Summary
El objetivo del protocolo es demostrar las técnicas utilizadas para investigar la enfermedad viral aislándose y cuantificando el virus del Zika, a partir de múltiples órganos en un ratón después de la infección.
Abstract
Los métodos que se presentan demuestran procedimientos de laboratorio para el aislamiento de órganos de animales infectados por el virus del Zika y la cuantificación de la carga viral. El objetivo del procedimiento es cuantificar los lanzadores virales en áreas periféricas y del SNC del ratón en diferentes momentos posteriores a la infección o en diferentes condiciones experimentales para identificar factores virológicos e inmunológicos que regulan la infección por el virus del Zika. Los procedimientos de aislamiento de órganos demostrados permiten tanto la cuantificación del ensayo de formación de enfoque como la evaluación cuantitativa de la PCR de los lanzadores virales. Las técnicas de aislamiento rápido de órganos están diseñadas para la preservación del morte del virus. La cuantificación de los titer virales mediante el ensayo de formación de enfoque permite la evaluación rápida del rendimiento del virus del Zika. El beneficio del ensayo de formación de enfoque es la evaluación del virus infeccioso, la limitación de este ensayo es el potencial de toxicidad de órganos que reduce el límite de detección. La evaluación del titor viral se combina con un PCR cuantitativo, y el uso de un número de copia del genoma viral de control de ARN recombinante dentro del órgano se evalúa con un límite bajo de detección. En general, estas técnicas proporcionan un método preciso de alto rendimiento rápido para el análisis de los lanzadores virales del Zika en la periferia y el SNC de los animales infectados por el virus del Zika y se pueden aplicar a la evaluación de los tituladores virales en los órganos de los animales infectados con la mayoría de los animales infectados con la mayoría patógenos, incluido el virus del dengue.
Introduction
El virus del Zika (ZIKV) es un arbovirus que pertenece a la familia flaviviridae, que incluye importantes patógenos humanos neuroinvasivos como el virus powassan (POWV), el virus de la encefalitis japonesa (VJE) y el virus del Nilo Occidental (WNV)1. Tras su aislamiento e identificación, se han notificado periódicamentelas infecciones humanas por el ZIKV en Africa y Asia 2,3,4,5, y epidemias en América Central y del Sur (revisado sin referencia6). Sin embargo, no fue hasta hace pocoque se pensaba que ZIKV causaba una enfermedad grave 7. Ahora hay miles de casos de enfermedades neurológicas y defectos congénitos relacionados con infecciones por ZIKV. La rápida aparición de ZIKV ha suscitado muchas preguntas relacionadas con: por qué hay un aumento en la gravedad de la enfermedad, cuál es la respuesta inmunológica a la infección por ZIKV y existen patologías virales y/o inmunes mediadas relacionadas con el aumento de la neurología manifestaciones y defectos congénitos. Ahora existe la prisa por entender la enfermedad relacionada con el sistema nervioso central (SNC) asociada con el ZIKV, así como la necesidad de probar rápidamente la eficacia de los antivirales y vacunas contra el ZIKV. Es en este contexto que hemos desarrollado métodos para el análisis rápido de los titulas ZIKV tanto en la periferia como en el SNC utilizando un enfoque específico de ZIKV (FFA).
Los modelos animales pequeños son importantes para comprender la progresión de la enfermedad y para la evaluación temprana de vacunas, terapias y antivirales. Hemos establecido pequeños modelos animales para el estudio de la enfermedad de arbovirus mediante el uso de varias cepas de ratón para modelar la infección humana y la protección contra patógenos virales8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Utilizando esta experiencia previa, comenzamos a modificar las técnicas utilizadas para la evaluación del virus WNV y del dengue, un flavivirus relacionado para la evaluación del titer ZIKV tanto en órganos periféricos como en el SNC21,23, 24. Las ventajas de estos métodos sobre otros ensayos son: 1) que combinen la capacidad de cosechar órganos periféricos y del SNC para el análisis; 2) los métodos son adaptables para la citometría de flujo, para mediciones de respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, junto con tituladores virales en el mismo animal en el mismo órgano; 3) la técnica de cosecha es adaptable para el análisis histológico; 4) el ZIKV FFA es un método de alto rendimiento rápido para el análisis de titer viral; y 5) estos métodos pueden aplicarse a la evaluación de tituladores virales en los órganos de animales infectados con la mayoría de los patógenos25.
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Protocol
Todos los procedimientos del presente estudio se ajustan a las directrices establecidas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de St. Louis. SLU está totalmente acreditada por la Asociación de Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International (AAALAC).
1. Aislamiento de órganos
NOTA: El virus no es estable a temperatura ambiente (RT), por lo que el número de animales cosechados a la vez debe planificarse cuidadosamente para preservar los lanzadores virales.
