Summary
Målet med protokollet är att demonstrera de tekniker som används för att undersöka virussjukdom genom att isolera och kvantifiera zikaviruset, från flera organ i en mus efter infektion.
Abstract
De metoder som presenteras visar laboratorie procedurer för isolering av organ från Zikavirusinfekterade djur och kvantifiering av virusbelastningen. Syftet med förfarandet är att kvantifiera virala titrar i perifera och CNS områden av musen vid olika tidpunkter efter infektion eller under olika experimentella förhållanden för att identifiera virologiska och immunologiska faktorer som reglerar zikavirus infektion. De organ isolerings procedurer som påvisats möjliggör både kvantifiering av fokus formning och kvantitativ PCR-bedömning av virala titrar. Teknikerna för snabb organ isolering är utformade för att bevara virus titer. Viral titer kvantifiering genom fokus formning assay möjliggör snabb genomströmning bedömning av zika virus. Fördelen med fokus bildar analysen är bedömningen av smittsamma virus, begränsningen av denna analys är potentialen för organtoxicitet minska detektionsgränsen. Viral titer-bedömning kombineras med kvantitativ PCR, och med hjälp av ett rekombinant RNA Copy-kontroll virus arvs kopienummer inom orgeln bedöms med låg detektionsgräns. Sammantaget ger dessa tekniker en exakt snabb, hög genomflödesteknik för analys av zikaviruxtitrar i periferin och CNS hos zika-virusinfekterade djur och kan appliceras på bedömningen av virala titrar i organen hos djur som infekterats med de flesta patogener, inklusive denguevirus.
Introduction
Zika virus (ZIKV) är ett arbovirus som tillhör familjen Flaviviridae, som innehåller viktiga neuroinvasiva humana patogener såsom Powassan virus (POWV), japanskt encefalit virus (JEV), och West Nile virus (WNV)1. Efter dess isolering och identifiering har det förekommit periodiska rapporter om humana zikv-infektioner i Afrika och Asien2,3,4,5och epidemier inom Central-och Sydamerika (ses över i referens6). Det var dock inte förrän nyligen som ZIKV ansågs orsaka allvarlig sjukdom7. Nu finns det tusentals fall av neurologiska sjukdomar och fosterskador kopplade till ZIKV infektioner. Den snabba uppkomsten av ZIKV har föranlett många frågor om: varför det finns en ökning av sjukdomens svårighetsgrad, vad är det immunologiska svaret på ZIKV-infektion och finns det virala och/eller immunmedierade patologier kopplade till ökningen av neurologiska manifestationer och fosterskador. Det finns nu bråttom att förstå den centralanervsystemet (CNS) relaterade sjukdom i samband med ZIKV samt behovet av att snabbt testa effekten av antivirala läkemedel och vacciner mot ZIKV. Det är mot denna bakgrund som vi har utvecklat metoder för snabb analys av ZIKV-titrar i både periferi och CNS med hjälp av en ZIKV-specifika fokus bildar analyser (FFA).
Små djurmodeller är viktiga för att förstå sjukdomsprogression och för tidig utvärdering av vacciner, Therapeutics och antivirala läkemedel. Vi har etablerat små djurmodeller för studiet av arbovirus sjukdom genom att använda olika mus stammar för att modellera mänsklig infektion och skydd mot virala patogener8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Med denna tidigare erfarenhet började vi ändra tekniker som används för bedömning av wNv och Dengue virus, ett relaterat och för bedömning av zikv titer i både perifera organ samt CNS21,23, 24. fördelarna med dessa metoder framför andra analyser är: 1) att de kombinerar förmågan att skörda både PERIFERA och CNS-organ för analys; 2) metoderna är anpassningsbara för flödescytometri, för mätningar av medfödda och adaptiva immunsvar, tillsammans med virala titrar på samma djur i samma organ; 3) skörde tekniken är anpassningsbar för histologisk analys; 4) den ZIKV FFA är en snabb hög genomströmning metod för viral titer analys; och 5) dessa metoder kan tillämpas för bedömning av virala titrar i organ av djur infekterade med de flesta patogener25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer i denna studie är i enlighet med de riktlinjer som fastställts av St. Louis University djuromsorg och användning kommittén. SLU är fullt ackrediterad av föreningen för bedömning och ackreditering av laboratoriedjur omsorg International (AAALAC).
1. organ isolering
Anmärkning: Viruset är inte stabilt vid rumstemperatur (RT) så antalet djur som skördas på en gång måste planeras noggrant för att bevara virala titrar.
