge sprøyter festet til den, slå ventilen på og av som en veksler mellom PBS og PFA.
- Harvest organer i merket, veide rør. For perifere organer, følger en etablert ordre for innhøsting: lever, milt, nyre og lunger.
- Ta bare en flik fra leveren; Det spiller ingen rolle hvilken, men for alle eksperimenter alltid prøve å ta samme flik med samme størrelse stykke. Tilsvarende, for nyrer og lunger, ta samme nyre og lunge. Hvis strømnings flowcytometri også skal fullføres, kan ethvert organ kuttes i to. Lagre halvparten som skal brukes til flowcytometri i Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) ved romtemperatur inntil innhøstingen er fullført.
- Umiddelbart etter innhøsting, sette hvert organ i et merket rør og plass i det tørre isen bad. Virus titer reduserer over tid ved romtemperatur, så hvor mye tid det tar å høste organer er ekstremt viktig. Det må være konsistens mellom mus, så etter sikkerhet, er neste prioritet hastighet.
Merk: Hvis høsting organer for viral titers, er det svært nyttig å ha en annen individuell høste hjernen på dette punktet, for å bevare viral titers.
- Fjern de resterende organene fra musen kroppen hulrom for å få tilgang til ryggraden og skallen.
- Fjern musen fra brettet og fjerne Pelt, etterfulgt av fjerning av armer og ben.
Fjern hodet på musen med en halshogging, sløv eller kirurgisk saks for å høste hjernen ved å kutte skallen med en taggete LaGrange saks gjennom foramen Magnum. Deretter løsner du skallen med tang og scoop ut hjernen med en slikkepott. - Ved hjelp av sterke, avstumpet saks, fjerne ribbeina og andre bein rundt ryggraden. Deretter kuttes over bekkenbenet, utsette vertebrale foramen på korsryggen. Den lille spissen av ryggmargen skal være synlig på dette punktet.
- Bruk en 10 mL sprøyte fylt med PBS og en 18 G nål til å utvise ryggmargen ved å "skylle" ledningen fra korsryggen til cervical ryggraden over en Petri parabolen.
- Forsiktig, plasser skrå tuppen av nålen inne i vertebrale foramen, unngå overdrevent press for å hindre nålen å adgang inn i vertebrale kroppen. Hold sterkt for å utøve press på vertebrale kropp og nål og trykk på sprøytestempelet for å utvise ledningen. Umiddelbart overføre ryggmargen i merket rør og plass i det tørre isen bad.
- Fjern musen fra brettet og fjerne Pelt, etterfulgt av fjerning av armer og ben.
- Gjenta prosedyren med alle dyrene til innhøstingen er fullført. Plasser innhøstingen verktøy i 70% etanol mellom dyr. Fokuser på konsistens og hastighet. Hvor lang tid mellom hvert organ høste bør være konsistent slik at det ikke bias viral titer resultater.
- Når du er ferdig, desinfisere biosafety kabinett og alt materiale før du fjerner den fra dyret anlegget.
- Fjern hvert rør fra isen bad og veie rør for å bestemme organer vekt. For å bestemme organene vekt, subtrahere vekten av det tomme røret fra vekten av organet som inneholder rør.
Merk: På dette punktet organer kan fryses på-80 ° c til videre prosess på et senere tidspunkt eller organer kan bli homogenisert umiddelbart før frysing individuelle alikvoter. Frys tine prøvene flere ganger reduserer viral titer. Derfor er det viktig å gjøre samme prosedyre for alle eksperimenter i et enkelt prosjekt.
2. orgel homogenisering
- Forbered 3 merket, 1,5 mL snap-avkortet rør for hvert organ som skal homogenisert.
- Hvis prøvene ikke blir homogenisert umiddelbart etter innhøsting, Fjern rør fra-80 ° c. Prøvene trenger ikke å bli tint til homogenisere.
- Sett prøvene på isen for å holde dem kaldt for å minimere viral titer tap. Tilsett deretter 1 mL kaldt DMEM inneholdende 5% FBS til hvert organ som inneholder rør.
