Summary
Цель протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать методы, используемые для исследования вирусных заболеваний путем изоляции и количественной оценки вируса Зика, от нескольких органов в мыши после инфекции.
Abstract
Представленные методы демонстрируют лабораторные процедуры для изоляции органов от инфицированных вирусом Зика животных и количественную оценку вирусной нагрузки. Целью процедуры является количественная оценка вирусных титрав в периферических и ЦНС областях мыши в разных точках времени после инфекции или в различных экспериментальных условиях для выявления вирусологических и иммунологических факторов, которые регулируют вирусную инфекцию зика. Продемонстрированные процедуры изоляции органов позволяют как формировать фокус-формировать количественную оценку, так и количественную оценку ПЦР вирусных титров. Методы быстрой изоляции органов предназначены для сохранения вируса титра. Вирусная количественная оценка титра путем проведения спомощьи фокус-формирования позволяет быстро оценить пропускную стоимость вируса Зика. Преимуществом фокусобразующего ассса является оценка инфекционного вируса, ограничение этого анализа является потенциалом токсичности органов, уменьшающей предел обнаружения. Вирусная оценка титра сочетается с количественным ПЦР, а с помощью рекомбинантного РНК-копировальный контроль вирусного генома в органе оценивается с низким пределом обнаружения. В целом эти методы обеспечивают точный быстрый метод высокой пропускной связи для анализа вирусных титеров Зика на периферии и ЦНС инфицированных животных вирусом Зика и могут быть применены для оценки вирусных титр в органах животных, инфицированных большинством патогенных микроорганизмов, включая вирус Денге.
Introduction
Вирус Зика (ЗИКВ) является арбовирус, который принадлежит к семейство flaviviridae, который включает в себя важные нейроинвазивные человеческие патогены, такие как вирус Powassan (POWV), японский вирус энцефалита (JEV), и вирус Западного Нила (WNV)1. После его изоляции и идентификации, периодически поступают сообщения оинфекциях, инфекциях, инфицированных людьми в Африке и Азии 2,3,4,5,и эпидемиях в Центральной и ссылка6). Тем не менее, он не был до недавнего времени, что ЗИКВ считалось причиной тяжелой болезни7. В настоящее время существуют тысячи случаев неврологических заболеваний и врожденных дефектов, связанных с инфекциями ЗИКВ. Быстрое появление ЗИКВ вызвало много вопросов, связанных с: почему наблюдается увеличение тяжести заболевания, какова иммунологическая реакция на инфекцию ЗИКВ и существуют вирусные и/или иммунные опосредованные патологии, связанные с увеличением неврологических проявления и врожденные дефекты. В настоящее время существует спешка, чтобы понять, центральной нервной системы (ЦНС), связанных с болезнью, связанной с ЗИКВ, а также необходимость быстрого тестирования эффективности противовирусных препаратов и вакцин против ЗИКВ. Именно на этом фоне мы разработали методы быстрого анализа титров ЗИКВ как на периферии, так и в ЦНС с использованием анализа фокус-образующих фокусов (FFA) с помощью анализа, формирующего фокусы ,IKV).
Малые модели животных важны для понимания прогрессирования заболевания и для ранней оценки вакцин, терапевтических препаратов и противовирусных препаратов. Мы создали небольшие модели животных для изучения арбовирусной болезни с помощью различных штаммов мыши для моделирования инфекции человека и защиты от вирусных патогенов8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Используя этот предыдущий опыт, мы начали изменять методы, используемые для оценки WNV и денге вирус, связанный флавивирус для оценки ЗИКВ титер в обоих периферических органов, а также ЦНС21,23, 24. Преимущества этих методов по сравнению с другими анализами: 1) что они сочетают в себе способность собирать как периферийные, так и cnS органов для анализа; 2) методы адаптируются для цитометрии потока, для измерения врожденных и адаптивных иммунных реакций, наряду с вирусными титерами на одном животном в том же органе; 3) техника сбора урожая адаптируется для гистологического анализа; 4) FFA зиКВ является быстрым методом высокой пропускной их возможности для анализа вирусного титра; и 5) эти методы могут быть применены для оценки вирусных титр в органах животных, инфицированных большинством патогенов25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры настоящего исследования соответствуют руководящим принципам, установленным Комитетом по уходу и использованию животных Университета Сент-Луиса. SLU полностью аккредитованАссоциацией Ассоциации по оценке и аккредитации Организации По уходу за животными International (AAALAC).
1. Изоляция органов
ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус не стабилен при комнатной температуре (RT), поэтому количество животных, собранных в одно время, необходимо тщательно спланировать, чтобы сохранить вирусные титры.
