यहाँ प्रस्तुत विधि मात्रात्मक इमेजिंग के साथ micropatterning का उपयोग करता है स्तनधारी संस्कृतियों के भीतर स्थानिक संगठन प्रकट करते हैं. तकनीक एक मानक सेल जीव विज्ञान प्रयोगशाला में स्थापित करने के लिए आसान है और इन विट्रो में पैटर्न का अध्ययन करने के लिए एक पथीय प्रणाली प्रदान करता है।
जीव विज्ञान में एक मौलिक लक्ष्य को समझने के लिए कैसे पैटर्न विकास के दौरान उभरने है. कई समूहों ने दिखाया है कि पैटर्न इन विट्रो में प्राप्त किया जा सकता है जब स्टेम सेल स्थानिक micropatterns पर सीमित कर रहे हैं, इस प्रकार प्रयोगात्मक मॉडल जो की पहचान करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान की स्थापना, इन विट्रो में, जैविक के मौलिक सिद्धांतों संगठन.
यहाँ हम पद्धति के अपने कार्यान्वयन का वर्णन. हम यह आसान एक मानक सेल जीव विज्ञान प्रयोगशाला में विधि स्थापित करने के लिए बनाने के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता को कम करने के लिए एक फोटो-पैटर्निंग तकनीक अनुकूलित। हम भी एक मुक्त, खुला स्रोत और छवि विश्लेषण ढांचे को स्थापित करने के लिए आसान विकसित करने के लिए ठीक मानक आकार और आकार की कालोनियों के भीतर कोशिकाओं के उप आबादी की अधिमानी स्थिति को मापने के लिए. इस विधि यह भी कोशिकाओं के प्रतीत होता है अव्यवस्थित आबादी में पैटर्न घटनाओं के अस्तित्व को प्रकट करने के लिए संभव बनाता है. तकनीक मात्रात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और एक दिया पैटर्न प्रक्रिया पर, पर्यावरण के प्रभावों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, शारीरिक संकेत या अंतर्जात संकेतन), .
स्तनधारी प्रणालियों में, पैटर्न कोशिकाओं के सामूहिक व्यवहार की एक आकस्मिक संपत्ति है और इसलिए, पैटर्न इन विट्रो में फार्म कर सकते हैं अगर उचित संकेत कोशिकाओं को प्रदान की जाती हैं1,2,3,4, 5 , 6. कोशिकाओं की आंतरिक क्षमता को प्रकट करने का एक तरीका यह है कि कोशिकाओं को परिभाषित आकृतियों और आकारोंकेसमूह/ . एक तकनीक जो इस को सक्षम बनाती है वह माइक्रोपैटर्निंग11है । माइक्रोपैटर्निंग से उस स्थान को ठीक से परिभाषित करना संभव हो जाता है जहां सतह पर बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) अणु जमा किए जाते हैं। यह, बारी में जहां कोशिकाओं का पालन कर सकते हैं और इसलिए नियंत्रित करता है कि कैसे कोशिकाओं स्थानिक रूप से व्यवस्थित dictates.
माइक्रोपैटर्निंग कई अनुप्रयोगों के साथ एक तकनीक है, उदाहरण के लिए, micropatterning भेदभाव12से पहले प्रारंभिक स्थितियों के मानकीकरण सक्षम बनाता है. महत्वपूर्ण बात, micropaterning यह आसानी से आकार, आकार और सेल कालोनियों के अंतराल को नियंत्रित करने के लिए संभव बनाता है और इस संपत्ति morphogen या शारीरिक संकेतों के लिए कोशिकाओं की सामूहिक प्रतिक्रिया पूछताछ करने के उद्देश्य से प्रयोगों वसीयत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है7 , 8 , 10 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
अनेक सूक्ष्मपैटर्न विधियों को11विकसित किया गया है . फोटोपैटर्न तकनीक शायद सबसे आसान तरीकेसे 18स्थापित कर रहे हैं . इन दृष्टिकोणों में परिशुद्धता का भी लाभ होता है क्योंकि उनका उपयोग एकल कोशिकाओं18,19,20के आकार को नियंत्रित करने के लिए किया जा सकता है . हालांकि, वे भी एक स्पिन कोटर, एक प्लाज्मा कक्ष और एक UVO (यूवी-ओजोन) क्लीनर जो आम तौर पर मानक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध नहीं हैं सहित महंगे विशेष उपकरणों की आवश्यकता है. तकनीक को अपनाने की सुविधा के लिए, हम प्रोटोकॉल अनुकूलित केवल UVO दीपक की आवश्यकता है. हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लास्टिक स्लाइड जो कैंची के साथ या वांछित प्रारूप करने के लिए एक छेद पंच के साथ काटा जा सकता है से शुरू करते हैं।