- Slå umiddelbart rør i perle visp i henhold til produsentens anvisninger. Homogenisere alle organer med stål perler i en perle-homogenisator instrument. Kontroller at hvert organ har blitt fullstendig homogenisert.
- Snurr ned orgel rester i microfuge ved 12 000 x g i 5 minutter i en microfuge som har blitt kjølt til 8 ° c. Deretter returnere rørene til isen bøtte. I biosafety skapet, alikvot prøver i rør for nødvendige analyser. Deretter returnere rørene til isen bøtte.
- For alikvot 500 i et merket rør. Deretter plasserer rør i stativet på en is bøtte. Alikvot 50 μL inn i et rør for RNA for fluorogenic kvantitative RT-PCR (qRT-PCR) for å måle viral Genova kopi nummer.
- Isoler total RNA fra organene til de infiserte dyrene ved hjelp av et kommersielt RNA isolasjons sett. Bestem Flavivirus viral RNA bruker primer sonde sett spesifikke for ZIKV, som gjenkjenner unike sekvenser i hver Flavivirus Genova. Bestem viral kopi nummer ved hjelp av en kopi kontroll plasmider inneholder en definert positiv single-strandet RNA generert in vitro bruker T7 polymerase inneholder ZIKV mål sekvenser.
- Alikvot den gjenværende prøven, som er ca. 300 μL, i det tredje røret og oppbevares ved-80 ° c om nødvendig.
Merk: Hvis prøvene ikke var frosset tidligere, fryser du ved-80 ° c. Hvis prøvene tidligere var frosset, fortsetter du til fokus forming og/eller RNA-isolasjonen før du stopper.
3. Zika virus Focus forming analysen26
Merk: Det er viktig å inkludere en ingen viruskontroll og en positiv kontroll. Den positive kontrollen er en fortynning serie av et virus lager med en kjent konsentrasjon. Ikke alle kontroller må være på samme plate, men som analysen blir større enn 5 plater, bør flere kontroller legges, og spredt ut blant platene. Pass på at du ikke skraper opp monolag med enten Pipet tuppene eller ved kraftig vasking. Flere organer kan være titered på samme dag eller på forskjellige dager. Men en individuell organ bør ikke være titered over flere dager fordi ulike analysen forhold kan påvirke viral titer. Det anbefales sterkt å kjøre et enkelt organ på en enkelt dag.
- Før den dagen analysen, forberede cellene og reagenser som trengs for fokus forming analysen.
- Klargjør vekstmedium som inneholder 500 mL DMEM med 5 mL HEPES og 25 mL FBS. Har Vero-World Health Organization (WHO) celler vokser i vekst medier ved 37 ° c, 5% CO2 før starten av analysen. The Vero cellene bør ikke være en høy passasje eller noen gang vokst over 100% confluency før starten av analysen.
- Forbered 500 mL av en 2% methylcellulose oppløsning ved å autoklavering en 1 L glass medie flaske med 10 g methylcellulose og en stor røre bar og en separat 1 L glass medie flaske med 500 mL H2O. Hvis det autoklaveres vannet har avkjølt varm i mikrobølgeovn til flasken er varm å ta på, men ikke kokende.
- Hell forsiktig varmt/varmt vann i flasken med methylcellulose mens i vevet kultur panseret. Delvis cap flasken og rør kokesonen til methylcellulose er i oppløsning (1-4 h). Alikvot 2% methylcellulose oppløsning i steril 50 mL konisk slange. 2% methylcellulose kan lagres ved 4 ° c til det er nødvendig.
- Forbered en 5% Paraformaldehyde løsning i PBS for festing av platene og lagret ved 4 ° c til nødvendig. Forbered en 1x fokus forming analysen vaskebuffer ved å legge 0,05% Triton X-100 til PBS og lagres på RT. klargjør en 1x-farge buffer for FFA ved å tilsette 1 mg/mL saponin til PBS og lagret ved 4 ° c til det er nødvendig. Disse kan tilberedes en-to uker i forveien.
