Den metod som presenteras här använder micropatterning tillsammans med kvantitativ avbildning för att avslöja rumslig organisation inom däggdjurs kulturer. Tekniken är lätt att etablera i ett standard cellbiologi laboratorium och erbjuder ett tractable system för att studera mönkning in vitro.
Ett grundläggande mål i biologi är att förstå hur mönster framträder under utvecklingen. Flera grupper har visat att mönster kan uppnås in vitro när stamceller är rumsligt begränsade till mikromönster, och därmed inrätta experimentella modeller som erbjuder unika möjligheter att identifiera, in vitro, de grundläggande principerna för biologisk organisation.
Här beskriver vi vår egen implementering av metodiken. Vi anpassade en foto-mönkning teknik för att minska behovet av specialiserad utrustning för att göra det lättare att fastställa metoden i ett standard cellbiologi laboratorium. Vi utvecklade också en fri, öppen källkod och lätt att installera bildanalys ram för att exakt mäta den förmånliga placeringen av sub-populationer av celler i kolonier av standard former och storlekar. Denna metod gör det möjligt att avslöja förekomsten av mönster händelser även i till synes oorganiserade populationer av celler. Tekniken ger kvantitativa insikter och kan användas för att frikoppla påverkan av miljön (t. ex. fysiska signaler eller endogena signalering), på en given mönjande process.
I däggdjurs system är mönster en framväxande egendom av det kollektiva beteendet hos celler och så, mönster kan bildas in vitro-om lämpliga signaler ges till cellerna1,2,3,4, ,5 , 6. ett sätt att avslöja den inneboende förmågan hos cellerna att själv organisera in vitro är att tvinga cellerna att bilda grupper/kolonier av en definierad former och storlekar7,8,9,10 . En teknik som möjliggör detta är micropatterning11. Micropatterning gör det möjligt att exakt definiera den plats där extracellulära matrix (ECM) molekyler deponeras på en yta. Detta, i sin tur dikterar där cellerna kan följa och därför styr hur celler rumsligt organisera.
Micropatterning är en teknik med många tillämpningar, till exempel micropatterning möjliggör standardisering av initiala förhållanden före differentiering12. Viktigt, micropatterning gör det möjligt att enkelt kontrollera storlek, form och avstånd av cellkolonier och denna egenskap kan användas för att utforma experiment som syftar till förhör den kollektiva reaktionen av cellerna till morphogen eller till fysiska signaler7 , 8 , 10 , 13 , fjorton , 15 , 16 , 17.
Flera micropatterning metoder har utvecklats11. Photopatterning tekniker är kanske de enklaste metoderna för att etablera18. Dessa metoder har också fördelen av precision eftersom de kan användas för att styra formen av enskilda celler18,19,20. Men de kräver också dyra specialiserad utrustning inklusive en spinn coater, en plasma kammare och en UVO (UV-ozon) renare som i allmänhet inte lätt tillgängliga i standard biologi laboratorier. För att underlätta antagandet av tekniken, anpassade vi protokollet för att kräva endast UVO lampan. Vi utgår från kommersiellt tillgängliga plast rutschbanor som kan klippas med sax eller med hålslag till önskat format.
Ett viktigt verktyg för mikromönster är möjligheten att standardisera kolonier för att jämföra enskilda kolonier över flera replikat. Detta gör det möjligt att fråga i vilken utsträckning mönster bildning inom dessa kolonier är reproducerbar, och att utforska faktorer som påverkar robustheten i mönstringsprocessen. Viktigt är att kvantifiering av “genomsnittliga” mönster över flera standardiserade kolonier också kan avslöja mönstrar processer som annars inte skulle vara uppenbara. Fördelen med att kunna kvantifiera mönkning på standardiserade kolonier beror på att kunna exakt mäta proteinuttryck, helst på en enda cellnivå. Men celler på mikromönster är ofta tätt packade, vilket gör dem svåra att segmentera med hög noggrannhet. Celler organiserar också ofta sig i tre i stället för två dimensioner, och det kan vara svårt att upptäcka och bevara tredimensionell (3D) information under segmentering. När celler har segmenterats framgångsrikt behövs beräkningsmetoder för att extrahera mönster information från de resulterande datauppsättningarna.