माइक्रोपैटर्न की एक महत्वपूर्ण उपयोगिता कई प्रतिकृतिओं में अलग-अलग कालोनियों की तुलना करने के लिए कालोनियों के मानकीकरण की क्षमता है। यह यह पूछने के लिए संभव बनाता है कि इन कालोनियों के भीतर पैटर्न गठन किस हद तक पुन: उत्पादन योग्य है, और उन कारकों का पता लगाने के लिए जो पैटर्निंग प्रक्रिया की मजबूती को प्रभावित करते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि कई मानकीकृत कालोनियों में “औसत” पैटर्न का परिमाणीकरण भी पैटर्निंग प्रक्रियाओं को प्रकट कर सकता है जो अन्यथा स्पष्ट नहीं होगा। मानकीकृत कालोनियों पर पैटर्न की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम होने का लाभ प्रोटीन अभिव्यक्ति को सही ढंग से मापने में सक्षम होने पर निर्भर करता है, आदर्श रूप से एकल सेल स्तर पर। हालांकि, micropatterns पर कोशिकाओं अक्सर कसकर पैक कर रहे हैं, उन्हें उच्च सटीकता के साथ खंड करने के लिए मुश्किल बना. कक्ष भी अक्सर खुद को दो आयामों के बजाय तीन में व्यवस्थित करते हैं, और विभाजन के दौरान तीन-आयामी (3D) जानकारी का पता लगाना और उसे संरक्षित करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है. एक बार कोशिकाओं को सफलतापूर्वक विभाजित किया गया है, परिणामी डेटासेट से पैटर्न जानकारी निकालने के लिए अभिकलन विधियों की आवश्यकता होती है।
हमने इन समस्याओं को दूर करने में मदद करने के लिए विभाजन और छवि विश्लेषण उपकरण विकसित किए हैं। इस विश्लेषण विधि केवल स्वतंत्र और मुक्त स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है और कमांड लाइन या प्रोग्रामिंग को लागू करने के ज्ञान की आवश्यकता नहीं है. यहाँ विधि को समझाने के लिए हम माउस भ्रूणीय तने (एमईएस) कोशिकाओं का प्रयोग करते हैं जो स्वतः ही प्रारंभिक विभेदन ब्रैकीयूरी (टीबरा)21,22के मार्कर को व्यक्त करती हैं। जबकि कोई स्पष्ट स्थानिक व्यवस्था नेत्रहीन पता लगाने योग्य है, विधि कालोनियों में टी + कोशिकाओं की अधिमानी स्थिति के एक नक्शे के निर्माण की अनुमति देता है. हम यह भी बताते हैं कि Id1 व्यक्त कोशिकाओं की एक अधिमानी स्थानीयकरण के अभाव के साथ Tbra पैटर्न विरोधाभासों, हड्डी morphogenetic प्रोटीन (BMP) मार्ग23का एक सीधा readout . हम भी विधि की वर्तमान सीमाओं पर चर्चा और कैसे इस तकनीक अन्य प्रयोगात्मक प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
यहाँ हम कोशिकाओं की संस्कृतियों में आकस्मिक पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन. एक सरलीकृत micropaterning दृष्टिकोण सेल कालोनियों के आकार और आकार के मानकीकरण के लिए प्रयोग किया जाता है, और हम छवि विश्लेषण उपकरण और आर लिपियों कि इन कालोनियों के भीतर पैटर्न का पता लगाने और परिमाणीकरण सक्षम प्रस्तुत करते हैं.
पाइप लाइन हम प्रस्ताव एक पहले से प्रकाशित विधि31 जहां लेखकों संस्कृति की स्थिति पर ध्यान केंद्रित के साथ कुछ हद तक समान है, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध micropatterns का उपयोग कर, ईएससी कालोनियों में reproduible रोगाणु परत गठन प्राप्त करने के लिए इन विट्रो में प्रारंभिक गैस्ट्रेशन घटनाओं का अध् ययन हमारा उद्देश्य अधिक इन विट्रो में पैटर्न गठन की खोज के लिए एक सामान्य योग्य पाइप लाइन प्रदान करने की दिशा में केंद्रित है जहां कोशिकाओं के सामूहिक संगठन केवल सांख्यिकीय विश्लेषण के बाद स्पष्ट हो सकता है. इस कारण से, हम एक मजबूत छवि विश्लेषण कार्यप्रवाह प्रदान करते हैं जो कई कालोनियों पर 3 डी अंतरिक्ष में परमाणु स्थिति की सटीक पहचान और विश्लेषण को सक्षम करता है (इस के ‘लाभ और सीमाओं को भी देखें’ इस खंड चर्चा)। हम भी एक सरल घर में micropaterning दृष्टिकोण है जो लंबे समय में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समाधान के लिए एक और अधिक लचीला और सस्ता विकल्प प्रदान करता है जो हमें उम्मीद है कि समुदाय के लिए उपयोगी हो जाएगा विकसित करने का फैसला किया.