- Beregn antall flat-Bottom 96 brønn plater som trengs for analysen slik at hvert organ er belagt i tre eksemplarer. Ta med nok ekstra brønner for positive og negative kontroller.
- Vokse opp nok Vero celler i vekst medier for å fullføre analysen utformet. Trypsinize de Vero cellene og telle dem blanding dem på 1,5 x 105 celler per ml i vekst medier. Plate Vero celler i 96-platene, på 3,0 x 104 Vero-Who-celler/brønn i vekst medier ved å legge til 200 μL per brønn.
- Ruge plater ved 37 ° c ved 5% CO2 over natten, sørg for at platene er nivået i inkubator slik at cellene er like fordelt i brønnen.
Merk: Hvert laboratorium vokser Vero celler litt annerledes; målet er en 90-95% confluent monolag i hver brønn på dagen av analysen for Zika virus.
- Fortynne Zika virus prøver dagen av analysen. Hvis orgel prøvene tidligere hadde blitt homogenisert, Fjern prøvene fra-80 ° c fryseren og la dem tine før du plasserer prøvene på isen for analysen.
- På isen, utarbeide en rund bunn 96 brønn plate ved å legge til 180 μL av kaldt vekst Media til rader B gjennom H forlate rad A tom. Tilsett 150 μL av hver homogenisert orgel prøve til rad A av den runde bunnplaten.
- Forbered seriell 10-fold fortynninger av hver prøve, ved hjelp av en multi-kanals pipette. Fortynne prøver i en rund bunn 96 brønn plate ved å legge til 20 μL av prøve i 180 μL av vekst medier, skiftende pipette tips mellom hver fortynning.
- Forbered fokus forming plate ved å fjerne Media fra flat-Bottom 96 brønn plate som dekker Vero celler. Gjør dette umiddelbart før du legger til viruset prøvene å hindre at monolag tørker ut.
- Tilsett 100 μL av viruset fortynning til hver brønn i Vero plate. Legg til prøve med det samme settet med tips ved å gå fra laveste til høyeste konsentrasjon. Rock plater side-til-side 2-4 ganger være forsiktig så du ikke virvel.
- Ruge ved 37 ° c, 5% CO2 for 1-2 h. Sørg for at platene er Plant i inkubator. Under inkubasjons varme opp 2% methylcellulose til RT.
- Fortynne 2% methylcellulose løsning inne oppblomstringen Media. Den fortynning bør være i et forhold på ca 2:1 av 2% methylcellulose til vekst medier. Hold på rommet temp til det er på tide å bruke den. Tilsett 1-2 dråper/brønn (sett Pipet til 125 μL) av methylcellulose: vekstmedium til hver brønn av 96 brønn plate.
- Ruge 32-40 h ved 37 ° c, 5% CO2. Som alles Vero celler vokse litt annerledes og faktorer, inkludert celle confluency og stamme av Zika virus kan endre inkubasjonstid.
- Fix Vero cellene ved hjelp av forberedt 5% paraformaldehyde løsning.
- Tilsett 50 μL av 5% paraformaldehyde til hver brønn over toppen av det methylcellulose laget i biosafety skapet. Ruge for 60 min ved RT. Feste kan gå over natten ved 4 ° c, men dekker platen med parafilm for å redusere fordampning.
- Dump overlegg og Media av celler i en avhendings beholder inne i biosafety skapet. Vask forsiktig med PBS, 150 μL/brønn. Fjern PBS fra platene og fjerne platen fra BSL-2.
- Gjenta PBS vask 2x legge til 150 μL/brønn. Deretter fjerner PBS. Legg 150 μL/Well 1x FFA vaskebuffer og la sitte i 5-10 min på RT å permeabilize de faste cellene.
- Oppdag infeksjon ved hjelp av primært Zika-antistoff. Klargjør det primære antistoff 4G2 (D1-4G2-4-15) ved en konsentrasjon på 1 mg/mL i farge bufferen til FFA. Forbered nok antistoff for hele analysen.