- Infectar ratones utilizando la dosis y la ruta elegidas, en función del fenotipo requerido. Para este protocolo, infectar 8-10 semanas de edad macho y hembra tipo I interferón receptor deficiente (Ifnar1-/-) C57BL/6 ratones.
- Anestetizar ifnar1-/- ratones con un cóctel de ketamina (90 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). Pruebe el reflejo del pedal con un pellizco firme en el dedo del pecho para confirmar la anestesia. Administrar 1 x 105 unidades de formación de enfoque (FFU) de ZIKV en 50 s por vía subcutánea (SC) a través de la almohadilla.
- Preparar todos los materiales necesarios para la cosecha el día anterior: 2 tijeras, fórceps y 20 ml de etanol 70% (EtOH) en un cónica de 50 ml para la desinfección de herramientas.
- Preparar jeringas y agujas: una jeringa de 20 ml para perfusión, 23 G de agujas (aproximadamente 1 por jaula) y una jeringa de 1 ml con aguja de 25 G (1 por 3-5 ratón). Antes de pesar los tubos, agregue perlas de acero (en el capó) a los tubos de la tapa de tornillo de la coma de 1,5 ml (uno para cada órgano). Los tubos deben ser apropiados para la homogeneización.
- Preparar el día de la cosecha los materiales necesarios para la perfusión y la congelación de órganos.
- Llene un cubo de hielo con hielo seco y 70% EtOH para hacer un baño de hielo. Preparar solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) suponiendo que 25-30 mL por ratón de PBS para cada perfusión se necesita 5-10 mL para la médula espinal). Obtener anestesia, un cóctel de ketamina y Xylazine, y asumir 300 l por ratón. Coloque todos los materiales y cualquier tubo adicional necesario para la citometría de flujo, etc., en un contenedor secundario para transportarlos a las instalaciones de animales.
- Siga todos los procedimientos necesarios para la entrada, incluyendo el servicio de colocación y alimentación de equipos de protección personal durante la entrada y salida en las instalaciones de los animales.
PRECAUCION: Todos los procedimientos se llevarán a cabo en un gabinete de bioseguridad certificado dentro de una instalación de laboratorio de nivel 2 de bioseguridad (BSL-2). - Administrar anestesia, 200-500 l, intraperitonealmente dependiendo del tamaño y peso del animal. Si trabaja solo, administre anestesia a un animal a la vez para evitar matar a los animales antes de la cosecha de órganos.
- Confirme la dosis de anestesia pellizcando el dedo del dedo del día con fórceps para evaluar el reflejo del pedal. No continúe a menos que no responda por completo. Utilice pasadores para fijar el ratón a una tabla de cera. En este punto, douse el ratón en 70% etanol para evitar la contaminación del cabello en el procedimiento de extracción de órganos
- Sangrado terminal por punción cardíaca.
- Usando las tijeras y fórceps, abra al animal a través de la cavidad torácica para exponer el corazón. Recoger la sangre a través de la punción cardíaca (800 l), esto se puede utilizar para múltiples ensayos, incluyendo química clínica, hematología, citometría de flujo para detectar respuestas específicas de antígeno, y PCR cuantitativo en tiempo real (qRT-PCR) para el análisis del número de copia viral.
- Para el análisis de ARN viral por qRT-PCR, recoja la sangre en un tubo EDTA si se extrae de sangre entera o en un tubo de microcentrífuga si se extrae del suero. (Para suero, tubo de centrifugado a máxima velocidad en centrífuga, temperatura ambiente, durante 20 min y retire el suero a un tubo separado). Agregue una poliacrilamida lineal como portador a la muestra de suero después de terminar. El ARN se puede analizar o almacenar a -80 oC para seguir procesando en una fecha posterior.
- Llene la jeringa de 20 ml con PBS, a temperatura ambiente (o 37 oC), y perfumar ratones insertando la aguja de mariposa en el ventrículo izquierdo. Perfore la aurícula derecha para permitir la salida de sangre y PBS. Administrar lentamente el PBS mientras se comprueba el color del hígado para confirmar que el animal está completamente perfundido. El hígado debe cambiar de rojo intenso a color salmón rosa.
- Si prepara los órganos para la histología, deje la aguja de mariposa en su lugar y luego pertore con 20 ml de hielo frío 4% paraformaldehído. Si es así, es conveniente tener la jeringa conectada a un tapón de 3 vías con ambas jeringas conectadas a ella, encendiendo y apagando la válvula como alternativa entre PBS y PFA.
- Cosere los órganos en tubos etiquetados y pesados. Para los órganos periféricos, siga un orden establecido para la cosecha: hígado, bazo, riñón y pulmones.