अंत में, हम ध्यान दें कि इस पांडुलिपि के संशोधन के दौरान, हमारे आर लिपियों के समान इन विट्रो में पैटर्न के विश्लेषण के लिए एक नया पैकेज32जारी किया गया है. इस नए पैकेज इनपुट जो उच्च थ्रूपुट इमेजिंग प्लेटफार्मों से प्राप्त किया जा सकता है के रूप में सेल सुविधाओं की तालिकाओं को स्वीकार करता है. हमें विश्वास है कि हमारे प्रोटोकॉल के चरण 7 पर उत्पन्न नाभिक सुविधाओं की तालिका सिद्धांत रूप में इस नए पैकेज के लिए एक इनपुट के रूप में सेवा कर सकता है, हालांकि हम इस संभावना खुद का परीक्षण नहीं किया है.
अन्य सेल प्रकार और कॉलोनी geometries के लिए विधि की अनुकूलनशीलता
हम सीरम की उपस्थिति में pluripotent कोशिकाओं की संस्कृतियों में mesodermal प्रतिलेखन कारकों के उद्भव के अध्ययन के संदर्भ में इस दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं. हालांकि, विधि आसानी से अन्य सेल प्रकार के लिए और सीरम मुक्त संस्कृतियों के लिए अनुकूल है, हालांकि यह ECM/poloxamer 407 सांद्रता का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है (एक समस्या निवारण गाइड के लिए परीक्षण सांद्रता और तालिका 2 के लिए तालिका 1 देखें). विधि भी micropatterns के बड़े या छोटे आकार के लिए और उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुसार आकार की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हालांकि, विधि की स्थापना करते समय, यह पता है कि नहीं सभी आकार / सेल प्रकार संयोजन इष्टतम हैं महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, एमईएससी ई-कैडेरिन33,34 के उच्च स्तर को व्यक्त करता है जिससे इन कोशिकाओं को ईसीएम से रहित क्षेत्रों में फैले सामूहिक संरचनाओं का निर्माण करने में सक्षम बनाया जा सकता है। इन कोशिकाओं को सख्ती से तेज कोण के साथ geometries का पालन नहीं करते हैं या कि पैटर्न में छोटे छेद शामिल हैं. उदाहरण के लिए ध्यान दीजिए कि चित्र 3ठकी अंगूठी पर कोशिकाएँ केंद्रीय क्षेत्र को उपनिवेशित करने की प्रक्रिया में हैं। हमारे हाथों में एक छोटे केंद्रीय क्षेत्र एमईएससी को रिंग के आकार की कालोनियों के रूप में मजबूर नहीं किया। इसलिए यह अत्यधिक geometries की विविधता शामिल करने के लिए सिफारिश की है, जबकि photomask डिजाइन करने के लिए परीक्षण और इष्टतम आकार और curvatures जो पसंद के सेल प्रकार के लिए उपयुक्त हो जाएगा की पहचान करने में सक्षम हो.