Merk: Hold deg unna Lab bleier eller andre høy-lo absorberende materiale som fibrene vil negativt påvirke Imaging av fokus.- Fjern FFA vaskebuffer fra platene. Tilsett 50 μL/brønn av det primære antistoff i farge bufferen FFA. Forsegle platene med parafilm og ruge over natten ved 4 ° c på en rocking plattform. Analysen kan gjøres med en inkubasjons for 2 timer ved RT.
- Visualiser infeksjonen ved tilsetning av en sekundær HRP bøyd antistoff. Forbered den sekundære Goat anti-mus HRP-merket antistoff ved en konsentrasjon på 1:5000 i FFA farge buffer. Forbered nok antistoff for hele analysen.
- Vask celler 3x med FFA vaskebuffer, fjerne vaskebuffer ved å sveipe inn i vasken hver gang. Stain cellene med sekundær antistoff i FFA farge buffer på 50 μL/brønn. Ruge 1-2 h for RT.
- Vask celler 3x med FFA vaskebuffer, fjerne vaskebuffer ved å sveipe inn i vasken hver gang. Tilsett 50 μL/brønn av trueblue substrat.
- Se platene nøye, venter 2-15 min til flekkene er fullt definert og minimal bakgrunn. Etter at flekkene er synlige, vask forsiktig med vann, ved hjelp av en hånd for å skjerme monolag fra kraft av vannet som kjører. Trykk tørt på papirhåndklær (NOT BLEIER) og bilde så snart som mulig.
- Flekker kan telles manuelt eller ved hjelp av en automatisert spot teller. Hvis det telles manuelt, kan et dissekere omfang brukes til å hjelpe til med visualisering.
- For hver prøve velger du en fortynning med lett særpregede fokus (f.eks. 20 til 200 per brønn) og beregner titer i fokus enheter per mL (FFU/ml), med gjennomsnittet av duplikat brønner: FFU/mL = (gjennomsnittlig fokus/brønn) × (fortynnings faktor) ÷ (mL inokulum).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å evaluere ZIKV-titers ved hjelp av protokollen beskrevet over Ifnar1-/- mus ble infisert med ZIKV (PRVABC59) via subkutan (SC) injeksjon til footpad. Her er administrasjonen av 1 x 105 FFU av ZIKV til 8-12 uke gamle Ifnar1-/- mus SC ikke dødelig, men viruset kan replikere i både periferien og CNS. Denne dose og rute brukes til å studere verten patogen immunresponser og patogenitet. Administrasjon av 1 x 105 FFU av ZIKV til en 8-12 uke gamle Ifnar1 -/- Mouse intravenøs (IV) injeksjon er mellom 80 til 100% dødelig, med dyret succumbing til infeksjon mellom 8 til 14 dager etter virus injeksjon. Vi bruker rutinemessig denne administrasjonen rute for å fastslå effekten av antivirale midler og legemiddel selskap, samt prekliniske vaksine kandidat testing.
Fire 10-12 uke gamle Ifnar1-/- mus ble smittet med 1 x 105 FFU av ZIKV SC og spleens, lever, nyrer, rygg snorer og hjerner ble høstet fire dager etter smitte av metodene beskrevet ovenfor (figur 1). Mengden av ZIKV i vevet ble analyseres av fokus forming analysen (FFA) bruker Vero celler i en 96 brønn format som beskrevet ovenfor. Ved hjelp av FFA, er vev viral belastning uttrykt som fokus forming enheter (FFU) per g av vev. I likhet med hva som ble observert i en tidligere studie av ZIKV-smitte av Ifnar1-/- 26, så vi viremia etter et utvalg av viral titers i ulike organer fire dager etter ZIKV infeksjon. Disse resultatene tyder på at metodene som brukes for orgel innhøsting og tittering av fokus forming analysen kan brukes til å oppdage titer i både perifere organer og CNS innenfor samme dyr. Interessant, det gjorde vi ikke forvente å se høy viral titers i både periferien og CNS fire dager etter smitte i Ifnar1-/- mus fordi alle Ifnar1-/- overleve ZIKV infeksjon med denne dose og rute. Vi fortsetter å utforske denne observasjonen for å forstå hvordan ZIKV kan fortsette å gjenskape i CNS av Ifnar1-/- uten å forårsake dødelighet.