- Tome sólo un lóbulo del hígado; no importa cuál, pero para todos los experimentos siempre tratan de tomar el mismo lóbulo con la misma pieza de tamaño. Del mismo modo, para los riñones y los pulmones, tome el mismo riñón y pulmón. Si también se debe completar la citometría de flujo, cualquier órgano se puede cortar por la mitad. Almacene la mitad que se utilizará para la citometría en el medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) a temperatura ambiente hasta que la cosecha esté completa.
- Inmediatamente después de la cosecha, coloque cada órgano en un tubo etiquetado y colóquelo en el baño de hielo seco. El ticter de virus se reduce con el tiempo a temperatura ambiente, por lo que la cantidad de tiempo que se tarda en cosechar órganos es extremadamente importante. Debe haber consistencia entre ratones, así que después de la seguridad, la siguiente prioridad es la velocidad.
NOTA: Si la cosecha de órganos para títulos virales, es muy útil tener un segundo individuo cosechar el cerebro en este punto, para preservar títulos virales.
- Retire los órganos restantes de la cavidad del cuerpo del ratón para acceder a la columna vertebral y al cráneo.
- Retire el ratón de la tabla y retire la pelta, seguido de la extracción de los brazos y las piernas.
Retire la cabeza del ratón con una tijera dedecapitación, contundente o quirúrgica para cosechar el cerebro cortando el cráneo con unatijera laGrange serrada a través del foramen magnum. Luego, despega el cráneo con fórceps y saca el cerebro con una espátula. - Usando tijeras fuertes y contundentes, retire las costillas y otros huesos que rodean la columna vertebral. Luego, corta el hueso pélvico, exponiendo el foramen vertebral a nivel lumbar. La pequeña punta de la médula espinal debe ser visible en este punto.
- Utilice una jeringa de 10 ml llena de PBS y una aguja de 18 G para expulsar la médula espinal "lavando" el cordón de la columna lumbar a la columna cervical sobre una placa Petri.
- Con cuidado, coloque la punta biselada de la aguja dentro del foramen vertebral, evitando una presión excesiva para evitar que la aguja invada el cuerpo vertebral. Sostenga fuertemente para ejercer presión sobre el cuerpo vertebral y la aguja y presione el émbolo de la jeringa para expulsar el cordón. Transfiera inmediatamente la médula espinal en el tubo etiquetado y colóquela en el baño de hielo seco.
- Retire el ratón de la tabla y retire la pelta, seguido de la extracción de los brazos y las piernas.
- Repita el procedimiento con todos los animales hasta que se complete la cosecha. Coloque las herramientas de cosecha en el 70% de etanol entre animales. Concéntrese en la consistencia y la velocidad. El tiempo entre cada cosecha de órganos debe permanecer constante para no sesgar los resultados virales del tareado.
- Cuando haya terminado, desinfecte el armario de bioseguridad y todo el material antes de retirarlo de las instalaciones para animales.
- Retire cada tubo del baño de hielo y pese los tubos para determinar el peso de los órganos. Para determinar el peso de los órganos, reste el peso del tubo vacío del peso del tubo que contiene el órgano.
NOTA: En este punto, los órganos se pueden congelar a -80 oC para seguir procesando en una fecha posterior o los órganos pueden homogeneizarse inmediatamente antes de congelar alícuotas individuales. Congelar muestras de descongelación varias veces disminuye el titer viral. Por lo tanto, es importante realizar el mismo procedimiento para todos los experimentos dentro de un solo proyecto.
2. Homogeneización de órganos
- Prepare 3 tubos de 1,5 ml etiquetados y con tapa rápida para cada órgano que se homogeneice.
- Si las muestras no se están homogeneiparando inmediatamente después de la cosecha, retire los tubos de -80 oC. No es necesario descongelar las muestras para homogeneizarlas.
- Ponga las muestras en hielo para mantenerlas frías para minimizar la pérdida viral del diezmo. A continuación, agregue 1 ml de DMEM frío que contenga 5% DE FBS a cada tubo que contenga órgano.
- Batir inmediatamente los tubos en el batidor de cuentas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Homogeneizar todos los órganos con cuentas de acero en un instrumento homogeneizador de cuentas. Compruebe que cada órgano se ha homogeneizado por completo.
- Esgire los restos de órganos en microfúctelos a 12.000 x g durante 5 minutos en un microfúgelo que se haya enfriado a 8 oC. A continuación, vuelva los tubos al cubo de hielo. En el gabinete de bioseguridad, la alícuota toma muestras en tubos para los ensayos necesarios. A continuación, vuelva los tubos al cubo de hielo.
- Para el ensayo de formación de enfoque, alícuota 500 l en un tubo etiquetado. A continuación, coloque los tubos en el estante en un cubo de hielo. Aliquot 50 l en un tubo de ARN para RT-PCR cuantitativo fluorogénico (qRT-PCR) para medir el número de copia del genoma viral.