एक अन्य महत्वपूर्ण कारक को ध्यान में रखना प्रयोग की लंबाई और कोशिकाओं के प्रसार की दर है. कुछ तेजी से बढ़ कोशिका प्रकार के लिए (pluripotent कोशिकाओं सहित) यह कई दिनों में micropatterns पर कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए मुश्किल हो सकता है (MESC के लिए तीन दिन एक अधिकतम है). इसके अलावा, माइक्रोपैटर्न पर कोशिकाओं का बीज हमेशा हर कॉलोनी के लिए इष्टतम रूप से नहीं होता है, इसलिए अतिरिक्त मात्रा में कालोनियों के बीज लेने की सलाह दी जाती है।
लाभ और पैटर्न का पता लगाने विधि की सीमाओं
विधि का एक विशेष लाभ कई प्रतिकृति कालोनियों से छवि विश्लेषण परिणामों के संयोजन से “औसत” पैटर्न का पता लगाने की क्षमता है (चित्र 5)। यह पैटर्न घटनाओं है कि व्यक्तिगत कालोनियों के निरीक्षण से स्पष्ट नहीं कर रहे हैं प्रकट कर सकते हैं. इस ‘औसत’ दृष्टिकोण का एक नुकसान यह है कि यह दोहराव पैटर्न के कुछ प्रकार याद कर सकते हैं, उदाहरण के लिए छोटे धब्बे या संकीर्ण धारियों. हालांकि, पैटर्न के इन प्रकार के बजाय ध्यान से चुना पैटर्न आकार8के संयोजन के साथ पता चला जा सकता है. इसके अलावा, यहाँ वर्णित छवि विश्लेषण पाइपलाइन दोनों एकल सेल और कॉलोनी संकल्प पर मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है जो अंतर-कोलोनी परिवर्तनशीलता के स्तर की जांच करने की संभावना प्रदान करता है (चित्र 5) या एकाधिक पर पड़ोसी विश्लेषण करने के लिए तराजू10|
औसत विधि का एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह पता लगाने चैनलों के उपलब्ध फ्लोरोफोर द्वारा सीमित किया जा रहा बिना कई मार्करों के अधिमानी स्थान नक्शा करने का अवसर प्रदान करता है. वास्तव में, हालांकि हम यहाँ प्रस्तुत काम में भेदभाव के केवल दो मार्करों का उपयोग करते हैं, कालोनियों के मानकीकरण और निकालने की क्षमता “औसत” पैटर्न यह संभव आदेश में कालोनियों के विभिन्न सेट से वितरण नक्शे की तुलना करने के लिए बनाता है एक दूसरे को मार्करों के सामान्यीकृत स्थानिक संबंधों को प्रकट करने के लिए.
इसके अलावा, हालांकि हमारा ध्यान यहाँ भेदभाव के मार्करों का अध्ययन करने के लिए किया गया है, विश्लेषण विधि अन्य जैविक प्रक्रियाओं जिसके लिए परमाणु मार्करों उपलब्ध हैं अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. उदाहरण के लिए एक प्रवाह सर्वव्यापकता सेल चक्र सूचक35 (FUCCI) युक्त सेल लाइन के micropaterning यह अध्ययन करने के लिए कैसे कॉलोनी स्तर ज्यामिति समूह में सेल चक्र की घटनाओं को प्रभावित कर सकते हैं संभव बनाना होगा.
भविष्य के निर्देश
विधि मध्यम थ्रूपुट छवि विश्लेषण के लिए अनुकूल है, तथापि, छवि अधिग्रहण वर्तमान में पूरी तरह से स्वचालित नहीं है और बहुत बड़े प्रयोगों के लिए सीमित हो सकता है. कालोनियों की नियमित व्यवस्था से यह संभव हो जाना चाहिए कि एकल सेल औसत20के लिए विकसित की गई सेवाओं के समान ही पूरी तरह से स्वचालित अधिग्रहण दिनचर्या का निर्माण किया जा सके . हालांकि, क्योंकि एक कॉलोनी छवि के लिए आवश्यक क्षेत्र का आकार बड़ा है, संभवतः मोज़ेक की आवश्यकता होती है, और क्योंकि कालोनियों तीन आयामी हैं, यह केवल प्रासंगिक कालोनियों इमेजिंग द्वारा दोनों डेटासेट आकार और अधिग्रहण समय को कम करने के लिए अत्यधिक वांछनीय है। इसलिए, भविष्य के प्रयासों प्रासंगिक कालोनियों की पहचान करने और प्रत्येक नमूने के लिए इमेजिंग निर्देशांक अनुकूलन करने में सक्षम एक ‘बुद्धिमान’ माइक्रोस्कोप विकसित करने के लिए समर्पित किया जा सकता है। यह न केवल समय और प्रयास को कम करेगा बल्कि संभावित ऑपरेटर पूर्वाग्रहों को भी रोकेगा।
विश्लेषण पाइपलाइनों को भी उपयोगकर्ता द्वारा उठाए जाने वाले चरणों की संख्या को कम करके और अधिक कुशल बनाया जा सकता है। हम एक पाइप लाइन निर्माण तंत्र का निर्माण करने की योजना है और हमारे सॉफ्टवेयर में सीधे आर एकीकृत करने के लिए (देखें भी मुद्दों pickcells-api]3 और pickcells-rजावा [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues] के मुद्दे पर नजर रखने में. विश्लेषण प्रक्रिया का पूर्ण स्वचालन समय और प्रयास को कम करने और संभावित उपयोगकर्ता त्रुटियों को सीमित करेगा.