- Infektera möss med den valda dosen och rutten, baserat på den fenotyp som krävs. För detta protokoll, infektera 8-10 vecka gammal manlig och kvinnlig typ I interferon receptor bristfällig (Ifnar1-/-) C57BL/6 möss.
- Anesthetize Ifnar1-/- möss med en cocktail av ketamin (90 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg). Test pedal reflex av en fast tå nypa för att bekräfta anestesi. Administrera 1 x 105 fokus formning enheter (FFU) av zikv i 50 μl subkutant (SC) via footpad.
- Förbered allt material som behövs för skörd dagen innan: 2 saxar, pinps och 20 mL 70% etanol (EtOH) i en 50 mL konisk för desinfektion av verktyg.
- Förbered sprutor och nålar: en 20 mL spruta för perfusion, 23 G nålar (cirka 1 per bur) och 1 mL spruta med 25 G nål (1 per 3-5 mus). Före vägning rören, tillsätt stål pärlor (i huva) till 1,5 mL O-ring skruv Cap rör (en för varje organ). Rören måste vara lämpliga för homogenisering.
- Förbered skörde dagen de material som behövs för perfusion och orgel frysning.
- Fyll en isskopa med torris och 70% EtOH att göra ett isbad. Förbered steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) förutsatt att 25-30 mL per mus av PBS för varje perfusion behövs 5-10 mL för ryggmärgen). Få anestesi, en cocktail av ketamin och xylazin, och anta 300 μL per mus. Placera alla material och eventuella ytterligare rör som krävs för flödescytometri etc. i en sekundär behållare för transport till djuranläggningen.
- Följ alla nödvändiga förfaranden för inresa inklusive påtagning och Doffing personlig skyddsutrustning under inresa och utresa till djuranläggningen.
Försiktighet: Alla förfaranden skall utföras i ett certifierat biosäkerhetsskåp inom ett laboratorium för biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2). - Administrera anestesi, 200-500 μL, intraperitonealt beroende på djurets storlek och vikt. Om du arbetar ensam, administrera anestesi till ett djur i taget för att undvika att döda djuren innan orgel skörd.
- Bekräfta anestesi dos genom att klämma tå med pinkoppar för att utvärdera pedal reflex. Fortsätt inte om inte helt nonresponsive. Använd pins för att fästa musen på ett vax bräde. Vid denna punkt, Släck musen i 70% etanol för att undvika hår förorening i organet skörd förfarande
- Oboskt blöder genom hjärt punktering.
- Med hjälp av saxen och tång, öppna djuret genom bröstet hålighet att exponera hjärtat. Samla blod via hjärt punktering (~ 800 μL), detta kan användas för flera analyser inklusive klinisk kemi, hematologi, flödescytometri att upptäcka antigen specifika svar, och realtid kvantitativ PCR (qRT-PCR) för analys av viral Copy nummer.
- För viral RNA-analys av qRT-PCR, samla in blod i ett EDTA-rör om extraktion från helblod eller i ett microcentrifugerör om extraktion från serum. (För serum, spinn rör med maximal hastighet i centrifug, rumstemp, för 20 min och ta bort serum till ett separat rör). Tillsätt en linjär polyakrylamid som bärare till serumprovet efter avslutad behandling. RNA kan sedan analyseras eller lagras vid-80 ° c för att ytterligare bearbeta vid en senare tidpunkt.
- Fyll 20 mL spruta med PBS, vid rumstemperatur (eller 37 ° c), och parfymera möss genom att sätta in fjärilnålen i vänster kammare. Punktera rätt förmak så att blod och PBS att avsluta. Administrera PBS långsamt medan du kontrollerar färgen på levern för att bekräfta att djuret är helt parfymera. Levern bör ändras från djupt röd till rosa lax färg.
- Om förbereder organ för histologi, lämna fjäril nål på plats och sedan parfymera med 20 mL iskall 4% PARAFORMALDEHYD. Om så är det, är det lämpligt att ha sprutan ansluten till en 3-vägs Avstängningskranen med båda sprutorna fästa på den, vrida ventilen på och av som en växlar mellan PBS och PFA.
- Skörda organ i märkta, vägda rör. För perifera organ, Följ en etablerad ordning för skörd: lever, mjälte, njure och lungor.
- Ta bara en LOB från levern; Det spelar ingen roll vilken, men för alla experiment försöker alltid att ta samma LOB med samma storlek pjäs. Likaså, för njurar och lungor, ta samma njure och lunga. Om flödescytometri också ska slutföras, kan alla organ halveras. Förvara den halva som ska användas för flödescytometrianalys i Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) vid rumstemperatur tills skörden är klar.
