Metoden som presenteres her bruker micropatterning sammen med kvantitativ bildebehandling for å avdekke romlig organisering innen pattedyr kulturer. Teknikken er enkel å etablere i et standard cellebiologi laboratorium og tilbyr et medgjørlig system for å studere mønstre in vitro.
Et grunnleggende mål i biologi er å forstå hvordan mønstrene dukker opp under utviklingen. Flere grupper har vist at mønstre kan oppnås in vitro når stamceller er romlig begrenset til micropatterns, og dermed sette opp eksperimentelle modeller som tilbyr unike muligheter til å identifisere, in vitro, de grunnleggende prinsippene for biologisk Organisasjon.
Her beskriver vi vår egen implementering av metodikken. Vi tilpasset et foto mønster teknikk for å redusere behovet for spesialisert utstyr for å gjøre det enklere å etablere metoden i et standard cellebiologi laboratorium. Vi har også utviklet en gratis, åpen kildekode og enkel å installere bildeanalyse rammeverk for å presist måle fortrinnsrett posisjonering av Sub-populasjoner av celler i kolonier av standard former og størrelser. Denne metoden gjør det mulig å avdekke eksistensen av mønstre hendelser selv i tilsynelatende uorganisert populasjoner av celler. Teknikken gir kvantitativ innsikt og kan brukes til å koble påvirkninger av miljøet (for eksempel fysiske signaler eller endogene signalering), på en gitt mønster prosess.
I pattedyr systemer, er mønstre en emergent eiendom av den kollektive atferden til celler og så, mønstre kan danne in vitro hvis hensiktsmessig Stikkordene er gitt til cellene1,2,3,4, 5 andre priser , 6. en måte å avdekke den iboende evne til cellene å selv-organisere in vitro er å tvinge cellene til å danne grupper/kolonier av en definert former og størrelser7,8,9,10 . En teknikk som gjør at dette er micropatterning11. Micropatterning gjør det mulig å presist definere plasseringen der ekstracellulære Matrix (ECM) molekyler er avsatt på en overflate. Dette, i sin tur dikterer hvor cellene kan overholde og derfor styrer hvordan cellene romlig organisere.
Micropatterning er en teknikk med mange anvendelser, for eksempel, Micropatterning muliggjør standardisering av innledende forhold før differensiering12. Viktigere, micropatterning gjør det mulig å enkelt kontrollere størrelse, form og avstand av celle kolonier og denne eiendommen kan brukes til å utarbeide eksperimenter som tar sikte på å forhører den kollektive responsen av cellene til morphogen eller fysiske signaler7 , 8 på alle , 10 andre , 13 på alle , 14 priser og priser , 15 priser og , 16 flere , 17av dem.
Flere micropatterning metoder har blitt utviklet11. Photopatterning teknikker er kanskje den enkleste metodene for å etablere18. Disse tilnærmingene har også fordelen av presisjon som de kan brukes til å styreformen av enkeltceller18,19,20. Men de krever også dyrt spesialisert utstyr inkludert en spin elektrostatisk, en plasma kammer og en UVO (UV-ozon) renere som vanligvis ikke er lett tilgjengelig i standard biologi laboratorier. For å lette innføringen av teknikken, tilpasset vi protokollen til å kreve bare UVO lampe. Vi starter fra kommersielt tilgjengelige plast skred som kan kuttes med saks eller med et hull punch til ønsket format.
En viktig nytte av micropatterns er muligheten til å standardisere kolonier for å sammenligne individuelle kolonier på tvers av flere replikeres. Dette gjør det mulig å spørre i hvilken grad mønsteret dannes innenfor disse koloniene er reproduserbar, og å utforske faktorer som påvirker robusthet av mønsteret prosessen. Viktigere, kvantifisering av “gjennomsnitt” mønstre på tvers av flere standardiserte kolonier kan også avdekke mønstre prosesser som ellers ikke ville være synlig. Fordelen med å kunne kvantifisere mønstre på standardiserte kolonier avhenger av å være i stand til å nøyaktig måle protein uttrykk, ideelt på enkelt cellenivå. Imidlertid er celler på micropatterns ofte tett pakket, noe som gjør dem vanskelige å segmentere med høy nøyaktighet. Celler også ofte organisere seg i tre enn to dimensjoner, og det kan være utfordrende å oppdage og bevare tredimensjonale (3D) informasjon under segmentering. Når cellene er segmentert, er beregningsmetoder nødvendig for å trekke ut mønster informasjon fra de resulterende datasettene.
