这里介绍的方法使用微模式和定量成像来揭示哺乳动物文化内的空间组织。该技术在标准细胞生物学实验室中易于建立,为体外研究模式提供了一个可操作的系统。
生物学的一个基本目标是了解模式在发育过程中是如何出现的。几个小组已经表明,当干细胞在空间上被限制在微模式上时,可以在体外实现模式化,从而建立了实验模型,为在体外识别生物学的基本原理提供了独特的机会组织。
在这里,我们介绍我们自己的方法实现。我们采用了照片图案技术,以减少对专用设备的需求,以便更轻松地在标准细胞生物学实验室中建立该方法。我们还开发了一个免费、开源且易于安装的图像分析框架,以便精确测量标准形状和尺寸的细胞群中细胞亚群的优先定位。这种方法使得即使在看似混乱的细胞群中,也能揭示模式事件的存在。该技术提供定量见解,可用于分离环境的影响(例如,物理提示或内源信号),对给定模式处理过程的影响。
在哺乳动物系统中,模式是细胞集体行为的一个紧急属性,因此,如果向细胞1、2、3、4提供适当的线索,模式可以在体外形成。5,6.揭示细胞在体外自我组织的内在能力的一种方法是强迫细胞形成定义的形状和大小的7、8、9、10的组/组群.实现这一点的技术是微模式11。通过微模式化,可以精确定义细胞外基质 (ECM) 分子沉积在表面上的位置。这反过来又决定了细胞可以粘附的位置,因此控制细胞在空间上组织的方式。
微模式化是一种具有多种应用的技术,例如,微模式化使微分12之前的初始条件标准化。重要的是,微模式使得很容易控制细胞群落的大小、形状和间距成为可能,这一特性可用于设计旨在询问细胞对形态原或物理线索的集体反应的实验7,8,10,13,14,15,16,17.
已经开发出几种微模式化方法。照片图案技术也许是建立18的最简单方法。这些方法也具有精度的优点,因为它们可以用来控制单细胞18,19,20的形状。然而,它们还需要昂贵的专用设备,包括旋转涂层、等离子室和UVO(UV-臭氧)清洁剂,这在标准生物学实验室中通常不容易买到。为了便于采用该技术,我们调整了协议,仅需要 UVO 灯。我们从市售塑料滑梯开始,可以使用剪刀或打孔切割到所需的格式。
微模式的一个重要用途是能够标准化殖民地,以便比较多个复制体的单个殖民地。这使得可以询问这些菌落内的模式形成在多大程度上是可重现的,并探讨影响模式处理过程鲁棒性的因素。重要的是,对多个标准化殖民地的”平均”模式进行量化,也可以揭示出模式化过程,否则这些过程不会很明显。能够量化标准化菌落上的模式的优点取决于能否准确测量蛋白质表达,最好是在单细胞水平上。然而,微图案上的细胞通常紧密包装,使其难以高精度分割。细胞通常也以三维而不是两维进行组织,在分段期间检测和保存三维 (3D) 信息可能具有挑战性。成功分割单元格后,需要计算方法从生成的数据集中提取模式信息。
我们开发了细分和图像分析工具,以帮助克服这些问题。此分析方法仅使用自由和开源软件,不需要实现命令行或编程知识。为了说明这种方法,我们使用小鼠胚胎干细胞(mES)细胞,它们自发地表示早期分化的标记物(Tbra)21、22。虽然没有明显的空间排列是视觉上可检测的,但该方法允许创建在菌落中优先定位T+细胞的地图。我们还表明,Tbra模式与表达Id1的细胞缺乏优先定位形成对比,这是骨形态遗传蛋白(BMP)通路23的直接读出。我们还讨论了该方法的当前局限性,以及该技术如何适应其他实验系统。