- Omedelbart efter skörd, Lägg varje organ i en märkt tub och placera i det torra isbadet. Virus titer minskar med tiden vid rumstemperatur, så hur mycket tid det tar att skörda organ är oerhört viktigt. Det måste finnas enhetlighet mellan möss, så efter säkerhet, nästa prioritet är hastighet.
Anmärkning: Om skörd organ för viral titers, det är till stor hjälp att ha en andra individ skörd hjärnan på denna punkt, att bevara virala titrar.
- Ta bort de återstående organen från musen kroppens hålighet för att få tillgång till ryggraden och skalle.
- Ta bort musen från brädet och ta bort Pelt, följt av avlägsnande av armar och ben.
Ta bort huvudet på musen med en halshuggning, trubbig eller kirurgisk sax för att skörda hjärnan genom att skära skallen med en tandad LaGrange sax genom foramen magnum. Sedan, dra av skallen med pinps och ösa ut hjärnan med en spatel. - Med hjälp av starka, avtrubade sax, ta bort revbenen och andra ben som omger ryggraden. Sedan, skär över bäckenbenet, utsätta kotfrakturer foramen på ländryggen. Den lilla spetsen av ryggmärgen bör vara synlig på denna punkt.
- Använd en 10 mL spruta fylld med PBS och en 18 G nål för att fördriva ryggmärgen genom att "spola" sladden från ländryggen till cervikal ryggrad över en petriskål.
- Försiktigt, placera den avfasade spetsen av nålen inne i kotpelaren foramen, undvika överdrivet tryck för att förhindra att nålen att olaga intrång kotpelaren. Håll starkt för att utöva tryck på ryggraden och nålen och tryck på sprutkolven för att utvisa sladden. Omedelbart överföra ryggmärgen i den märkta röret och placera i det torra isbadet.
- Ta bort musen från brädet och ta bort Pelt, följt av avlägsnande av armar och ben.
- Upprepa proceduren med alla djuren tills skörden är avslutad. Placera skörde verktygen i etanol 70% mellan djur. Fokus på konsistens och snabbhet. Längden på tiden mellan varje organskörd bör förbli konsekvent så att inte bias viral titer resultat.
- När du är klar, desinficera biosäkerhets skåpet och allt material innan du tar bort det från djuranläggningen.
- Ta bort varje rör från isbadet och väga rören för att bestämma organvikt. För att bestämma organvikt, subtrahera vikten av det tomma röret från vikten av det organ som innehåller röret.
Anmärkning: Vid denna punkt organ kan frysas vid-80 ° c för att ytterligare bearbeta vid ett senare datum eller organ kan homogeniseras omedelbart innan frysning enskilda alikvoter. Frys tinning prover flera gånger minskar viral titer. Därför är det viktigt att göra samma procedur för alla experiment inom ett och samma projekt.
2. orgel homogenisering
- Förbered 3 märkta, 1,5 mL Snap-utjämnade rör för varje organ som ska homogeniseras.
- Om proverna inte homogeniseras omedelbart efter skörden, ta bort rören från-80 ° c. Proverna behöver inte Tinas för att homogenisera.
- Sätt proverna på is för att hålla dem kallt för att minimera viral titer förlust. Tillsätt sedan 1 mL kall DMEM som innehåller 5% FBS till varje organ som innehåller tub.
- Omedelbart slå rören i pärlvisp enligt tillverkarens anvisningar. Homogenisera alla organ med stål pärlor i en pärla-Homogenisatorer instrument. Kontrollera att varje organ har helt homogeniseras.
- Snurra ner orgel skräp i mikrofuge vid 12 000 x g i 5 minuter i en mikrofugrör som har kylts till 8 ° c. Sedan tillbaka rören till isen hink. I biosäkerhets skåpet, alikvoter i rör för nödvändiga analyser. Sedan tillbaka rören till isen hink.
- För fokus formning analys, alikvot 500 μl i en märkt tub. Placera sedan rören i racket på en ishink. Aliquot 50 μL till ett rör för RNA för fluorogen kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR) för att mäta virus arvs kopienummer.
- Isolera totalt RNA från de infekterade djurens organ med hjälp av ett kommersiellt RNA-isoleringspaket. Bestäm och viral RNA med hjälp av primer sond uppsättningar specifika för zikv, som erkänner unika sekvenser i varje och arvsmassa. Bestäm viral Copy nummer med hjälp av en kopia kontroll plasmid innehåller en definierad positiv enkelsträngad RNA genereras in vitro med T7 polymeras som innehåller zikv målsekvenser.