Når du utfører fokus forming analysen (FFA), er det flere tekniske feil en etterforsker kan gjøre som vil resultere i suboptimal FFA resultater. De vanligste feilene er: 1) organ toksisitet; 2) energisk pipettering; 3) fiber forurensning; og 4) feil celle plating tetthet. Vi diskuterer hvert av disse spørsmålene nedenfor og illustrerer utfallet i figur 2. En av de vanligste problemene som oppstår med både FFA og plakk analysen er organ toksisitet (figur 2a rød pil). Vi tror organ toksisitet er drevet av den høye konsentrasjonen av intracellulære komponenter utgitt under organ homogenisering. Organ toksisitet varierer basert på orgelet og er sett i organer høstet fra friske dyr, med leveren er den mest giftige og milten minst. Toksisitet er redusert som orgelet er serielt fortynnet på FFA plate. Imidlertid endrer toksisitet følsomheten til analysen som resulterer i en endring i grensen for påvisning. Som vist i figur 2a hvis viral titer i orgelet er lavere enn TOKSISITET i FFA vil ikke være i stand til å nøyaktig registrere viral titers. Figur 2b illustrerer toksisitet i brønner a1-4, men viral titer er tilstrekkelig høy til å overvinne organ toksisitet som sett i brønner B3 og B4. For å overkomme denne begrensningen i FFA, utfører vi også kvantitativ sann tids PCR på organ titer prøver. I figur 2Cillustrerer vi flere vanlige tekniske feil. Kraftig pipettering eller vasking kan fjerne monolag (figur 2C, *), hvis dette skjer i brønner med fokus på at data vil gå tapt, noe som fører til unøyaktig rapportering av titer resultater. Fibre eller hår, som er til stede i laboratoriebenk absorberende papir kan forurense enkelte brønner (figur 2C, $) Dette kan føre til betydelige feil hvis du bruker et automatisert telle program. Mens de fleste automatiserte telle programmer har fiber ekskludering alternativer, har vi ikke funnet det å være svært effektiv på å ekskludere fibre fra analysen. Løsningen på dette er å manuelt telle brønnene, som kan være svært tidkrevende og er ikke praktisk for analyse av store analyser. Celle tetthet er et annet problem som kan dramatisk påvirke suksessen til et fokus forming analysen (figur 2D). Hvis cellene ikke er på riktig tetthet i starten av analysen antallet og størrelsen på flekkene vil bli påvirket. Som vist i figur 2D, kolonner 1-3, celler på ca 60% confluency ved starten av analysen i forhold til celler belagt på 90% confluency kolonner 4-6 vil dramatisk påvirke fokus forming analysen. For å overvinne denne hindringen små pilot analyser bør kjøres for å optimalisere celle tetthet og fiksering ganger som individuelle laboratorieforhold vil påvirke suksessen for analysen.
For studier når forskjellige grupper av infiserte dyr sammenlignes, er den statistiske analysen som utføres, avhengig av fordelingen av data. Enten er parametriske eller parametriske tester brukt til å vurdere statistisk betydning. For parametriske tester, er ANOVA benyttet for å oppdage total effekt, og individuelle behandlingsgrupper vil bli sammenlignet med Dunn ' s test. I tilfelle fordelingen av data ikke tilfredsstiller kravene til parametrisk analyse, er parametriske tester ansatt. Kruskal-Wallis-testen brukes til å oppdage den totale behandlingseffekten, og mann-Whitney U-testen brukes til å utføre par kloke sammenligninger. For resultatene til stede her vi ikke sammenligne dyrene med en andre datasett høstet på dette tidspunktet punktet så vi ikke utføre statistisk analyse på datasett vist.