- Aísle el ARN total de los órganos de los animales infectados utilizando un kit de aislamiento de ARN comercial. Determinar el ARN viral flavivirus utilizando los conjuntos de sondas de imprimación específicos para ZIKV, que reconoce secuencias únicas en cada genoma flavivirus. Determine el número de copia viral utilizando un plásmido de control de copia que contenga un ARN de una sola cadena positivo definido generado in vitro utilizando la polimerasa T7 que contenga las secuencias diana ziKV.
- Alícuota la muestra restante, que es de aproximadamente 300 ol, en el tercer tubo y almacenar a -80 oC si es necesario.
NOTA: Si las muestras no se congelaron previamente, congele a -80 oC. Si las muestras se habían congelado previamente, continúe con el ensayo de formación de enfoque y/o el aislamiento de ARN antes de detenerse.
3. Ensayo de formación de enfoque del virus del Zika26
NOTA: Es importante incluir un control sin virus y un control positivo. El control positivo es una serie de dilución de un stock de virus con una concentración conocida. No todos los controles deben estar en la misma placa, pero a medida que el ensayo se hace más grande que 5 placas, se deben agregar más controles y extenderse entre las placas. Tenga cuidado de no rayar la monocapa con las puntas de pipeta o mediante un lavado vigoroso. Múltiples órganos pueden ser mareados en el mismo día o en días diferentes. Pero un órgano individual no debe ser titered durante varios días porque diferentes condiciones de ensayo pueden afectar el título viral. Se recomienda encarecidamente ejecutar un órgano individual en un solo día.
- Antes del día del ensayo, prepare las células y los reactivos necesarios para el ensayo de formación de enfoque.
- Preparar medios de crecimiento que contengan 500 mL de DMEM con 5 mL de HEPES y 25 mL de FBS. Tener células de la Organización Mundial de la Salud (OMS) que crecen en medios de crecimiento a 37 oC, 5% co2 antes del inicio del ensayo. Las células de Vero no deben ser un pasaje alto o haber crecido más del 100% de confluencia antes del inicio del ensayo.
- Preparar 500 ml de una solución de metilcelulosa al 2% autoclavendo una botella de medios de vidrio de 1 L con 10 g de metilcelulosa y una barra de agitación grande y una botella de medio de vidrio separada de 1 L con 500 ml de H2O. Si el agua autoclave se ha enfriado, recalienta el microondas hasta que la botella esté caliente al tacto, pero no hirviendo.
- Vierta suavemente agua caliente/caliente en una botella de metilcelulosa mientras esté en la campana de cultivo de tejido. Cubra parcialmente el frasco y revuelva la placa caliente hasta que la metilcelulosa esté en solución (1-4 h). Alícuota la solución de metilcelulosa al 2% en tubo cónico estéril de 50 ml. 2% La metilcelulosa se puede almacenar a 4 oC hasta que sea necesario.
- Preparar una solución de Paraformaldehído al 5% en PBS para fijar las placas y almacenarlas a 4 oC hasta que sea necesario. Preparar un búfer de lavado de ensayo de conformado de enfoque 1x agregando 0.05% Triton X-100 a PBS y almacenado en RT. Preparar un tampón de tinción ffA 1x agregando 1 mg/ml de saponina a PBS y almacenado a 4 oC hasta que sea necesario. Estos se pueden preparar con una o dos semanas de antelación.
- Calcular el número de placas de 96 pozos de fondo plano necesarias para el ensayo de tal manera que cada órgano esté chapado en triplicado. Incluya suficientes pozos adicionales para los controles positivos y negativos.
- Crece suficientes células Vero en medios de crecimiento para completar el ensayo diseñado. Intente probar las células de Vero y contarlas resuspendingelas a 1.5 x 105 células por ml en medios de crecimiento. Células de Plate Vero en las 96 placas de fondo plano de pozo a 3.0 x 104 células Vero-OMS/bien en medios de crecimiento mediante la adición de 200 ol por pozo.
- Incubar placas a 37oC a 5% de CO2 durante la noche, asegúrese de que las placas estén niveladas en la incubadora para que las células se distribuyan equitativamente dentro del pozo.
NOTA: Cada laboratorio cultiva células Vero ligeramente diferente; el objetivo es una monocapa confluente del 90-95% en cada pocil el día del ensayo para el virus del Zika.
- Diluir las muestras del virus del Zika el día del ensayo. Si las muestras de órganos habían sido homogeneizadas previamente, retire las muestras del congelador de -80 oC y permita que se descongelen antes de colocar las muestras en hielo para el ensayo.
- Sobre hielo, prepare una placa de 96 pozos de fondo redondo añadiendo 180 ml de medios de crecimiento en frío a las filas B a H dejando la fila A vacía. Agregue 150 l de cada muestra de órgano homogeneizado a la fila A de la placa inferior redonda.