- Alikvot återstående prov, som är ungefär 300 μL, i det tredje röret och förvara vid-80 ° c vid behov.
Anmärkning: Om proverna inte tidigare var frysta, frys vid-80 ° c. Om proverna tidigare hade frysts fortsätter du till fokus formnings analysen och/eller RNA-isoleringen innan du stoppar.
3. zika virus fokus bildar analys26
Anmärkning: Det är viktigt att inkludera en ingen viruskontroll och en positiv kontroll. Den positiva kontrollen är en utspädningsserie av ett virus bestånd med en känd koncentration. Inte alla kontroller behöver vara på samma platta, men eftersom analysen blir större än 5 plattor, fler kontroller bör läggas till, och spridas ut bland plattorna. Var noga med att inte repa enskiktslager med antingen Pipettera tips eller genom kraftig tvättning. Flera organ kan ana på samma dag eller på olika dagar. Men ett enskilt organ bör inte Ana över flera dagar eftersom olika assay villkor kan påverka viral titer. Det rekommenderas starkt att köra ett enskilt organ på en enda dag.
- Före dagen för analysen, förbereda de celler och reagenser som behövs för fokus bildar analysen.
- Förbered tillväxt medier som innehåller 500 mL DMEM med 5 mL HEPER och 25 mL FBS. Har Vero-Världshälsoorganisationen (WHO) celler växer i tillväxt medier vid 37 ° c, 5% CO2 före början av analysen. Vero-cellerna bör inte vara en hög passage eller någonsin vuxit över 100% confluency före början av analysen.
- Bered 500 mL av en 2% metylcellulosa lösning genom att Autoklavera en 1 L glas flaska med 10 g metylcellulosa och en stor rör bar och en separat 1 L glas flaska med 500 mL H2O. Om autoklaverat vatten har svalnat värma i mikrovågsugn tills flaskan är varm vid beröring, men inte kokning.
- Häll försiktigt varmt/hett vatten i flaska metylcellulosa i vävnaden kultur huva. Delvis lock flaska och rör på kokplattan tills metylcellulosa är i lösning (1-4 h). Alikvot den 2% metylcellulosa lösningen i sterilt 50 mL koniskt rör. 2% metylcellulosa kan förvaras vid 4 ° c tills det behövs.
- Bered en 5% Paraformaldehydlösning i PBS för fixering av plattorna och förvaras vid 4 ° c tills det behövs. Förbered en 1x fokus bildar analys tvätt buffert genom att lägga till 0,05% Triton X-100 till PBS och lagras på RT. Förbered en 1x FFA färgbuffert genom att tillsätta 1 mg/mL saponin till PBS och förvaras vid 4 ° c tills det behövs. Dessa kan förberedas en-två veckor i förväg.
- Beräkna antalet platta botten 96 väl plattor som behövs för analysen så att varje organ är klädd i tre exemplar. Inkludera tillräckligt med extra brunnar för positiva och negativa kontroller.
- Växa upp tillräckligt Vero celler i tillväxt medier för att slutföra analysen utformad. Trypsinize de Vero celler och räkna dem resuutgifterna dem på 1,5 x 105 celler per ml i tillväxt medier. Platta Vero-celler i 96 väl platta Bottenplattor på 3,0 x 104 Vero-WHO celler/brunn i tillväxt medier genom att tillsätta 200 μl per brunn.
- Inkubera plattorna vid 37 ° c vid 5% CO2 över natten, se till att plattorna är i nivå i inkubatorn så att cellerna fördelas jämnt inom brunnen.
Anmärkning: Varje laboratorium odlar Vero-celler något annorlunda; målet är en 90-95% konfluenta enskiktslager i varje brunn på dagen för analysen för zika virus.
- Späd zikavirus-prover dagen för analysen. Om orgelproverna tidigare hade homogeniserats, ta bort proverna från frysen-80 ° c och låt dem Tina innan proverna placeras på is för analysen.
- På isen, Förbered en rund botten 96 väl plattan genom att lägga till 180 μL av kall tillväxt media till rader B genom H lämnar rad en tom. Tillsätt 150 μL av varje homogeniserat orgelprov till rad A i den runda bottenplattan.
- Bered seriella 10-faldigt spädningar av varje prov med hjälp av en flerkanalspipett. Späd prover i en rund botten 96 väl plattan genom att tillsätta 20 μL prov i 180 μL av tillväxtmedia, ändra pipettspetsarna mellan varje utspädning.