- Заразить мышей, используя выбранную дозу и маршрут, на основе фенотипа требуется. Для этого протокола, заразить 8-10 недель мужчины и женщины типа I интерферона рецепторов недостаточно (Ifnar1-/-) C57BL/6 мышей.
- Анестезия Ifnar1-/- мышей с коктейлем кетамина (90 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Тест педали рефлекс твердого ног щепотку для подтверждения анестезии. Администрирование 1 х 105 фокусобразующих единиц (FFU) ИЗЗИВ в 50 qL подкожно (SC) через подножку.
- Подготовьте все материалы, необходимые для сбора урожая накануне: 2 ножница, щипцы и 20 мл 70% этанола (EtOH) в 50 мл конического для дезинфекции инструментов.
- Приготовьте шприцы и иглы: шприц 20 мл для перфузии, 23 G иглы (примерно 1 на клетку) и 1 мл шприца с 25 G иглы (1 на 3-5 мыши). Перед взвешиванием труб, добавить стальные бусы (в капоте) до 1,5 мл O-кольцо винт крышки труб (по одному для каждого органа). Трубки должны быть подходящими для гомогенизации.
- Подготовьте день сбора урожая материалы, необходимые для перфузии и замораживания органов.
- Заполните ведро со льдом с сухим льдом и 70% EtOH, чтобы сделать ледяную ванну. Подготовьте стерильный фосфат буферного соления (PBS), предполагая, что 25-30 мл на мышь PBS для каждой перфузии требуется 5-10 мл для спинного мозга). Получить анестезию, коктейль из кетамина и ксилазина, и принять 300 л на мышь. Поместите все материалы и любые дополнительные трубки, необходимые для цитометрии потока и т.д., во вторичном контейнере для транспортировки на животное объекта.
- Соблюдайте все необходимые процедуры для въезда, включая надевание и доффинг личного оборудования защиты во время входа и выхода на животное объекта.
ПРЕДЕКТО: Все процедуры должны проводиться в сертифицированном шкафу биобезопасности в лаборатории 2-го уровня биобезопасности (BSL-2). - Администрирование анестезии, 200-500 Л, интраперитоневически в зависимости от размера и веса животного. При работе в одиночку, ввести анестезию на одно животное в то время, чтобы избежать убийства животных до сбора органов.
- Подтвердите дозу анестезии, щипать ног щипцы с щипцы для оценки педали рефлекс. Не продолжайте, если полностью не отвечает. Используйте булавки для защиты мыши к восковой доске. На данный момент, облить мышь в 70% этанола, чтобы избежать загрязнения волос в процедуре сбора органов
- Неизлечимо кровоточит на пункцию сердца.
- Используя ножницы и щипцы, откройте животное через грудную полость, чтобы разоблачить сердце. Сбор крови через прокол сердца (800 евро), это может быть использовано для нескольких анализов, включая клиническую химию, гематологию, цитометрию потока для обнаружения специфических реакций антигена, и в реальном времени количественные ПЦР (qRT-PCR) для анализа вирусного номера копии.
- Для вирусного анализа РНК qRT-PCR, собирать кровь в трубке EDTA при извлечении из цельной крови или в микроцентрифуговой трубке при извлечении из сыворотки. (Для сыворотки, спин трубки на максимальной скорости в центрифуге, комнатной температуре, в течение 20 минут и удалить сыворотку в отдельную трубку). Добавьте линейный полиакриламид в качестве носителя в образец сыворотки после окончания. РНК может быть проанализирована или сохранена при -80 градусов по Цельсию для дальнейшего процесса на более поздний срок.
- Заполните 20 мл шприц с PBS, при комнатной температуре (или 37 градусов по Цельсию), и наполнить мышей, вставив иглу бабочки в левый желудочек. Проколите правое предсердие, чтобы кровь и PBS вышли. Медленно управлять PBS при проверке цвета печени, чтобы подтвердить, что животное полностью проникнуты. Печень должна меняться от темно-красного до розового лосося цвета.
- При подготовке органов к гистологии, оставьте бабочку иглу на месте, а затем пронизать 20 мл льда холодно 4% параформальдегида. Если это так, то удобно иметь шприц подключен к 3-путь стоп-кокс с обоими шприцы прилагается к нему, превращая клапан ON и OFF, как один чередует между PBS и PFA.
- Урожай органов в помечены, взвешенные трубки. Для периферических органов следуйте установленному порядку сбора урожая: печень, селезенка, почки и легкие.