Vi har utviklet segmentering og bildeanalyse verktøy for å bidra til å overvinne disse problemene. Denne analysemetoden bruker bare fri og åpen kildekode programvare og krever ikke kjennskap til kommandolinje eller programmering for å implementere. For å illustrere metoden her, bruker vi musen embryonale stammen (mES) celler som spontant uttrykker en markør for tidlig differensiering brachyury (Tbra)21,22. Selv om ingen tilsynelatende romlig ordning er visuelt synlig, gjør at metoden etableringen av et kart over fortrinnsrett posisjonering av T + celler i kolonier. Vi viser også at Tbra mønster kontraster med fravær av en fortrinnsrett lokalisering av cellene uttrykker Id1, en direkte avlesning av benet Morfogenetiske protein (BMP) Pathway23. Vi diskuterer også gjeldende begrensninger av metoden og hvordan denne teknikken kan tilpasses andre eksperimentelle systemer.
Her beskriver vi en metode for å analysere emergent mønster i kulturer av celler. En forenklet micropatterning tilnærming brukes for standardisering form og størrelse, og vi presenterer bildeanalyse verktøy og R-skript som muliggjør påvisning og kvantifisering av mønstre innenfor disse koloniene.
Rørledningen vi foreslår er lik en viss grad med en tidligere publisert metode31 der forfatterne fokus på kultur forhold, ved hjelp av kommersielt tilgjengelige micropatterns, for å oppnå reproduserbar bakterie lag FORMASJON i ESC kolonier for studie av tidlige gastrulation hendelser in vitro. Vårt mål er mer fokusert mot å gi en generaliserings rørledning for oppdagelsen av mønster dannelse in vitro der den kollektive organiseringen av cellene kan bare bli tydelig etter statistisk analyse. Av denne grunn gir vi en robust bildeanalyse arbeidsflyt som muliggjør nøyaktig identifisering og analyse av kjernefysisk posisjon i 3D-rom over flere kolonier (se også “fordel og begrensninger i mønster gjenkjennings metoden” i denne diskusjonen). Vi har også besluttet å utvikle en enkel in-House micropatterning tilnærming som tilbyr et mer fleksibelt og billigere alternativ til kommersielt tilgjengelige løsninger på lang sikt som vi håper vil være nyttig for samfunnet.
Til slutt, vi oppmerksom på at under revisjonen av dette manuskriptet, en ny pakke for analyse av mønstre in vitro lik vår R skript har blitt utgitt32. Denne nye pakken godtar tabeller av celle funksjoner som input som kan fås fra høy gjennomstrømming Imaging plattformer. Vi tror at tabellen av kjerner funksjoner generert på trinn 7 i vår protokoll kunne i prinsippet tjene som en inngang til denne nye pakken selv om vi ikke har testet denne muligheten selv.
Tilpasning av metoden til andre celletyper og koloni geometri
Vi presenterer denne tilnærmingen i sammenheng med å studere fremveksten av mesodermal transkripsjon faktorer i kulturer av pluripotent celler i nærvær av serum. Metoden kan imidlertid lett tilpasses andre celletyper og serum frie kulturer, selv om det er nødvendig å optimalisere ECM/poloksamer 407 konsentrasjoner (se tabell 1 for testede konsentrasjoner og tabell 2 for en feilsøkingsveiledning). Metoden kan også tilpasses til større eller mindre størrelser av micropatterns og til et bredt spekter av former i henhold til behovene til brukeren. Men mens du etablerer metoden, er det viktig å være klar over at ikke alle form/celle type kombinasjoner er optimale. For eksempel mESC Express høye nivåer av E-cadherin33,34 slik at disse cellene til å danne kollektive strukturer som spenner over områder som er blottet for ECM. Disse cellene følger ikke strengt geometri med skarpe vinkler eller som inneholder små hull i mønsteret. Legg merke til for eksempel at i ringen av figur 3b, cellene er i ferd med å kolonisere det sentrale området. I våre hender et mindre sentralt område ikke tvinge mESC å danne ring-formede kolonier. Det er derfor sterkt anbefalt å inkludere et mangfold av geometri mens designe photomask å kunne teste og identifisere de optimale størrelser og kurvaturer som vil være egnet for cellen type valg.