- Förbered fokus bildar plattan genom att ta bort media från den platta botten 96 väl plåt som täcker Vero celler. Gör detta omedelbart innan du lägger till virusproverna för att förhindra att enskiktslager torkar ut.
- Tillsätt 100 μL av virus spädningen till varje brunn i Vero-plattan. Lägg till prov med samma uppsättning tips genom att gå från den lägsta till den högsta koncentrationen. Rock plattor sida till sida 2-4 gånger är noga med att inte snurra.
- Inkubera vid 37 ° c, 5% CO2 för 1-2 h. se till att plattorna är i nivå i inkubatorn. Under inkuberingen värma upp 2% metylcellulosa till RT.
- Späd 2% metylcellulosa lösning i tillväxtmedia. Spädningen ska ske med ett förhållande på cirka 2:1 av 2% metylcellulosa till tillväxtmedia. Håll i rumstemp tills det är dags att använda den. Tillsätt 1-2 droppar/brunn (Ställ Pipettera till 125 μL) av metylcellulosa: tillväxtmedia till varje brunn av 96 väl plattan.
- Inkubera 32-40 h vid 37 ° c, 5% CO2. Eftersom allas Vero-celler växer något annorlunda och faktorer som cell sammanlänkning och stam av zikavirus kan förändra inkubationstiden.
- Fixera Vero-cellerna med den beredda 5% paraformaldehydlösningen.
- Tillsätt 50 μL av 5% PARAFORMALDEHYD till varje brunn över toppen av metylcellulosa skiktet i biosäkerhets skåpet. Inkubera i 60 min vid RT. Fixandet kan gå över natten vid 4 ° c men Täck plattan med parafilm för att minska avdunstning.
- Dumpa överlägg och media av celler i en behållare för bortskaffande inuti biosäkerhets skåpet. Tvätta försiktigt med PBS, 150 μL/brunn. Ta bort PBS från plattorna och ta bort plattan från BSL-2.
- Upprepa PBS tvätta 2x lägga 150 μL/brunn. Ta sedan bort PBS. Tillsätt 150 μL/brunn 1x FFA tvättbuffert och låt sitta för 5-10 min vid RT att permeabilize de fasta cellerna.
- Identifiera infektion med primär zika antikropp. Förbered den primära antikroppen 4G2 (D1-4G2-4-15) vid en koncentration av 1 mg/mL i FFA färgbuffert. Förbered tillräckligt med antikropp för hela analysen.
Anmärkning: Håll dig borta från Lab blöjor eller andra hög-ludd absorberande material som fibrerna kommer att negativt påverka avbildning av Foci.- Ta bort FFA tvättbuffert från plattorna. Tillsätt 50 μL/brunn av den primära antikroppen i FFA-färgningsbufferten. Försegla plattorna med parafilm och inkubera över natten vid 4 ° c på en gungande plattform. Analysen kan göras med en inkubering för 2 h vid RT.
- Visualisera infektionen genom tillsats av en sekundär HRP konjugerad antikropp. Förbered sekundär get anti-Mouse HRP-märkt antikropp vid en koncentration av 1:5000 i FFA färgbuffert. Förbered tillräckligt med antikropp för hela analysen.
- Tvätta celler 3x med FFA tvätta buffert, ta bort tvättbuffert genom att bläddra i diskhon varje gång. Färga cellerna med den sekundära antikroppen i FFA färgbuffert på 50 μL/brunn. Inkubera 1-2 h vid RT.
- Tvätta celler 3x med FFA tvätta buffert, ta bort tvättbuffert genom att bläddra i diskhon varje gång. Tillsätt 50 μL/brunn av Trueblue-substratet.
- Titta på plattorna noggrant, väntar 2-15 min tills fläckar är helt definierade och minimal bakgrund. Efter fläckarna är synliga, tvätta försiktigt med vatten, med hjälp av en hand för att skydda enskiktslager från kraften i vattnet igång. Knacka torrt på pappershanddukar (inte BLÖJOR) och bild så snart som möjligt.
- Fläckar kan räknas manuellt eller med hjälp av en automatiserad spoträknare. Om det räknas manuellt kan en dissekera omfång användas för att stöd i visualisering.