在这里,我们描述了一种分析细胞培养物中紧急模式的方法。简化的微模式方法用于标准化细胞群的形状和大小,我们提供了图像分析工具和R脚本,能够检测和量化这些菌落中的模式。
我们提出的管道在某种程度上与先前公布的方法31类似,作者侧重于培养条件,使用市售微模式,在ESC菌落中取得可重复的生殖层形成。研究体外早期胃化事件。我们的目标是更专注于为在体外发现模式形成提供一个可通用的管道,在体外,细胞的集体组织只有在统计分析后才能显现出来。因此,我们提供强大的图像分析工作流程,能够准确识别和分析多个殖民地的三维空间中的核位置(另请参阅本殖民地的”模式检测方法的优点和局限性”部分)讨论)。我们还决定开发一种简单的内部微模式方法,长期提供更灵活、更便宜的替代商业解决方案,我们希望对社区有用。
最后,我们注意到,在修订本手稿期间,已经发布了一个新的包,用于分析体外模式,类似于我们的R脚本。此新包接受单元功能表作为输入,可以从高吞吐量映像平台获取。我们认为,在协议第7步生成的核特征表原则上可以作为这个新包的输入,尽管我们自己还没有测试这种可能性。
该方法对其他细胞类型和菌群几何体的适应性
我们在研究多能细胞培养物中存在多能细胞的中皮转录因子时提出这种方法。然而,该方法很容易适应其他细胞类型和无血清培养物,尽管可能需要优化ECM/poloxamer 407浓度(参见表1,了解测试浓度,见表2,了解故障排除指南)。该方法还可以根据用户的需求,适应较大或更小尺寸的微型图案和多种形状。但是,在建立该方法时,请务必注意并非所有形状/单元格类型组合都是最佳的。例如,mESC 表示高浓度的 E-cadherin33,34使这些细胞能够形成跨越无 ECM 区域的集体结构。这些单元格不严格遵循具有锐角或包括图案中小孔的几何形状。例如,请注意,在图 3B的环上,单元格正在殖民中心区域。在我们手中,一个较小的中心区域并没有迫使mESC形成环形殖民地。因此,强烈建议在设计照片蒙版时包括多种几何形状,以便能够测试和识别最适合所选择的细胞类型的尺寸和曲率。
另一个需要考虑的重要因素是实验的长度和细胞的增殖率。对于一些快速增殖的细胞类型(包括多能细胞),在多天内很难在微模式上维持细胞(对于mESC,最多三天)。此外,在微模式上播种细胞并不总是以最佳方式针对每个菌落,因此建议为有备件而播种过多的菌落。
模式检测方法的优点和局限性
该方法的一个特别优点是通过合并来自多个复制菌落的图像分析结果来检测”平均”模式(图5)。这可以揭示从单个殖民地的检查中并不明显的模式事件。这种”平均”方法的缺点是,它可能会错过某些类型的重复模式,例如小点或窄条纹。但是,这些类型的模式可能改为通过精心挑选的图案大小8的组合来显示。此外,此处描述的图像分析管道提供单单元和菌群分辨率的定量数据,提供了研究菌群间变异水平(图5)或以多个比例表10.