- Возьмите только одну долбу из печени; не имеет значения, какой из них, но для всех экспериментов всегда старайтесь взять одну и ту же кому с одинаковым размером. Аналогичным образом, для почек и легких, принимать те же почки и легкие. Если цитометрия потока также должна быть завершена, любой орган может быть разрезан пополам. Храните половину, которая будет использоваться для цитометрии в Розуэлл Парк Мемориальный институт среднего (RPMI) при комнатной температуре, пока урожай не будет завершен.
- Сразу после сбора урожая положите каждый орган в маркированную трубку и поместите в сухую ледяную ванну. Вирус титр уменьшает с течением времени при комнатной температуре, так что количество времени, необходимое для сбора органов является чрезвычайно важным. Между мышами должна быть согласованность, поэтому после безопасности следующим приоритетом является скорость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если сбор органов для вирусных титра, это очень полезно иметь второй индивидуальный урожай мозга в этой точке, чтобы сохранить вирусные титры.
- Удалите оставшиеся органы из полости тела мыши, чтобы получить доступ к позвоночнику и черепу.
- Снимите мышь с доски и снимите шкуру, после чего снимите руки и ноги.
Удалите голову мыши с обезглавливание, тупые или хирургические ножницы для сбора мозга, разрезая череп зубчатыми ножницами LaGrange через foramen magnum. Затем снимите череп с щипками и вычерпывайте мозг шпателем. - Используя сильные, притупленные ножницы, удалите ребра и другие кости, окружающие позвоночник. Затем, нарезать тазовой кости, подвергая позвоночных foramen на поясничном уровне. Небольшой кончик спинного мозга должен быть виден в этой точке.
- Используйте 10 мл шприц заполнены PBS и 18 G иглы, чтобы изгнать спинного мозга, "промывка" шнур от поясничного отдела до шейного отдела позвоночника над чашкой Петри.
- Осторожно, поместите слеженный кончик иглы внутри позвоночных foramen, избегая чрезмерного давления, чтобы предотвратить иглу вторгаясь в тело позвонка. Держите сильно оказывать давление на тело позвонка и иглы и нажмите шприц поршень, чтобы изгнать шнур. Немедленно перенесите спинной мозг в маркированную трубку и поместите в сухую ледяную ванну.
- Снимите мышь с доски и снимите шкуру, после чего снимите руки и ноги.
- Повторите процедуру со всеми животными до завершения сбора урожая. Поместите инструменты для сбора урожая в 70% этанола между животными. Сосредоточьтесь на согласованности и скорости. Продолжительность между каждым органом урожая должна оставаться последовательной, с тем чтобы не смещение вирусных результатов титра.
- После завершения, дезинфицировать биобезопасности шкаф и все материалы до удаления его из животного объекта.
- Удалите каждую трубку из ледяной ванны и взвесьте трубки, чтобы определить вес органов. Чтобы определить вес органов, вычесть вес пустой трубки из веса органа, содержащего трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент органы могут быть заморожены при -80 градусов по Цельсию для дальнейшего процесса на более поздний срок или органы могут быть однородны непосредственно перед замораживанием отдельных aliquots. Замораживание оттаивания образцов несколько раз уменьшает вирусный титр. Поэтому важно сделать ту же процедуру для всех экспериментов в рамках одного проекта.
2. Гомогенизация органов
- Подготовьте 3 помеченных, 1,5 мл оснастки крышкой трубки для каждого органа, чтобы быть однородным.
- Если образцы не гомогенизированы сразу после сбора урожая, удалите трубки от -80 градусов по Цельсию. Образцы не нужно размораживать, чтобы гомогензировать.
- Положите образцы на лед, чтобы держать их холодными, чтобы свести к минимуму потерю вирусного титра. Затем добавьте 1 мл холодного DMEM, содержащего 5% FBS к каждому органу, содержащему трубку.
- Сразу же бить трубки в бисере загонщик в соответствии с инструкциями производителя. Гомогенизировать все органы со стальными бусинами в бисеро-гомогенизатор инструмент. Проверьте, чтобы убедиться, что каждый орган был полностью однороден.
- Спин вниз орган мусора в микрофуге на 12000 х г в течение 5 минут в микрофуге, которая была охлаждена до 8 градусов по Цельсию. Затем верните трубки в ведро со льдом. В шкафу биобезопасности, aliquot образцов в трубки для необходимых анализов. Затем верните трубки в ведро со льдом.
- Для фокус-формирования асссе, aliquot 500 Зл в помечены трубки. Затем поместите трубки в стойку на ведро со льдом. Aliquot 50 qL в трубку для РНК для флуорогенных количественных RT-PCR (qRT-PCR) для измерения вирусного числа копий генома.