- För varje prov, Välj en utspädning med lätt distingerade Foci (t. ex. 20 till 200 per brunn) och beräkna titern i fokus-Forming enheter per mL (FFU/ml), med hjälp av genomsnittet av dubbla brunnar: FFU/mL = (medelvärde Foci/well) × (utspädningsfaktor) ÷ (mL inoculum).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att utvärdera zikv-titrar med hjälp av protokollet som beskrivs ovan Ifnar1-/- möss var infekterade med zikv (PRVABC59) via subkutan (SC) injektion till footpad. Här, administrationen av 1 x 105 FFU av zikv till 8-12 vecka gamla Ifnar1-/- möss SC är inte dödlig men viruset kan replikera i både periferi och CNS. Denna dos och väg används för att studera värd patogen immunsvar och patogenicitet. Administrering av 1 x 105 FFU av zikv till en 8-12 vecka gammal Ifnar1 -/- Mouse intravenös (IV) injektion är mellan 80 till 100% dödliga, med djuret duka under till infektion mellan 8 till 14 dagar efter virus injektion. Vi använder rutinmässigt denna administreringsväg för att fastställa effekten av antivirala läkemedel och Therapeutics, liksom prekliniska vaccinkandidat testning.
Fyra 10-12 vecka gamla Ifnar1-/- möss var infekterade med 1 x 105 FFU av zikv SC och spleens, lever, njurar, ryggmärg och hjärnor skördades fyra dagar efter infektion med de metoder som beskrivs ovan (figur 1). Mängden ZIKV i vävnaderna analyserades av fokus Forming assay (FFA) med hjälp av Vero celler i en 96 väl format som beskrivits ovan. Använda FFA, vävnad virusbelastning uttrycks som fokus bildar enheter (FFU) per g vävnad. Liknar vad som observerades i en tidigare studie av zikv infektion av Ifnar1-/- 26, vi såg viremia efter ett urval av virala titrar i olika organ fyra dagar efter zikv infektion. Dessa resultat indikerar att de metoder som används för organskörd och fnissande av fokus bildar analys kan användas för att upptäcka titer i både perifera organ och CNS inom samma djur. Intressant, vi förväntade oss inte att se höga virala titrar i både periferin och CNS fyra dagar efter infektion i Ifnar1-/- möss eftersom alla Ifnar1-/- överleva zikv infektion med denna dos och väg. Vi fortsätter att utforska denna observation för att förstå hur zikv kan fortsätta att replikera i CNS av Ifnar1-/- utan att orsaka dödlighet.
När du utför fokus Forming assay (FFA), det finns flera tekniska misstag en utredare kan göra vilket kommer att resultera i suboptimala FFA resultat. De vanligaste misstagen är: 1) organtoxicitet; 2) kraftig pipettering; 3) fiber förorening; och 4) felaktig cellplätering densitet. Vi diskuterar var och en av dessa frågor nedan och illustrerar resultatet i diagram 2. En av de vanligare problem som uppstår med både FFA och plack analysen är organtoxicitet (figur 2A röd pil). Vi tror organtoxicitet drivs av den höga koncentrationen av intracellulära komponenter frigörs under orgel homogenisering. Organtoxicitet varierar beroende på orgeln och ses i organ som skördats från icke-infekterade djur, med levern är den mest giftiga och mjälten minst. Toxicitet reduceras eftersom orgeln seriellt späds på FFA plattan. Emellertid, toxicitet förändrar känsligheten hos analysen vilket resulterar i en förändring i detektionsgränsen. Som visas i figur 2A om viral titer i orgeln är lägre än TOXICITETEN kommer FFA inte att kunna korrekt registrera viral titers. Figur 2b illustrerar toxicitet i brunnar a1-4, men viral titer är tillräckligt hög för att övervinna organtoxicitet som ses i brunnar B3 och B4. För att övervinna denna begränsning i FFA, utför vi också kvantitativ realtid PCR på organ titer prover. I figur 2Cillustrerar vi flera vanliga tekniska fel. Kraftig pipettering eller tvättning kan ta bort enskiktslager (figur 2C, *), om detta sker i brunnar med Foci att data kommer att förloras leder till felaktig rapportering av titer resultat. Fibrer eller hårstrån, som är närvarande i Lab bänk absorberande papper kan förora enskilda brunnar (figur 2C, $) Detta kan orsaka betydande fel om du använder ett automatiserat räkneprogram. Medan de flesta automatiserade räkna program har alternativ fiber uteslutning, vi har inte funnit det vara mycket effektivt på att utesluta fibrer från analysen. Lösningen på detta är att manuellt räkna brunnar, som kan vara mycket tidskrävande och är inte praktiskt för analys av stora analyser. Cell täthet är en annan fråga som dramatiskt kan påverka framgången för en fokus Forming assay (figur 2D). Om cellerna inte är i rätt densitet i början av analysen kommer antalet och storleken på fläckarna att påverkas. Som visas i figur 2D, kolumner 1-3, celler vid cirka 60% confluency i början av analysen jämfört med celler pläterade vid 90% confluency kolumner 4-6 kommer att dramatiskt påverka fokus bildar analysen. För att övervinna detta hinder små pilot analyser bör köras för att optimera celltäthet och fixering gånger som enskilda laboratorieförhållanden kommer att påverka framgången för analysen.