En annen viktig faktor å ta hensyn til er lengden på eksperimentet og spredning rate av cellene. For noen raskt voksende celletyper (inkludert pluripotent celler) kan det være vanskelig å opprettholde celler på micropatterns over mange dager (for mESC tre dager er en maksimum). Også seeding celler på micropatterns ikke alltid oppstår optimalt for hver koloni, så det er tilrådelig å frø et overskudd av kolonier for å ha reservedeler.
Fordeler og begrensninger i mønster gjenkjennings metoden
En spesiell fordel med metoden er muligheten til å oppdage “gjennomsnitt” mønstre ved å kombinere bildeanalyse resultater fra flere replikere kolonier (figur 5). Dette kan avdekke mønster hendelser som ikke er tydelige fra inspeksjon av de enkelte koloniene. En ulempe med denne “snitt” tilnærming er at det kan gå glipp av visse typer repeterende mønstre, for eksempel små flekker eller smale striper. Imidlertid kan disse typer mønster i stedet bli avslørt med en kombinasjon av nøye utvalgte mønster størrelser8. I tillegg gir bildeanalyse rørledningen som beskrives her, kvantitative data i både enkelt celle-og koloni oppløsning, og gir muligheten til å undersøke nivået av variasjon mellom kolonien (figur 5) eller for å utføre nabo analyser på flere skala10.
En annen viktig fordel med gjennomsnittet metoden er at den gir mulighet til å kartlegge fortrinnsrett plasseringen av mange markører uten å være begrenset av tilgjengelige fluorophores av deteksjon kanaler. Faktisk, selv om vi gjør bruk av bare to markører for differensiering i arbeidet som presenteres her, evnen til å standardisere kolonier og ekstrakt “gjennomsnitt” mønstre gjør det mulig å sammenligne fordelingen kartene fra ulike sett av kolonier sammen for å avdekke generalisert romlige forhold av markører til hverandre.
Videre, selv om vårt fokus her har vært å studere markører for differensiering, kan analysemetoden utvides til å studere andre biologiske prosesser som kjernefysiske markører er tilgjengelige. For eksempel micropatterning av en cellelinje som inneholder en fluorescens ubiqitinering celle syklus indikator35 (FUCCI) ville gjøre det mulig å studere hvordan kolonien nivå geometri kan påvirke celle syklus hendelser i gruppen.
Fremtidige retninger
Metoden er mottagelig for middels gjennomstrømming bildeanalyse, men bildet oppkjøpet er foreløpig ikke helautomatisk og kan bli begrensende for svært store eksperimenter. Den vanlige ordninger av kolonier bør gjøre det mulig å lage fullt automatisert oppkjøpet rutiner som ligner på det som er utviklet for enkelt celle gjennomsnitt20. Men fordi størrelsen på feltet som kreves for å avbilde en koloni er stor, muligens krever mosaicking, og fordi koloniene er tredimensjonale, er det svært ønskelig å redusere både datasett størrelse og oppkjøpet tid ved Imaging bare relevante kolonier. Derfor kan fremtidig innsats være dedikert til å utvikle en “intelligent” mikroskop i stand til å identifisere relevante kolonier og tilpasse Imaging koordinater til hver prøve. Dette vil ikke bare redusere tid og krefter, men også hindre potensielle operatøren fordommer.