- Preparar diluciones seriales de 10 veces de cada muestra, utilizando una pipeta multicanal. Diluir las muestras en una placa de pozo de fondo redondo 96 añadiendo 20 ml de muestra en 180 ml de medios de crecimiento, cambiando las puntas de la pipeta entre cada dilución.
- Prepare la placa de formación de enfoque quitando el medio de la placa de 96 pocillos de fondo plano que cubre las células de Vero. Haga esto inmediatamente antes de agregar las muestras de virus para evitar que la monocapa se seque.
- Añadir 100 l de dilución del virus a cada pocal en la placa Vero. Agregue la muestra usando el mismo conjunto de puntas yendo de la concentración más baja a la más alta. Placas de roca de lado a lado 2-4 veces teniendo cuidado de no girar.
- Incubar a 37oC, 5% CO2 durante 1-2 h. Asegúrese de que las placas estén niveladas dentro de la incubadora. Durante la incubación se calienta un 2% de metilcelulosa a RT.
- Diluir 2% solución de metilcelulosa en medios de crecimiento. La dilución debe ser de aproximadamente 2:1 de 2:1 de metilcelulosa al crecimiento de los medios. Manténgalo a temperatura de la habitación hasta que sea el momento de usarlo. Añadir 1-2 gotas/bien (establecer la pipeta a 125 ol) de la metilcelulosa: medios de crecimiento a cada pocal de la placa de 96 pocillos.
- Incubar 32-40 h a 37oC, 5%CO2. A medida que las células Deo de todos crecen de manera ligeramente diferente y factores como la confluencia celular y la tensión del virus del Zika pueden cambiar el tiempo de incubación.
- Corrija las células de Vero utilizando la solución preparada de paraformaldehído al 5%.
- Añadir 50 sl de 5% de paraformaldehído a cada pozo sobre la parte superior de la capa de metilcelulosa en el gabinete de bioseguridad. Incubar durante 60 min a RT. La fijación puede pasar la noche a 4 oC, pero cubrir la placa con parafilm para reducir la evaporación.
- Vuelque la superposición y los medios de las células en un contenedor de eliminación dentro del gabinete de bioseguridad. Lavar suavemente con PBS, 150 l/bien. Retire el PBS de las placas y retire la placa del BSL-2.
- Repita el lavado PBS 2x añadiendo 150 l/bien. A continuación, quite el PBS. Agregue 150 l/bien 1x tampón de lavado FFA y deje sentarse durante 5-10 minutos en RT para permeabilizar las células fijas.
- Detectar la infección con anticuerpos primarios contra el zika. Preparar el anticuerpo primario 4G2 (D1-4G2-4-15) a una concentración de 1 mg/ml en tampón de tinción FFA. Preparar suficiente anticuerpo para todo el ensayo.
NOTA: Manténgase alejado de los pañales de laboratorio u otro material absorbente de alta pelusa, ya que las fibras afectarán negativamente la imagen de los focos.- Retire el tampón de lavado FFA de las placas. Añadir 50 l/bien del anticuerpo primario en el tampón de tinción FFA. Sellar las placas con parafilm e incubar durante la noche a 4oC en una plataforma de balanceo. El ensayo se puede hacer con una incubación durante 2 h a RT.
- Visualice la infección mediante la adición de un anticuerpo conjugado HRP secundario. Prepare el anticuerpo secundario con la etiqueta HRP de Cabra a una concentración de 1:5.000 en tampón de tinción FFA. Preparar suficiente anticuerpo para todo el ensayo.
- Lave las células 3 veces con el tampón de lavado FFA, eliminando el tampón de lavado entrando en el fregadero cada vez. Manchar las células con el anticuerpo secundario en el tampón de tinción FFA a 50 l/bien. Incubar 1-2 h en RT.
- Lave las células 3 veces con el tampón de lavado FFA, eliminando el tampón de lavado entrando en el fregadero cada vez. Añadir 50 l/bien del sustrato Trueblue.
- Observe las placas cuidadosamente, esperando 2-15 minutos hasta que las manchas estén completamente definidas y un fondo mínimo. Después de que las manchas sean visibles, lave suavemente con agua, usando una mano para proteger a la monocapa de la fuerza del agua que corre. Toque secar en toallas de papel (NO DIAPERS) e imagen tan pronto como sea posible.
- Las manchas se pueden contar manualmente o mediante un contador de puntos automatizado. Si se cuenta manualmente, se puede utilizar un ámbito de diseción para ayudar en la visualización.
- Para cada muestra, seleccione una dilución con focos fácilmente distinguidos (por ejemplo, 20 a 200 por pozo) y calcule el diezmo en unidades formadoras de enfoque por ml (FFU/ml), utilizando el promedio de pozos duplicados: FFU/ml (focos medios/pozos) (factor de dilución) (inóculo de ml).