För studier där olika grupper av infekterade djur jämförs är den statistiska analys som utförs beroende av data fördelningen. Antingen parametriska eller icke-parametriska tester används för att bedöma statistisk signifikans. För parametriska tester, ANOVA utnyttjas för att upptäcka övergripande effekt, och enskilda behandlingsgrupper kommer att jämföras med hjälp av Dunn ' s test. Om datadistributionen inte uppfyller kraven för parametrisk analys används icke-parametriska tester. Kruskal-Wallis-testet används för att detektera den totala behandlingseffekten, och Mann-Whitney U-testet används för att utföra par-Wise-jämförelser. För de resultat som finns här jämför vi inte djuren med en andra datauppsättning som skördats vid denna tidpunkt, så vi utförde ingen statistisk analys av den datauppsättning som visades.
Figur 1: viral replikation i periferin och CNS. Viral börda i perifera och CNS vävnader efter IFNAR1-/- möss ges 1x105 FFU av zikv SC. På dag 4 (n = 4 per grupp) efter infektion organ skördats, snap frysta, vägda och homogeniserade. Nivåer av virus kvantifierades genom fokus formning analys. Detektionsgränsen är 100-500 FFU/gram baserat på orgel. Data visas som log10 fokus-Forming enhet per gram vävnad. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: vanliga problem med fokus-bildande analys. För alla fokus bildar analyser visade viral antigen upptäcktes med en anti-flavivirus MAB, följt av immunoperoxidas färgning (lila). (A) Vero-celler odlades till en 90% confluency och infekterade med en 10-faldig seriell utspädning av supernatanten från levern skördats från en 8 vecka gammal C57BL/6 mus, IV infekterade med 5 x 107 FFU av zikv 4 dagar tidigare. Den röda pilen indikerar den högsta eller "snygga" koncentrationen av lever supernatanten som visar toxiciteten vid denna koncentration. (B) Vero-celler odlades till en 90% confluency och infekterade med en 10-faldig utspädning av supernatanten från zikv infekterade njurceller. I detta fall prover i kolumn 1 och 2 är från en C57BL/6 mus och Col 3 och 4 är från en Ifnar1-/-. Båda möss var 8 veckor gamla infekterade med 1 x 105 FFU av ZIKV IV och offrade 4 dagar efter infektion. Liknar (a) det finns en viss toxicitet ses vid den högsta koncentrationen (rad A), men de virala titrar observerats i kolumn 3 och 4 övervinna gränsen för upptäckt frågor som gör det möjligt för exakta titrar att upptäckas. C) Vero-celler var pläterade. De valda brunnarna visar vanliga tekniska fel. Den * visar ett område där enskiktslager togs bort på grund av kraftig pipettering. Den $ är placerad över en brunn där en fiber kan ses. D) Vero-cellkoncentrationen påverkar analysens känslighet. I denna tallrik var Vero-celler pläterade vid 1,0 x 104 celler/brunn i kolumn 1-3 och 3,0 x 104 Vero-WHO-celler/brunn i kolumn 4-6. Då plattan var infekterad med 10-faldig utspädningar av ZIKV PRVABC59 lager. De högsta virala koncentrations proven är i rad A och späds ner, med varje rad som representerar en 10-faldig utspädning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ZIKV-infektion kan orsaka en neurologisk sjukdom därför den nuvarande djurmodeller för att studera patogenes, immunsvar och skyddande effekt av vacciner och antivirala läkemedel måste fokusera på viral kontroll inom CNS. En av utmaningarna med att fokusera på CNS-sjukdom är att det ofta kommer på bekostnad av att studera perifer infektion. De organ isoleringsmetoder som föreslås här fokuserar på behovet av att snabbt utvärdera ZIKV infektion i både periferin och CNS för att bedöma CNS-medierad ZIKV associerad sjukdom och upprätta en modell för preklinisk testning av antivirala läkemedel, terapeutiska och Vacciner. En extra fördel med denna teknik är att det också möjliggör en hög grad av flexibilitet, inklusive den kombinerade studien av immunologiska svar på ZIKV eller histologisk analys av infektion. Denna teknik, är inte begränsad till bara ZIKV men kan också allmänt tillämpas för att studera en rad värd-patogen interaktioner, inklusive flavivirus såsom Dengue virus21, orthopoxvirus som Monkeypox och ectromelia. De överväganden och nackdelar med denna teknik för skörd fokus främst av förmågan hos försöksledaren. Eftersom ZIKV inte är stabilt under långa tidsperioder vid rumstemperatur, kan den tid det tar att skörda organ efter perfusion avsevärt påverka kvaliteten på resultaten. För de flesta experiment som vi har utfört jämför vi virala titrar från möss behandlade med två villkor, så vi fokuserar våra ansträngningar på konsekvens av tid mellan orgel skördar inte på hastighet. På detta sätt samma person utför samma procedur för hela experimentet för att bibehålla konsekvensen. Den andra stora övervägande med detta förfarande är säkerhet, vi har lätt utfört dessa metoder med BSL-2 (ZIKV, Dengue virus) och BSL-3 (WNV, chikungunya virus) patogener. Det är mycket viktigt att utföra alla procedurer i en ren, väl underhållen, certifierad biosäkerhetsskåp med desinfektionsmedel.