Analyse rørledningene kan også gjøres mer effektive ved å redusere antall trinn som brukeren må utføre. Vi har planer om å bygge en rørlednings bygging mekanisme og å integrere R direkte inn i vår programvare (se også problemer pickcells-API # 3 og pickcells-rjava # 1 i problemet tracker av våre kode repositories [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). Den fullstendige automatisering av analysen prosedyren vil redusere tid og krefter og begrense potensielle bruker feil.
Til slutt, vi oppmerksom på at vår analysemetoden ennå ikke fullt ut fange den dynamiske naturen av cellulære mønstre. Noe begrenset dynamisk informasjon kan trekkes ut ved å undersøke en gang-serien av Snapshot bilder8,10,36. Men å kunne registrere historien til cellen befolkningen er svært ønskelig hvis vi ønsker å bedre forstå hvordan mønstre framgår. En begrensning er at nøyaktig sporing av individuelle celler i en 3D tett celle befolkning fortsatt en svært utfordrende oppgave37. Vår celle deteksjons metode bruker kjernefysisk konvolutt og utfører spesielt godt på tette og overlappende celle populasjoner28. Live journalister av kjernefysiske konvolutten er lett tilgjengelig28,38 og en fordel med micropatterning teknikken er at den kan brukes til å hindre at cellene beveger seg utenfor synsfeltet under langsiktig Imaging. Generelt er vi sikre på at automatisert sporing av celler vil være oppnåelig ved hjelp av en kombinasjon av nylig etablerte verktøy28,39,40 og at dette skulle bringe ny innsikt i de grunnleggende prinsipper for selvorganisering.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av en Sir Henry Wellcome post-doktor Fellowship (WT100133 til G.B.), en Wellcome Trust senior Fellowship (WT103789AIA til S.L.), og en Wellcome Trust PhD studentship til (108906/Z/15/Z til D.W.). Vi er også takknemlige for Dr Manuel thery for hans råd om tilpasning av photopatterning teknikk.
2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | handle in fume hood |
1× Master quartz anti-reflective chromium photomask | Toppan Photomask | Custom design | |
24-well plates | Corning | 3526 | |
4-well plates | Nunclon Delta | 176740 | |
5% Donkey Serum | Sigma | D9663 | |
Anti Nuclear pore complex | Abcam | ab24609 | Mouse monoclonal, use 1:1000 |
Anti-Id1 | Biocheck | 37-2 | Rabbit polyclonal, use 1:200 |
Anti-Lamin B1 | Abcam | ab16048 | Rabbit polyclonal, use 1:1000 |
Anti-Tbra | R&D | AF2085 | Goat ployclonal, use 1:400 |
Blocking Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 5% Donkey Serum 0.003% Sodium Azide In PBS |
CGR8 mESC | NA | NA | Reference: Mountford et al. PNAS, 1994 |
Fixation solution | NA | NA | 4% PFA diluted in washing solution |
Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance |
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma | G5154 | |
Laboratory Film | VWR | 291-1212 | |
Layout Editor Software | LayoutEditor | NA | https://layouteditor.com/ |
Layout Editor Software | Klayout | NA | https://www.klayout.de/ |
L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
LIF | Millipore | ESG1107 | |
MEM NEAA | Gibco | 11140-035 | |
mESC Culture medium | NA | NA | GMEM 10% FCS 100 U/ml LIF 100 nM 2-mercaptoethanol 1× non-essential amino acids, 2 mM L- glutamine 1 mM sodium pyruvate |
NH4Cl 50mM | Sigma | 9718 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment |
PBS (immunostaining) | Sigma | P4417 | Dilute in 200ml of ddH2O |
PBS (tissue culture) | Gibco | 11140-035 | |
Plastic slides | Ibidi | IB-10813 | |
Poloxamer 407 | Sigma | P2443 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | P36930 | |
Sodium Azide | Sigma | 8591 | CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
TritonX-100 | Sigma | T8532 | |
Trypsin | Gibco | 25200056 | |
UVO cleaner | Jetlight, USA | 42-220 | CAUTION: Follow manufacturer’s safety recommendations |
Washing Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 In PBS |