Vi har utvecklat segmentering och bildanalys verktyg för att hjälpa till att övervinna dessa problem. Denna analysmetod använder bara fri och öppen källkod och kräver inte kunskap om kommandoraden eller programmering för att implementera. För att illustrera metoden här, använder vi mus embryonala stem (MES) celler som spontant uttrycker en markör för tidig differentiering brachyury (TBRA)21,22. Även om ingen uppenbar rumslig arrangemang är visuellt detekterbar, metoden tillåter skapandet av en karta över preferens positionering av T + celler i kolonier. Vi visar också att TBRA mönster kontrasterar med avsaknaden av en preferens lokalisering av cellerna uttrycker Id1, en direkt avläsning av ben Morphogenetic Protein (BMP) väg23. Vi diskuterar också metodens nuvarande begränsningar och hur denna teknik kan anpassas till andra experimentella system.
Här beskriver vi en metod för att analysera framväxande mönster i cellkulturer. En förenklad micropatterning metod används för att standardisera formen och storleken på cellkolonier, och vi presenterar bildanalys verktyg och R-skript som gör det möjligt att upptäcka och kvantifiera mönster inom dessa kolonier.
Den pipeline som vi föreslår liknar i viss mån en tidigare publicerad metod31 där författarna fokuserar på odlingsförhållanden, med användning av kommersiellt tillgängliga mikromönster, för att erhålla reproducerbara köns skikt bildning i ESC-kolonier för studie av tidiga gastrulationshändelser in vitro. Vårt mål är mer inriktat mot att tillhandahålla en generaliserbar pipeline för upptäckten av mönster bildning in vitro, där den kollektiva organisationen av cellerna endast kan bli uppenbar efter statistisk analys. Av denna anledning ger vi ett robust bildanalys arbetsflöde som möjliggör korrekt identifiering och analys av nukleär position i 3D-rymden över flera kolonier (se även “fördelen och begränsningarna av mönstret detektionsmetod” i denna diskussion). Vi bestämde oss också för att utveckla en enkel in-House micropatterning strategi som erbjuder ett mer flexibelt och billigare alternativ till kommersiellt tillgängliga lösningar på lång sikt som vi hoppas kommer att vara till nytta för samhället.
Slutligen noterar vi att under översynen av detta manuskript, ett nytt paket för analys av mönster in vitro-liknande våra R-skript har släppts32. Detta nya paket accepterar tabeller med cellfunktioner som indata som kan erhållas från hög genomströmning Imaging plattformar. Vi anser att tabellen över kärnfunktioner som genereras i steg 7 i vårt protokoll i princip kan fungera som ett bidrag till detta nya paket, även om vi inte har testat denna möjlighet själva.
Metodens anpassningsbarhet till andra celltyper och kolonigeometrier
Vi presenterar denna strategi i samband med att studera uppkomsten av mesodermala transkriptionsfaktorer i kulturer av pluripotenta celler i närvaro av serum. Metoden är dock lätt att anpassa till andra celltyper och till serum fria kulturer även om det kan vara nödvändigt att optimera ECM/poloxamer 407-koncentrationerna (se tabell 1 för testade koncentrationer och tabell 2 för en felsökningsguide). Metoden kan också anpassas till större eller mindre storlekar av mikromönster och till ett brett spektrum av former beroende på användarens behov. Men medan fastställandet av metoden, är det viktigt att vara medveten om att inte alla form/celltyp kombinationer är optimala. Till exempel, mesc Express höga nivåer av E-cadherin33,34 så att dessa celler att bilda kollektiva strukturer som spänner över områden som saknar ECM. Dessa celler följer inte strikt geometrier med skarpa vinklar eller som innehåller små hål i mönstret. Observera till exempel att på ringen av figur 3b, cellerna är i färd med att kolonisera det centrala området. I våra händer tvingar ett mindre centralt område inte mESC att bilda ringformade kolonier. Det är därför starkt rekommenderat att inkludera en mångfald av geometrier samtidigt utforma photomasken att kunna testa och identifiera de optimala storlekar och krökningar som kommer att vara lämpade för celltypen av val.
En annan viktig faktor att ta hänsyn till är längden på experimentet och spridningen frekvensen av cellerna. För vissa snabbt prolifererande celltyper (inklusive pluripotenta celler) kan det vara svårt att underhålla celler på mikromönster under många dagar (för mESC tre dagar är maximalt). Också, sådd av celler på mikromönster inte alltid sker optimalt för varje koloni, så det är lämpligt att utsäde ett överskott av kolonier för att få reservdelar.