अंत में, हम ध्यान दें कि हमारे विश्लेषण विधि अभी तक पूरी तरह से सेलुलर पैटर्न के गतिशील प्रकृति पर कब्जा नहीं करता है. कुछ सीमित गतिशील जानकारी स्नैपशॉट छवियों8,10,36की एक समय श्रृंखला की जांच करके निकाला जा सकता है. हालांकि, सेल आबादी के इतिहास को रिकॉर्ड करने में सक्षम होने के नाते अत्यधिक वांछनीय है अगर हम बेहतर समझ कैसे पैटर्न उभर करना चाहते हैं. एक सीमा यह है कि 3 डी घनी कोशिकाओं की जनसंख्या में अलग – अलग कोशिकाओं की सही ट्रैकिंग एक बहुत ही चुनौतीपूर्ण कार्यबनीहुई है . हमारी कोशिका का पता लगाने की विधि परमाणु लिफाफे का उपयोग करती है और घने और अतिव्यापन वाले कोशिकाओं की संख्या28पर विशेष रूप से अच्छी तरह से कार्य करती है . परमाणु लिफाफे के लाइव पत्रकारों को आसानी से उपलब्ध हैं28,38 और micropaterning तकनीक का एक लाभ यह है कि यह लंबी अवधि इमेजिंग के दौरान देखने के क्षेत्र के बाहर जाने से कोशिकाओं को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कुल मिलाकर, हमें विश्वास है कि कोशिकाओं की स्वचालित ट्रैकिंग हाल ही में स्थापित उपकरण28,39,40 का एक संयोजन का उपयोग कर प्राप्त किया जाएगा और यह मौलिक में नई अंतर्दृष्टि लाना चाहिए कि स्व-संगठन के सिद्धांत।
The authors have nothing to disclose.
यह काम एक सर हेनरी वेलकम पोस्ट-डॉक्टरल फेलोशिप (WT100133 से G.B.), एक वेलकम ट्रस्ट सीनियर फेलोशिप (WT103789AIA से S.L.) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और एक वेलकम ट्रस्ट पीएचडी छात्रता को (108906/ हम भी photopaterning तकनीक अनुकूलन पर उनकी सलाह के लिए डॉ मैनुअल Thery के आभारी हैं.
2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | handle in fume hood |
1× Master quartz anti-reflective chromium photomask | Toppan Photomask | Custom design | |
24-well plates | Corning | 3526 | |
4-well plates | Nunclon Delta | 176740 | |
5% Donkey Serum | Sigma | D9663 | |
Anti Nuclear pore complex | Abcam | ab24609 | Mouse monoclonal, use 1:1000 |
Anti-Id1 | Biocheck | 37-2 | Rabbit polyclonal, use 1:200 |
Anti-Lamin B1 | Abcam | ab16048 | Rabbit polyclonal, use 1:1000 |
Anti-Tbra | R&D | AF2085 | Goat ployclonal, use 1:400 |
Blocking Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 5% Donkey Serum 0.003% Sodium Azide In PBS |
CGR8 mESC | NA | NA | Reference: Mountford et al. PNAS, 1994 |
Fixation solution | NA | NA | 4% PFA diluted in washing solution |
Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance |
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma | G5154 | |
Laboratory Film | VWR | 291-1212 | |
Layout Editor Software | LayoutEditor | NA | https://layouteditor.com/ |
Layout Editor Software | Klayout | NA | https://www.klayout.de/ |
L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
LIF | Millipore | ESG1107 | |
MEM NEAA | Gibco | 11140-035 | |
mESC Culture medium | NA | NA | GMEM 10% FCS 100 U/ml LIF 100 nM 2-mercaptoethanol 1× non-essential amino acids, 2 mM L- glutamine 1 mM sodium pyruvate |
NH4Cl 50mM | Sigma | 9718 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment |
PBS (immunostaining) | Sigma | P4417 | Dilute in 200ml of ddH2O |
PBS (tissue culture) | Gibco | 11140-035 | |
Plastic slides | Ibidi | IB-10813 | |
Poloxamer 407 | Sigma | P2443 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | P36930 | |
Sodium Azide | Sigma | 8591 | CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
TritonX-100 | Sigma | T8532 | |
Trypsin | Gibco | 25200056 | |
UVO cleaner | Jetlight, USA | 42-220 | CAUTION: Follow manufacturer’s safety recommendations |
Washing Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 In PBS |