Figur 1: viral replikering i periferien og CNS. Viral byrde i perifere og CNS vev etter IFNAR1-/- mus er gitt 1x105 FFU av ZIKV SC. På dag 4 (n = 4 per gruppe) etter infeksjon organer ble høstet, snap frosset, veid, og homogenisert. Nivåer av virus ble kvantifisert av fokus forming analysen. Grensen for påvisning er 100-500 FFU/gram basert på orgel. Data vises som log10 fokus-forming enhet per gram av vev. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: vanlige vanskeligheter med Focus-forming analysen. For alle fokus forming analysene vist viral antigen ble oppdaget med en anti-Flavivirus MAb, etterfulgt av immunoperoxidase farging (lilla). (A) Vero celler ble dyrket til en 90% confluency og infisert med en 10-fold seriell fortynning av supernatanten fra leveren høstet fra en 8 UKERS gammel C57BL/6 mus, IV infisert med 5 x 107 FFU av ZIKV 4 dager tidligere. Den røde pilen indikerer den høyeste eller "ryddig" konsentrasjon av leveren supernatanten demonstrere toksisitet ved denne konsentrasjonen. (B) Vero celler ble dyrket til en 90% confluency og smittet med en 10 fold fortynning av SUPERNATANTEN fra ZIKV infiserte nyreceller. I dette tilfellet prøver i kolonne 1 og 2 er fra en C57BL/6 mus og Col 3 og 4 er fra en Ifnar1-/-. Begge musene var 8 uker gammel smittet med 1 x 105 FFU av ZIKV IV og ofret 4 dager etter smitte. I likhet med (A) det er noen toksisitet sett på høyeste konsentrasjon (rad A), men viral titers observert i kolonne 3 og 4 overvinne grensen for påvisning problemer slik at nøyaktig titers å bli oppdaget. (C) Vero celler ble belagt. De valgte brønnene viser til vanlige tekniske feil. Den * demonstrerer et område hvor monolag ble fjernet på grunn av kraftig pipettering. $ Er plassert over en brønn der en fiber kan sees. (D) Vero celle konsentrasjon påvirker følsomheten til analysen. I denne platen Vero celler ble belagt på 1,0 x 104 celler/brønn i kolonne 1-3 og 3,0 x 104 Vero-Who celler/brønn i kolonne 4-6. Da platen var smittet med 10-fold fortynninger av ZIKV PRVABC59 lager. Den høyeste viral konsentrasjon prøvene er i rad A og fortynnet ned, med hver rad representerer en 10-fold fortynning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ZIKV infeksjon kan føre til en nevrologisk sykdom derfor gjeldende dyremodeller å studere patogenesen, immunresponser og beskyttende effekt av vaksiner og antivirale midler må fokusere på viral kontroll i CNS. En av utfordringene med å fokusere på CNS sykdom er at det ofte kommer på bekostning av å studere perifer infeksjon. Orgelet isolasjon metoder foreslått her fokuserer på behovet for å raskt evaluere ZIKV infeksjon i både periferien og CNS for å vurdere CNS mediert ZIKV assosiert sykdom og etablere en modell for prekliniske testing av antivirale midler, terapeutisk og Vaksiner. En ekstra fordel med denne teknikken er at det også gir en høy grad av fleksibilitet, inkludert den kombinerte studie av immunologiske svar på ZIKV eller histologiske analyse av smitte. Denne teknikken, er ikke begrenset til bare ZIKV men kan også universelt brukes til å studere en rekke vert-patogen interaksjoner, inkludert flaviviruses som Dengue virus21, orthopoxviruses som apekatt og ectromelia. Hensynet og ulempene til denne teknikken for høsting fokus hovedsakelig av egenskapene til eksperimentator. Ettersom ZIKV ikke er stabil over lengre tid ved romtemperatur, kan den tiden det tar å høste organer etter å ha blitt betydelig påvirket kvaliteten på resultatene. For de fleste eksperimenter som vi har utført, sammenligner vi viral titers fra mus behandlet med to forhold, så vi fokuserer vår innsats på konsistens tid mellom orgel avlinger ikke på hastighet. På denne måten samme person utfører samme prosedyre for hele eksperimentet for å opprettholde konsistens. Den andre store hensynet med denne prosedyren er sikkerhet, har vi lett utført disse metodene med BSL-2 (ZIKV, Dengue virus) og BSL-3 (WNV, chikungunya virus) patogener. Det er svært viktig å utføre alle prosedyrer i en ren, godt vedlikeholdt, sertifisert biosafety kabinett med desinfeksjonsmiddel.