- Изолировать общую РНК из органов инфицированных животных с помощью коммерческого комплекта изоляции РНК. Определить флавивирусвирусной вирусной РНК с помощью грунтового зонда наборы конкретных для ЗИКВ, который признает уникальные последовательности в каждом геноме флавивируса. Определите вирусный номер копии с помощью плазмида контроля копирования, содержащего определенную положительную одноцепочечную РНК, генерируемую в пробирке с использованием полимеразы T7, содержащей целевые последовательности ЗИКВ.
- Aliquot оставшийся образец, который составляет примерно 300 qL, в третью трубку и хранить при -80 градусов по Цельсию, если это необходимо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы ранее не были заморожены, заморозьте при -80 градусов по Цельсию. Если образцы были ранее заморожены, продолжайте на фокус формирования асссы и / или РНК изоляции перед остановкой.
3. Вирус Зика Фокус Формирование Ассаи26
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы включить отсутствие контроля над вирусом и положительный контроль. Положительный контроль представляет собой серию разбавления вирусных запасов с известной концентрацией. Не все элементы управления должны быть на одной пластине, но, как самосазможет становится больше, чем 5 пластин, больше элементов должно быть добавлено, и распространяется между пластинами. Позаботьтесь, чтобы не поцарапать монослой либо с трубчатыми кончиками или энергичной стирки. Несколько органов могут быть тизерсированы в один и тот же день или в разные дни. Но индивидуальный орган не должен быть titered в течение нескольких дней, потому что различные условия ассеев может повлиять на вирусный титр. Настоятельно рекомендуется запустить отдельный орган в один день.
- До дня ассоса, подготовить клетки и реагенты, необходимые для фокусформирования асссе.
- Подготовьте средства роста, содержащие 500 мл DMEM с 5 мл HEPES и 25 мл FBS. Иметь Vero-Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) клетки растет в среде роста на 37 КС, 5% CO2 до начала ассе. Клетки Веро не должны быть высоким проходом или когда-либо выросли более 100% выпуклость до начала асссе.
- Приготовьте 500 мл раствора метилцеллюлозы 2%, автоматизируя 1 л стеклянной бутылки для мультимедиа с 10 г метилцеллюлозы и большой баром для перемешивания и отдельной стеклянной бутылкой для мультимедиа 1 л с 500 мл H2O. Если автоклавная вода охлаждается разогреть в микроволновой печи, пока бутылка не нагревается на ощупь, но не кипит.
- Аккуратно налейте теплую/горячую воду в бутылку метилцеллюлозы, находясь в капюшоне культуры тканей. Частично крышка бутылки и перемешать на плите до метилцеллюлозы в растворе (1-4 ч). Aliquot 2% раствор метилцеллюлозы в стерильную коническую трубку 50 мл. 2% метилцеллюлозы могут храниться при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока это необходимо.
- Подготовьте 5% раствор параформальдегида в PBS для фиксации пластин и хранится при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока это необходимо. Подготовьте 1x фокус формирования ассса мыть буфер, добавив 0,05% Triton X-100 к PBS и хранится в RT. Подготовьте 1x FFA окрашивания буфера, добавив 1 мг / мл сапонина в PBS и хранится при 4 кК КС до тех пор, пока это необходимо. Они могут быть подготовлены за одну-две недели вперед.
- Рассчитайте количество плоских нижних 96 хорошо пластин, необходимых для assay так, что каждый орган покрывается в тройной. Включите достаточное количество дополнительных скважин для позитивного и отрицательного контроля.
- Вырастите вверх достаточно клетки Vero в средстве роста для того чтобы завершить асссес конструированный. Трипсинизуйте клетки Веро и подсчитайте их повторной приостановки их на 1,5 х 105 клеток на мл в среде роста. Плита Vero клеток в 96 хорошо плоские нижние пластины на 3,0 х 104 Веро-ВОЗ клетки / хорошо в среде роста, добавив 200 л на хорошо.
- Инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию при 5% CO2 ночь, убедитесь, что пластины уровня в инкубаторе, чтобы клетки равномерно распределены в колодец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая лаборатория выращивает клетки Веро немного по-разному; целью является 90-95% слияние монослой в каждой скважине в день проведения асссея на вирус Зика.
- Разбавить образцы вируса Зика в день асссея. Если образцы органов были ранее однородны, удалите образцы из морозильной камеры -80 градусов и дайте им разморозиться перед тем, как поместить образцы на лед для проверки.
- На льду, подготовить круглое дно 96 хорошо пластины, добавив 180 л холодного роста средств массовой информации к строкам B через H оставляя строку пустой. Добавьте 150 л каждого гомогенизированного образца органа, чтобы погреть А круглой нижней пластины.