平均方法的另一个重要优点是,它提供了绘制许多标记的偏好位置的机会,而不受检测通道的可用荧光量的限制。事实上,尽管我们在这里介绍的工作中只使用了两个区分标记,但标准化殖民地和提取”平均”模式的能力使得可以按顺序将不同殖民地的分布图进行比较揭示标记彼此的广义空间关系。
此外,尽管我们在这里的重点是研究微分标记,但分析方法可以扩展到研究有核标记的其他生物过程。例如,对含有荧光泛化细胞周期指示器35 (FUCCI) 的细胞系进行微模式化,可以研究菌群水平几何体如何影响组中的细胞周期事件。
未来方向
该方法适用于中等吞吐量的图像分析,但是,图像采集目前尚未完全自动化,并且对于非常大的实验来说可能会受到限制。殖民地的常规安排应能创造全自动采集程序,类似于为平均20个单细胞开发的自动化采集程序。但是,由于对菌落进行成像所需的场面积很大,可能需要镶嵌,并且由于菌落是三维的,因此最好通过仅对相关菌落进行成像来减小数据集大小和采集时间。因此,今后可能会致力于开发一种”智能”显微镜,能够识别相关菌落并调整成像坐标以适应每个样品。这不仅可以减少时间和精力,而且还可以防止潜在的操作员偏见。
通过减少用户需要采取的步骤数,还可以提高分析管道的效率。我们计划构建管道构建机制,并将 R 直接集成到我们的软件中(请参阅代码存储库的问题跟踪器 [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues] 中的问题选择单元 api_3 和 pickcell-rjava_1)。分析过程的完全自动化将减少时间和精力并限制潜在的用户错误。
最后,我们注意到,我们的分析方法尚未完全捕获细胞模式的动态性质。通过检查快照图像8、10、36的时间序列,可以提取一些有限的动态信息。然而,如果我们希望更好地了解模式是如何出现的,能够记录细胞群的历史是非常可取的。一个限制是,精确跟踪单个细胞在3D密集细胞群仍然是一个非常具有挑战性的任务37。我们的细胞检测方法使用核包络,在致密和重叠的细胞群28上表现特别好。核信封的现场记者随时可以找到28,38和微模式技术的一个优点是,它可以用来防止细胞在长期成像期间移动到视野之外。总体而言,我们相信,使用最近建立的工具 28、39、40 的组合,可以实现细胞的自动跟踪,并且这应该为基本自我组织的原则。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由亨利·韦康爵士博士后奖学金(WT100133至G.B.)、威康信托高级奖学金(WT103789AIA至S.L.)和威康信托博士生奖学金(108906/Z/15/Z至D.W.)资助。我们也感谢曼努埃尔·托里博士关于调整照片图案技术的建议。
2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | handle in fume hood |
1× Master quartz anti-reflective chromium photomask | Toppan Photomask | Custom design | |
24-well plates | Corning | 3526 | |
4-well plates | Nunclon Delta | 176740 | |
5% Donkey Serum | Sigma | D9663 | |
Anti Nuclear pore complex | Abcam | ab24609 | Mouse monoclonal, use 1:1000 |
Anti-Id1 | Biocheck | 37-2 | Rabbit polyclonal, use 1:200 |
Anti-Lamin B1 | Abcam | ab16048 | Rabbit polyclonal, use 1:1000 |
Anti-Tbra | R&D | AF2085 | Goat ployclonal, use 1:400 |
Blocking Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 5% Donkey Serum 0.003% Sodium Azide In PBS |
CGR8 mESC | NA | NA | Reference: Mountford et al. PNAS, 1994 |
Fixation solution | NA | NA | 4% PFA diluted in washing solution |
Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance |
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma | G5154 | |
Laboratory Film | VWR | 291-1212 | |
Layout Editor Software | LayoutEditor | NA | https://layouteditor.com/ |
Layout Editor Software | Klayout | NA | https://www.klayout.de/ |
L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
LIF | Millipore | ESG1107 | |
MEM NEAA | Gibco | 11140-035 | |
mESC Culture medium | NA | NA | GMEM 10% FCS 100 U/ml LIF 100 nM 2-mercaptoethanol 1× non-essential amino acids, 2 mM L- glutamine 1 mM sodium pyruvate |
NH4Cl 50mM | Sigma | 9718 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment |
PBS (immunostaining) | Sigma | P4417 | Dilute in 200ml of ddH2O |
PBS (tissue culture) | Gibco | 11140-035 | |
Plastic slides | Ibidi | IB-10813 | |
Poloxamer 407 | Sigma | P2443 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | P36930 | |
Sodium Azide | Sigma | 8591 | CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
TritonX-100 | Sigma | T8532 | |
Trypsin | Gibco | 25200056 | |
UVO cleaner | Jetlight, USA | 42-220 | CAUTION: Follow manufacturer’s safety recommendations |
Washing Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 In PBS |