En FFA paralleller plack analysen, förutom att den använder peroxidas immunofärgning att identifiera Foci av infekterade celler, snarare än plack. Mitt laboratorium och flera andra laboratorier har nu framgångsrikt övergått till att använda ffas för alla våra fnissande experiment11,14,15,17,26,27 ,28. FFA har flera fördelar jämfört med den traditionella plack analysen: a) FFA är snabbare, vilket kräver en kortare inkubation jämfört med en plack assay, b) det är också högre genomströmning, som utförs i 96-bra tallrikar. Den 96 väl plattan format kan också rymma mindre volymer av utgångsmaterial. Dessutom, c) FFA är kompatibel med användning av en automatiserad tallrik bricka och automatiserad plats räknare, kraftigt minska arbetskraft och tid som krävs för analysen. FFA har fler steg efter infektion, men d) med hjälp av flerkanaliga Pipets, eller ens en pipettering robot, tidpunkten för de flesta av analysen steg efter fixering är flexibla och analysen kan pausas över natten eller längre. Slutligen, e) det kan vara särskilt användbart för virusstammar som inte bildar tydliga plack, såsom Dengue virus. En nackdel med FFA är att det kräver specifika antikroppar för att upptäcka virusinfekterade celler, vilket kan vara confounding när man överväger olika virusstammar eller muterade virus. För FFA som med plack analysen tätheten av cellen enskiktslager vid tidpunkten för infektionen är kritisk för framgången av analysen. Celler bör användas vid högre sammanflödet för en FFA jämfört med en plack analys, på grund av den förkortade tiden före fixering. Eftersom FFA är högre genomströmning, mer kostnadseffektiv och snabbare än den traditionella plack analysen det gör mitt laboratorium för att snabbt analysera data för att studera framväxande infektionssjukdomar. FFA är mer kumulativt mer kostnadseffektivt av flera skäl. Även om antikroppar är dyrare än neutral röd eller Crystal Violet, kan vi analysera fler prover per tallrik vilket eliminerar kostnadsskillnaden. När det gäller arbetsfördelning automatiserad plats inventering och enkel datainmatning för analys gränser arbetskostnader och förmågan att ha en långsiktig bild som ett rekord är svårt att kvantifiera. Framtiden för denna analys kan vara att flytta till en fluorescerande-baserade Foci för en avläsning i motsats till HRP. Kvantitera fluorescerande intensitet tillsammans med spotnummer kommer att förlänga nyttan av FFA utöver vad som för närvarande studeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja
Acknowledgments
Dr Pinto finansieras av ett frö bidrag från Saint Louis University School of Medicine och Startup medel från Saint Louis University School of Medicine. Dr Brien finansieras av en K22AI104794 Early Investigator Award från NIH NIAID samt ett frö bidrag från Saint Louis University School. För alla finansierade individer hade finansiärer ingen roll i studiens utformning, datainsamling och analys, beslut om att publicera eller förberedelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18 G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1 cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20 cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37 °C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96 well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5 mL eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| Curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose With 4,500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5 mL EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| O-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| One step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| Spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| Straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
References
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
- McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
- Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
- Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
- Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
- Brien, J. D. Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , Oregon Health & Science University. (2007).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
- Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
- Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
- Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
- Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
- Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
- Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
- Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
- Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
- Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
- Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).