- Подготовьте серийные 10-кратные разбавления каждого образца, используя многоканальный пипетка. Разбавить образцы в круглой нижней пластине 96 скважины, добавив 20 л образца в 180 л роста носителей, изменяя кончики пипетки между каждым разбавлением.
- Подготовьте плиту фокуса формируя путем извлекать носители от плоско-нижней части плиты 96 наилучшим образом покрывая клетки Vero. Сделайте это непосредственно перед добавлением образцов вируса, чтобы предотвратить высыхание монослой.
- Добавьте 100 л разбавления вируса к каждой скважине в пластине Веро. Добавьте образец, используя тот же набор подсказок, перейдя от самой низкой к самой высокой концентрации. Каменные пластины из стороны в сторону 2-4 раза будьте осторожны, чтобы не закружить.
- Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 на 1-2 ч. Убедитесь, что пластины находятся на одном уровне в инкубаторе. Во время инкубации разогрейте 2% метилцеллюлозы на RT.
- Разбавить 2% метилцеллюлозы раствор в среде роста. Разбавление должно быть в соотношении примерно 2:1 2% метилцеллюлозы к росту средств массовой информации. Держите в комнате темп, пока не пришло время, чтобы использовать его. Добавьте 1-2 капли/хорошо (установите трубу до 125 л) метилцеллюлозы: средства роста к каждой скважине из 96 хорошо пластины.
- Инкубировать 32-40 ч при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. Поскольку все клетки Веро растут немного по-разному, и факторы, включая клеточную сложение и штамм вируса Зика, могут изменить время инкубации.
- Зафиксировать клетки Веро, используя подготовленный 5% раствор параформальдегида.
- Добавьте 50 кл. 5% параформальдегида к каждому хорошо поверх слоя метилцеллюлозы в шкафу биобезопасности. Инкубировать в течение 60 минут на RT. Фиксация может пойти на ночь при 4 градусах По Цельсию, но покрыть пластину парафильмом, чтобы уменьшить испарение.
- Свалка наложения и средств массовой информации от клеток в контейнер для удаления внутри шкафа биобезопасности. Вымойте осторожно с PBS, 150 л/хорошо. Снимите PBS с пластин и снимите пластину с BSL-2.
- Повторите PBS мыть 2x добавив 150 Лл / хорошо. Затем удалите PBS. Добавьте 150 л/хорошо 1x буфер промывки FFA и дайте сидеть в течение 5-10 минут на RT, чтобы проницать фиксированные клетки.
- Обнаружить инфекцию с помощью первичных антител Зика. Подготовьте первичное антитело 4G2 (D1-4G2-4-15) в концентрации 1 мг/мл в буфере окрашивания FFA. Приготовьте достаточно ели для всего асссея.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держитесь подальше от лабораторных подгузников или других высоко-ворсасованный абсорбциентный материал, как волокна негативно повлияет на визуализацию очагов.- Удалите буфер промыть FFA с пластин. Добавьте 50 л/хорошо первичных антител в буфере окрашивания FFA. Печать пластин с parafilm и инкубировать на ночь при 4 градусах по Цельсию на качалке платформы. Ассес можно сделать с инкубации для 2 ч на RT.
- Визуализируйте инфекцию путем добавления вторичного спряженого антитела HRP. Подготовьте вторичное анти-мышь Козы HRP-маркированные антитела на концентрации 1:5,000 в буфере окрашивания FFA. Приготовьте достаточно ели для всего асссея.
- Вымойте клетки 3x с буфером промыть FFA, удалив буфер стирки, щелкнув в раковину каждый раз. Пятно клеток со вторичными антителами в БУФЕРе окрашивания FFA на 50 Л/хорошо. Инкубировать 1-2 ч на RT.
- Вымойте клетки 3x с буфером промыть FFA, удалив буфер стирки, щелкнув в раковину каждый раз. Добавьте 50 л/колодец субстрата Trueblue.
- Внимательно следите за пластинами, ожидая 2-15 мин, пока пятна не будут полностью определены и минимальный фон. После того, как пятна видны, мыть осторожно с водой, используя руку, чтобы оградить монослой от силы воды работает. Нажмите сухой на бумажные полотенца (НЕ DIAPERS) и изображение как можно скорее.
- Пятна можно пересчитать вручную или с помощью автоматизированного счетчика точек. При подсчете вручную, расчленение сферы может быть использовано для оказания помощи в визуализации.