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Representative Results
Para evaluar los lanzadores ziKV utilizando el protocolo descrito anteriormente Ifnar1-/- ratones se infectaron con ZIKV (PRVABC59) mediante inyección subcutánea (SC) en la almohadilla del pie. Aquí, la administración de 1 x 105 FFU de ZIKV a 8-12 semanas de edad Ifnar1-/- ratones SC no es letal, pero el virus puede replicarse tanto en la periferia como en el SNC. Esta dosis y ruta se utilizan para estudiar las respuestas inmunitarias de patógenos del huésped y la patogenicidad. La administración de 1 x 105 FFU de ZIKV a una inyección intravenosa de 8-12 semanas de edad Ifnar1 -/- ratón (IV) es entre 80 a 100% letal, con el animal sucumbiendo a la infección entre 8 a 14 días después de la inyección del virus. Utilizamos habitualmente esta vía de administración para determinar la eficacia de los antivirales y terapéuticos, así como las pruebas de candidatos a vacunas preclínicas.
Cuatro ratones Ifnar1-/- de 10-12 semanas de edad fueron infectados con 1 x 105 FFU de ZIKV SC y los bazos, hígados, riñones, médula espinal y cerebro fueron cosechados cuatro días después de la infección por los métodos detallados anteriormente (Figura 1). La cantidad de ZIKV en los tejidos fue ensayada por el ensayo de formación de enfoque (FFA) utilizando células Vero en un formato de 96 pozos como se describió anteriormente. Usando el FFA, la carga viral del tejido se expresa como unidades formadoras de enfoque (FFU) por g de tejido. Similar a lo observado en un estudio previo de la infección por ZIKV de Ifnar1-/- 26, vimos viremia después de un muestreo de titulas virales en diferentes órganos cuatro días después de la infección por ZIKV. Estos resultados indican que los métodos utilizados para la extracción de órganos y la formación de medidas mediante el ensayo de formación de enfoque se pueden utilizar para detectar el títer tanto en los órganos periféricos como en el SNC dentro del mismo animal. Curiosamente, no esperábamos ver altas tetas virales tanto en la periferia como en el SNC cuatro días después de la infección en los ratones Ifnar1-/- porque toda la infección de Ifnar1-/- sobrevive a la infección ZIKV con esta dosis y ruta. Continuamos explorando esta observación para entender cómo ZIKV puede seguir replicando en el SNC de Ifnar1-/- sin causar letalidad.
Al realizar el ensayo de formación de enfoque (FFA), hay múltiples errores técnicos que un investigador puede cometer que resultarán en resultados de FFA subóptimos. Los errores más comunes son: 1) toxicidad de órganos; 2) pipeteo vigoroso; 3) contaminación por fibra; y 4) densidad de chapado de celda incorrecta. A continuación analizamos cada una de estas cuestiones e ilustramos el resultado de la Figura2. Uno de los problemas más comunes que se produce con la FFA y el ensayo de placa es la toxicidad de los órganos (figura2A flecha roja). Creemos que la toxicidad de los órganos es impulsada por la alta concentración de componentes intracelulares liberados durante la homogeneización de órganos. La toxicidad de los órganos varía según el órgano y se ve en órganos extraídos de animales no infectados, siendo el hígado el más tóxico y el bazo el menor. La toxicidad se reduce a medida que el órgano se diluye en serie en la placa FFA. Sin embargo, la toxicidad altera la sensibilidad del ensayo, lo que resulta en un cambio en el límite de detección. Como se muestra en la Figura 2A si el titer viral en el órgano es menor que la toxicidad, la FFA no será capaz de registrar con precisión los lanzadores virales. La Figura 2B ilustra la toxicidad en los pozos a1-4, pero el titer viral es lo suficientemente alto como para superar la toxicidad de los órganos como se ve en los pozos b3 y b4. Para superar esta limitación en la FFA, también realizamos PCR cuantitativo en tiempo real en muestras de titer de órganos. En la Figura 2C,ilustramos varios errores técnicos comunes. El pipeteo o lavado vigoroso puede eliminar la monocapa (Figura2C, *), si esto ocurre en pozos con focos que los datos se perderán dando lugar a informes inexactos de los resultados del títer. Fibras o pelos, que están presentes en el papel absorbente de banco de laboratorio pueden contaminar pozos individuales (Figura2C,$) esto puede causar errores significativos si se utiliza un programa de conteo automatizado. Si bien la mayoría de los programas de recuento automatizado tienen opciones de exclusión de fibra, no hemos encontrado que sea altamente eficaz para excluir las fibras del análisis. La solución a esto es contar manualmente los pozos, que pueden llevar mucho tiempo y no es práctico para el análisis de grandes ensayos. La densidad celular es otro problema que puede afectar dramáticamente el éxito de un ensayo de formación de enfoque (Figura 2D). Si las celdas no están en la densidad correcta al inicio del ensayo, el número y el tamaño de las manchas se verán afectados. Como se muestra en la Figura 2D, columnas 1-3, las celdas con aproximadamente 60% de confluencia al inicio del ensayo en comparación con las celdas chapadas en las columnas de confluencia del 90% 4-6 impactarán dramáticamente el ensayo de formación de enfoque. Para superar este obstáculo se deben ejecutar pequeños ensayos piloto para optimizar la densidad celular y los tiempos de fijación, ya que las condiciones individuales de laboratorio afectarán el éxito del ensayo.