En FFA paralleller plakk analysen, bortsett fra at den bruker peroksidase immunostaining å identifisere fokus på infiserte celler, snarere enn plaketter. Mitt laboratorium samt flere andre laboratorier har nå byttet til å bruke FFAs foralle våre tittering eksperimenter11,14,15,17,26,27 ,28. FFA har flere fordeler i forhold til den tradisjonelle plakk analysen: a) FFA er raskere, som krever en kortere inkubasjons i forhold til en plakett analysen, b) det er også høyere gjennomstrømming, som utføres i 96-brønn plater. Brønn plateformatet 96 kan også romme mindre volumer med start materiale. I tillegg c) i FFA er kompatibel med bruk av en automatisert plate skive og automatiserte spot telleren, sterkt redusere arbeidskraft og tid som kreves for analysen. FFA har flere trinn etter smitte, men d) med bruk av flerkanals pipets, eller til og med en pipettering robot, timingen for de fleste av analysen trinnene etter fiksering er fleksible og analysen kan settes på pause over natten eller lenger. Til slutt, e) det kan være spesielt nyttig for virusstammer som ikke danner klare plaketter, slik som Dengue virus. En ulempe med FFA er at det krever spesifikke antistoffer for å oppdage virus-infiserte celler, som kan være forvirrende når de vurderer ulike virusstammer eller mutant virus. For FFA som med plakk analysen tettheten av cellen monolag på tidspunktet for infeksjonen er avgjørende for suksessen til analysen. Celler bør brukes ved høyere samløpet for en FFA i forhold til en plakett analysen, på grunn av den forkortede lang tid før fiksering. Som FFA er høyere gjennomstrømming, mer kostnadseffektivt og raskere enn den tradisjonelle plakk analysen det gjør mitt laboratorium for å raskt analysere data for å studere nye smittsomme sykdommer. FFA er mer kumulativt mer kostnadseffektivt av flere grunner. Selv om antistoffer er dyrere enn nøytral rød eller krystall fiolett, er vi i stand til å analysere flere prøver per plate som eliminerer kostnadsforskjellen. I form av arbeidskraft tildeling automatisert spot telling og enkel dataregistrering for analysegrenser lønnskostnader og evnen til å ha et langsiktig bilde som en rekord er vanskelig å kvantifisere. Fremtiden for denne analysen kan være å flytte til en fluorescerende-baserte prioriteringer for en avlesning i motsetning til HRP. Kvantitere fluorescerende intensitet sammen med spot nummer vil forlenge nytten av FFA utover det som for tiden er studert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre
Acknowledgments
Dr. Pinto er finansiert av et frø stipend fra Saint Louis University School of Medicine og oppstart midler fra Saint Louis University School of Medicine. Dr. Brien er finansiert av en K22AI104794 tidlig etterforsker Award fra NIH NIAID samt et frø stipend fra Saint Louis University School. For alle finansierte individer hadde Oppdragsgivers ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18 G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1 cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37 °C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96 well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5 mL eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| Curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose With 4,500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5 mL EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| O-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| One step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| Spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| Straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
References
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
- McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
- Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
- Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
- Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
- Brien, J. D. Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , Oregon Health & Science University. (2007).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
- Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
- Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
- Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
- Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
- Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
- Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
- Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
- Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
- Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
- Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).