- Для каждого образца выберите разбавление с легко отличительной точки зрения (например, от 20 до 200 на скважину) и вычислите титр в фокус-образующих единицах на мл (FFU/ml), используя среднее значение дубликатов скважин: FFU/mL (средний foci/well) и (фактор разбавления) (mL inoculum).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для оценки титеров ЗИКВ с помощью протокола, описанного выше Ifnar1-/- мыши были инфицированы ЗИКВ (PRVABC59) с помощью подкожной (SC) инъекции в подножку. Здесь, администрация 1 х 105 FFU из ЗИКВ до 8-12 недель Ifnar1-/- мышей SC не является смертельным, но вирус может реплицироваться как на периферии и ЦНС. Эта доза и маршрут используются для изучения иммунных реакций принимающего патогена и патогенности. Администрация 1 х 105 FFU ИЗКВ на 8-12 недель Ifnar1 -/- инъекция мыши внутривенно (IV) составляет от 80 до 100% смертельной, с животным поддаваясь инфекции между 8 до 14 дней после инъекции вируса. Мы регулярно используем этот административный маршрут для определения эффективности противовирусных и терапевтических препаратов, а также доклинического тестирования кандидатов на вакцину.
Четыре 10-12 недель ifnar1-/- мышей были инфицированы 1 х 105 FFU из ЗИКВ SC и селезенки, печени, почек, спинного мозга и мозгов были собраны четыре дня после инфекции методами, описанными выше (Рисунок 1). Количество ЗИКВ в тканях было прослежено путем фокус-формирования асссе (FFA) с использованием клеток Vero в формате 96 скважин, как описано выше. Использование FFA, вирусная нагрузка тканей выражается как фокус-образующих единиц (FFU) на г ткани. Подобно тому, что наблюдалось в предыдущем исследовании инфекции ЗИКВ Ifnar1-/- 26, мы видели виремию после выборки вирусных титра в различных органах четыре дня после инфекции ЗИКВ. Эти результаты показывают, что методы, используемые для сбора органов и хихикать по фокус-формирования анализ может быть использован для обнаружения титер в обоих периферических органов и ЦНС в одном животном. Интересно, что мы не ожидали увидеть высокие вирусные титры в обеих периферии и ЦНС четыре дня после инфекции в Ifnar1-/- мышей, потому что все Ifnar1-/- выжить qiKV инфекции с этой дозой и маршрута. Мы продолжаем изучать это наблюдение, чтобы понять, как ЗИКВ может продолжать размножаться в ЦНС Ifnar1-/- не вызывая летальности.
При выполнении фокус формирования асссы (FFA), Есть несколько технических ошибок следователь может сделать, что приведет к неоптимальным результатам FFA. Наиболее распространенными ошибками являются: 1) токсичность органов; 2) энергичный пипетка; 3) загрязнение волокна; и 4) неправильное плотность клеточного покрытия. Мы обсуждаем каждый из этих вопросов ниже и иллюстрируем результаты на рисунке 2. Один из наиболее распространенных вопросов, что происходит как с FFA и доска асссы является токсичность органов(Рисунок 2A красная стрелка). Мы считаем, что токсичность органов обусловлена высокой концентрацией внутриклеточных компонентов, выделяемых при гомогенизации органов. Токсичность органов варьируется в зависимости от органа и наблюдается в органах, собранных из неинфицированных животных, с печенью является наиболее токсичным и селезенки мере. Токсичность уменьшается, так как орган последовательно разбавляется на пластине FFA. Однако токсичность изменяет чувствительность ассеа, что приводит к изменению предела обнаружения. Как показано на рисунке 2A, если вирусный титр в органе ниже токсичности FFA не сможет точно записать вирусные титры. Рисунок 2B иллюстрирует токсичность в скважинах a1-4, но вирусный титр достаточно высок, чтобы преодолеть токсичность органов, как видно в скважинах b3 и b4. Чтобы преодолеть это ограничение в FFA, мы также выполняем количественные ПЦР в реальном времени на образцах титра органов. На рисунке 2Cмы иллюстрируем несколько распространенных технических ошибок. Энергичные пипетки или стирки могут удалить монослой(рисунок 2C, Я), если это происходит в скважинах с очагами, что данные будут потеряны, что приведет к неточной отчетности о результатах титра. Волокна или волосы, которые присутствуют в лаборатории скамейке абсорбационная бумага может загрязнять отдельные скважины(рисунок 2C, $) это может привести к значительным ошибкам при использовании автоматизированной программы подсчета. Хотя большинство автоматизированных программ подсчета имеют варианты исключения волокон, мы не нашли его высокоэффективным при исключении волокон из анализа. Решение этой проблемы заключается в том, чтобы вручную подсчитать скважины, которые могут быть очень трудоемкими и не практичными для анализа больших анализов. Плотность клеток является еще одной проблемой, которая может значительно повлиять на успех фокус формирования анализ (рисунок 2D). Если клетки не находятся в нужной плотности в начале асссе, количество и размер пятен будут затронуты. Как показано на рисунке 2D, столбцы 1-3, клетки примерно на 60% confluency в начале асссе по сравнению с клетками, покрытыми на 90% столбцов 4-6. Чтобы преодолеть это препятствие небольшие пилотные анализы должны быть запущены для оптимизации плотности клеток и времени фиксации, как отдельные лабораторные условия будут влиять на успех для проверки.