Para los estudios en los que se comparan diferentes grupos de animales infectados, el análisis estadístico que se realiza depende de la distribución de datos. Las pruebas paramétricas o no paramétricas se utilizan para evaluar la significancia estadística. Para las pruebas paramétricas, Se utiliza ANOVA para detectar el efecto general, y los grupos de tratamiento individuales se compararán utilizando la prueba de Dunn. En caso de que la distribución de datos no satisfaga los requisitos para el análisis paramétrico, se emplean pruebas no paramétricas. La prueba Kruskal-Wallis se utiliza para detectar el efecto general del tratamiento, y la prueba Mann-Whitney U se utiliza para realizar comparaciones por pares. Para los resultados aquí presentes no comparamos los animales con un segundo conjunto de datos cosechado en este momento por lo que no realizamos análisis estadísticos sobre el conjunto de datos mostrado.
Figura 1: Replicación viral en la periferia y el SNC. La carga viral en los tejidos periféricos y del SNC después de los ratones IFNAR1-/- reciben 1x105 FFU de ZIKV SC. El día 4 (n 4 por grupo) se cosecharon órganos posteriores a la infección, se congelaron, se pesaron y se homogeneizaron. Los niveles de virus se cuantificaron mediante el ensayo de formación de enfoque. El límite de detección es de 100-500 FFU/gramo basado en órgano. Los datos se muestran como La unidad de formación de enfoque Log10 por gramo de tejido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Dificultades comunes con el ensayo de formación de enfoque. Para todos los ensayos de formación de enfoque que mostraron antígeno viral se detectó con un MAb anti-flavivirus, seguido de la tinción inmunoperoxidasa (púrpura). (A) Las células de Vero se cultivaron hasta una confluencia del 90% e infectaron con una dilución serial de 10 veces de sobrenadante del hígado cosechada de un ratón C57BL/6 de 8 semanas de edad, IV infectado con 5 x 107 FFU de ZIKV 4 días antes. La flecha roja indica la concentración más alta o "ordenada" de sobrenadante hepático que demuestra la toxicidad en esta concentración. (B) Las células de Vero se cultivaron hasta una confluencia del 90% e infectaron con una dilución de 10 veces de sobrenadante de células renales infectadas por ZIKV. En este caso, las muestras de las columnas 1 y 2 proceden de un ratón C57BL/6 y col 3 y 4 proceden de un Ifnar1-/-. Ambos ratones tenían 8 semanas de edad infectados con 1 x 105 FFU de ZIKV IV y sacrificados 4 días después de la infección. Similar a (A) hay cierta toxicidad observada en la concentración más alta (fila a), pero los lanzadores virales observados en las columnas 3 y 4 superan el límite de problemas de detección que permiten detectar tituladores precisos. (C) Las células de Vero estaban chapadas. Los pozos seleccionados muestran errores técnicos comunes. El * muestra un área donde se eliminó la monocapa debido a un pipeteo vigoroso. El $ se coloca sobre un pozo donde se puede ver una fibra. (D) La concentración de células Vero afecta a la sensibilidad del ensayo. En esta placa las células Vero estaban chapadas a 1.0 x 104 células/bien en las columnas 1-3 y 3.0 x 104 Células Vero-OMS/bien en la columna 4-6. Entonces la placa se infectó con 10 diluciones de ZIKV PRVABC59. Las muestras de concentración viral más altas están en la fila A y diluidas, con cada fila representando una dilución de 10 veces. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Por lo tanto, la infección por ZIKV puede causar una enfermedad neurológica, por lo que los modelos animales actuales para estudiar la patogénesis, las respuestas inmunitarias y la eficacia protectora de las vacunas y los antivirales deben centrarse en el control viral dentro del SNC. Uno de los desafíos para centrarse en la enfermedad del SNC es que a menudo viene a expensas de estudiar la infección periférica. Los métodos de aislamiento de órganos propuestos aquí se centran en la necesidad de evaluar rápidamente la infección por ZIKV tanto en la periferia como en el SNC a fin de evaluar la enfermedad asociada al ZIKV mediada por el SNC y establecer un modelo para las pruebas preclínicas de antivirales, terapéuticos y Vacunas. Un beneficio adicional de esta técnica es que también permite un alto grado de flexibilidad, incluyendo el estudio combinado de respuestas inmunológicas a ZIKV o análisis histológico de la infección. Esta técnica, no se limita sólo a ZIKV, sino que también se puede aplicar universalmente para estudiar una gama de interacciones huésped-patógeno, incluyendo flavivirus como el virus del dengue21,ortopoxvirus como la viruela y la ectromelia. Las consideraciones e inconvenientes de esta técnica de cosecha se centran principalmente en las capacidades del experimentador. Como ZIKV no es estable durante largos períodos de tiempo a temperatura