Для исследований, когда сравниваются различные группы инфицированных животных, статистический анализ, который проводится, зависит от распределения данных. Для оценки статистической значимости используются параметрические или непараметрические тесты. Для параметрических тестов ANOVA используется для определения общего эффекта, а отдельные группы лечения будут сравниваться с помощью теста Данна. В случае, если распределение данных не соответствует требованиям к параметрическому анализу, применяются непараметрические тесты. Тест Kruskal-Wallis используется для определения общего эффекта лечения, а тест Манн-Уитни U используется для проведения парных сравнений. Для результатов, присутствующих здесь, мы не сравнивали животных со вторым набором данных, собранным в этот момент времени, поэтому мы не проводили статистический анализ на приведенном наборе данных.
Рисунок 1: Вирусная репликация на периферии и ЦНС. Вирусная нагрузка в периферических и cnS тканях после IFNAR1-/- мышам дают 1x105 FFU СК ЗИКВ. На 4 день (n no 4 в группу) послеинфекции органов были собраны, оснастки замороженные, взвешенные, и однородные. Уровни вируса были количественно с помощью фокус-формирования асссе. Предел обнаружения 100-500 FFU/gram на основе органа. Данные отображаются как блок фокусообразующего регистра журнала10 на грамм ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Общие трудности с фокус-образующих асссе. Для всех фокус формирования анализы показали вирусный антиген был обнаружен с антифлавивирусом MAb, а затем иммунопероксидаза окрашивания (фиолетовый). (A) Vero клетки были выращены до 90% стопроцентного и инфицированы 10-кратным серийным разбавлением супернатанта из печени, собранной из 8-недельной мыши C57BL/6, IV заражены 5 х 107 FFU ЗИКВ 4 дня назад. Красная стрелка указывает на самую высокую или «опрятную» концентрацию супернатанта печени, демонстрирующую токсичность в этой концентрации. (B) Веро клетки были выращены до 90% стопроцентного и инфицированы 10 раз раз разбавления супернатанта из инфицированных клеток почек ЗИКВ. В этом случае образцы в столбце 1 и 2 взяты из мыши C57BL/6 и col 3 и 4 взяты из Ifnar1-/-. Обе мыши были 8 недель инфицированных 1 х 105 FFU из ЗИКВ IV и пожертвовал 4 дней после инфекции. Подобно (A) есть некоторые токсичности видели в самой высокой концентрации (ряд а), но вирусные титра наблюдается в колонке 3 и 4 преодолеть предел обнаружения вопросов, позволяющих для точных титрах быть обнаружены. (C) Веро клетки были покрыты. Выбранные скважины свидетельствуют о распространенных технических ошибках. В зоне, где монослой был удален из-за энергичного трубации. $ помещается над колодцем, где можно увидеть волокно. (D) Концентрация клетки Vero влияет на чувствительность асссе. В этой пластине клетки Веро были покрыты 1,0 х 104 клетки / хорошо в колонке 1-3 и 3,0 х 104 Клетки Веро-ВОЗ / хорошо в колонке 4-6. Затем пластина была заражена 10-кратными разбавлениями запаса ЗИКВ PRVABC59. Самые высокие образцы вирусной концентрации находятся в ряду А и разбавлены вниз, при этом каждый ряд представляет 10-кратное разбавление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Инфекция ЗИКВ может вызвать неврологическое заболевание, поэтому нынешние модели животных для изучения патогенеза, иммунных реакций и защитной эффективности вакцин и противовирусных препаратов должны сосредоточиться на вирусном контроле в рамках ЦНС. Одна из проблем в фокусировке на болезни ЦНС является то, что он часто происходит за счет изучения периферической инфекции. Предложенные здесь методы изоляции органов сосредоточены на необходимости быстрой оценки инфекции ЗИКВ как на периферии, так и в ЦНС для оценки связанных с ЦНС связанных с ЗИКВ заболеваний и создания модели доклинического тестирования противовирусных, терапевтических и Вакцины. Дополнительным преимуществом этого метода является то, что он также обеспечивает высокую степень гибкости, в том числе комбинированное изучение иммунологических реакций на ЗИКВ или гистологический анализ инфекции. Этот метод, не ограничивается только ЗИКВ, но также может быть универсально применен для изучения целого ряда принимающих патогенных взаимодействий, в том числе флавивирусов, таких как вирус Денге21, ортопоксвирусы, как оспа обезьян и эктромелии. Соображения и недостатки этого метода сбора урожая сосредоточены главным образом на возможностях экспериментатора. Поскольку ЗИКВ не является стабильным в течение длительных периодов времени при комнатной температуре, количество времени, необходимое для сбора органов после перфузии, может существенно повлиять на качество результатов. Для большинства экспериментов, которые мы провели, мы сравниваем вирусные титры от мышей, обработанных с двумя условиями, поэтому мы фокусируем наши усилия на согласованности времени между сбором органов не на скорости. Таким образом, один и тот же человек выполняет ту же процедуру для всего эксперимента для поддержания согласованности. Другим важным фактором с этой процедурой является безопасность, мы с готовностью выполнили эти методы с BSL-2 (вирус Зика, денге) и BSL-3 (WNV, вирус Чикунгунья) патогенов. Очень важно выполнять все процедуры в чистом, ухоженном, сертифицированном шкафе биобезопасности с дезинфицирующим средством.