ambiente, la cantidad de tiempo que se tarda en cosechar órganos después de la perfusión puede afectar significativamente la calidad de los resultados. Para la mayoría de los experimentos que hemos realizado, comparamos los lanzadores virales de ratones tratados con dos condiciones, por lo que centramos nuestros esfuerzos en la consistencia del tiempo entre las cosechas de órganos no en la velocidad. De esta manera, la misma persona realiza el mismo procedimiento para que todo el experimento mantenga la coherencia. La otra consideración importante con este procedimiento es la seguridad, hemos realizado fácilmente estos métodos con patógenos BSL-2 (ZIKV, Virus del dengue) y BSL-3 (WNV, virus Chikungunya). Es muy importante realizar todos los procedimientos en un gabinete de bioseguridad limpio, bien mantenido y certificado con desinfectante.
Un FFA es paralelo al ensayo de placa, excepto que utiliza inmunoutilización de peroxidasa para identificar focos de células infectadas, en lugar de placas. Mi laboratorio, así como varios otros laboratorios han cambiado con éxito al uso de FFAs para todos nuestros experimentos de tittering11,14,15,17,26,27 ,28. La FFA tiene múltiples ventajas sobre el ensayo de placa tradicional: a) La FFA es más rápida, lo que requiere una incubación más corta en comparación con un ensayo de placa, b) también es de mayor rendimiento, que se realiza en placas de 96 pocillos. El formato de placa de 96 pocillos también puede acomodar volúmenes más pequeños de material de partida. Además, c) la FFA es compatible con el uso de una arandela de placas automatizada y un contador de puntos automatizado, reduciendo en gran medida la mano de obra y el tiempo requeridos para el ensayo. La FFA tiene más pasos después de la infección, pero d) con el uso de pipetas multicanal, o incluso un robot de pipeteo, el tiempo para la mayoría de los pasos del ensayo después de la fijación son flexibles y el ensayo se puede pausar durante la noche o durante más tiempo. Por último, e) puede ser especialmente útil para cepas de virus que no forman placas claras, como el virus del dengue. Una desventaja de la FFA es que requiere anticuerpos específicos para detectar células infectadas por virus, que pueden ser confundidos cuando se consideran diversas cepas de virus o virus mutantes. Para la FFA como con el ensayo de placa la densidad de la monocapa celular en el momento de la infección es fundamental para el éxito del ensayo. Las células deben utilizarse con mayor confluencia para un FFA en comparación con un ensayo de placa, debido a la acortación del tiempo antes de la fijación. Como la FFA es de mayor rendimiento, más rentable y más rápida que el ensayo tradicional de placa permite a mi laboratorio analizar rápidamente los datos para estudiar enfermedades infecciosas emergentes. La FFA es más rentable acumulativamente por varias razones. Aunque los anticuerpos son más caros que el rojo neutro o el violeta cristalino, somos capaces de analizar más muestras por placa, lo que elimina la diferencia de costo. En términos de asignación de mano de obra, el recuento automatizado de puntos y la fácil entrada de datos para el análisis limitan los costos de mano de obra y la capacidad de tener una imagen a largo plazo como registro es difícil de cuantificar. El futuro de este ensayo puede ser pasar a un foco a base de fluorescentes para una lectura en lugar de HRP. La cantidad de intensidad fluorescente junto con el número de punto extenderá la utilidad de la FFA más allá de lo que se estudia actualmente.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
El Dr. Pinto es financiado por una beca de semilla de la Escuela de Medicina de la Universidad de Saint Louis y fondos de startups de la Escuela de Medicina de la Universidad de Saint Louis. El Dr. Brien es financiado por un premio K22AI104794 de investigador temprano de la NIH NIAID, así como una beca de semilla de la Escuela de la Universidad de Saint Louis. Para todas las personas financiadas, los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18 G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1 cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37 °C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96 well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5 mL eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| Curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose With 4,500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5 mL EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| O-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| One step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| Spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| Straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
References
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