FFA параллели доска анализ, за исключением того, что он использует пероксидазы иммуно-сточки для выявления очагов инфицированных клеток, а не бляшки. Моя лаборатория, а также несколько других лабораторий в настоящее время успешно перешли на использование FFAs для всех наших экспериментов хихик11,14,15,17,26,27 ,28. FFA имеет несколько преимуществ по сравнению с традиционным исспугом: а) FFA быстрее, требуя более короткой инкубации по сравнению с налетом, б) это также более высокая пропускная часть, выполняемая в 96-колодцах пластин. Формат пластины 96 скважин может также вместить меньшие объемы исходного материала. Кроме того, в) FFA совместима с использованием автоматизированной шайбы пластины и автоматизированной счетчик месте, значительно сокращая труд и время, необходимое для проведения асссе. FFA имеет больше шагов после заражения, но г) с использованием многоканальных pipets, или даже трубач робота, сроки для большинства шагов по оценке после фиксации являются гибкими и контроль может быть приостановлено на ночь или дольше. Наконец, e) это может быть особенно полезно для штаммов вируса, которые не образуют четкие бляшки, такие как вирус Денге. Одним из недостатков FFA является то, что он требует конкретных антител для обнаружения инфицированных вирусом клеток, которые могут быть запутанными при рассмотрении различных штаммов вируса или мутантных вирусов. Для FFA как с налетом асссес плотность монослой клетки во время инфекции критически для успеха асссе. Клетки должны быть использованы при более высоком слиянии для FFA по сравнению с налетом асссее, из-за укороченной продолжительности времени до фиксации. Поскольку FFA имеет более высокую пропускную силу, более экономически эффективным и быстрее, чем традиционный анализ налета, это позволяет моей лаборатории быстро анализировать данные для изучения новых инфекционных заболеваний. FFA является более кумулятивно более экономически эффективным по нескольким причинам. Хотя антитела дороже, чем нейтральный красный или кристаллофиолетовый, мы можем анализировать больше образцов на пластину, которая устраняет разницу в стоимости. С точки зрения распределения рабочей силы автоматизированный подсчет точек и простой ввод данных для анализа ограничивает затраты на рабочую силу и возможность иметь долгосрочный имидж в качестве записи трудно количественно. Будущее этого ассеа может заключаться в переходе к флуоресцентной основе очагов для считывателя, в отличие от HRP. Количественная интенсивность флуоресцентных наряду с точечное число будет расширять полезность FFA за то, что в настоящее время изучается.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать
Acknowledgments
Д-р Пинто финансируется за счет семенного гранта от Университета Сент-Луиса школы медицины и запуска средств из Университета Сент-Луиса школы медицины. Д-р Бриен финансируется K22AI104794 раннего следователя награду от NIH NIAID, а также семян грант от школы Университета Сент-Луиса. Для всех финансируемых лиц спонсоры не имели никакой роли в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18 G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1 cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37 °C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96 well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5 mL eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| Curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose With 4,500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5 mL EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| O-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| One step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| Spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| Straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
References
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
- McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
- Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
- Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
- Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
- Brien, J. D. Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , Oregon Health & Science University. (2007).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
- Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
- Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
- Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
- Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
- Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
- Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
- Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
- Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
- Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
- Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).