Fördel och begränsningar av mönstret detektionsmetod
En särskild fördel med metoden är förmågan att detektera “genomsnittliga” mönster genom att kombinera bildanalys resultat från flera replikerande kolonier (figur 5). Detta kan avslöja mönster händelser som inte framgår av inspektion av enskilda kolonier. En nackdel med denna “medelvärdes strategi” är att det kan sakna vissa typer av repetitiva mönster, till exempel små fläckar eller smala ränder. Men dessa typer av mönster kan i stället avslöjas med en kombination av noggrant utvalda mönster storlekar8. Också, den bildanalys pipeline som beskrivs här ger kvantitativa data på både Single cell och Colony resolution erbjuder möjligheten att undersöka graden av Inter-Colony variation (figur 5) eller att utföra granne analys på flera vågar10.
En annan viktig fördel med medelvärdes metoden är att det ger möjlighet att kartlägga den förmånliga placeringen av många markörer utan att begränsas av tillgängliga fluoroforer av detekterings kanaler. Även om vi använder endast två markörer för differentiering i det arbete som presenteras här, kan förmågan att standardisera kolonier och extrahera “genomsnittliga” mönster göra det möjligt att jämföra fördelnings kartorna från olika grupper av kolonier tillsammans för att avslöja de generaliserade rumsliga relationerna mellan markörer och varandra.
Dessutom, även om vårt fokus här har varit att studera differentierings markörer, kan analysmetoden utökas för att studera andra biologiska processer för vilka nukleära markörer finns tillgängliga. Till exempel micropatterning av en cellinjer som innehåller en fluorescens ubiquitination cell cykel indikator35 (Fucci) skulle göra det möjligt att studera hur kolonin nivå geometri kan påverka cell cykel händelser i gruppen.
Framtida riktningar
Metoden är mottaglig för medelhög genomströmning bildanalys, dock, bild förvärv är för närvarande inte helt automatiserad och kan bli begränsande för mycket stora experiment. De regelbundna arrangemangen av kolonier bör göra det möjligt att skapa helt automatiserade förvärvs rutiner som liknar vad som har utvecklats för Single cell genomsnitt20. Men eftersom storleken på det fält som krävs för att bilden en koloni är stor, möjligen kräver mosaik, och eftersom kolonier är tredimensionella, är det mycket önskvärt att minska både dataset storlek och förvärvs tid genom avbildning endast relevanta kolonier. Därför kan framtida insatser ägnas åt att utveckla ett “intelligent” mikroskop som kan identifiera relevanta kolonier och anpassa bildkoordinaterna till varje prov. Detta kommer inte bara att minska tid och ansträngning utan också förhindra potentiella operatörs fördomar.
Analyspipelines kan också göras effektivare genom att minska antalet steg som användaren behöver ta. Vi har planer på att bygga en pipeline-byggningsmekanism och att integrera R direkt i vår programvara (se även frågor pickcells-API # 3 och pickcells-rjava # 1 i frågan Tracker i vår kod förråd [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). Den fullständiga automatiseringen av analys proceduren kommer att minska tid och ansträngning och begränsa potentiella användarfel.
Slutligen, vi noterar att vår analysmetod ännu inte helt fånga den dynamiska karaktären av cellulära mönster. Viss begränsad dynamisk information kan extraheras genom att undersöka en tidsserie med ögonblicksbilder8,10,36. Men att kunna spela in cell populationens historia är mycket önskvärt om vi vill bättre förstå hur mönstret framträder. En begränsning är att korrekt spårning av enskilda celler i en 3D-tät cellpopulation förblir en mycket utmanande uppgift37. Vår cell detektionsmetod använder det nukleära kuvertet och presterar särskilt bra på täta och överlappande cellpopulationer28. Levande reportrar av det nukleära kuvertet är lätt tillgängliga28,38 och en fördel med micropatterning tekniken är att den kan användas för att förhindra att cellerna från att flytta utanför synfältet under långsiktig avbildning. Sammantaget är vi övertygade om att automatiserad spårning av celler kommer att kunna uppnås med hjälp av en kombination av nyligen etablerade verktyg28,39,40 och att detta bör ge nya insikter i de grundläggande principer för självorganisering.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av en Sir Henry Wellcome post-doktors stipendium (WT100133 till G.B.), en Wellcome Trust Senior Fellowship (WT103789AIA till S.L.), och en Wellcome Trust PhD Student Ship to (108906/Z/15/Z till D.W.). Vi är också tacksamma mot Dr Manuel thery för hans råd om att anpassa photopatterning teknik.
2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | handle in fume hood |
1× Master quartz anti-reflective chromium photomask | Toppan Photomask | Custom design | |
24-well plates | Corning | 3526 | |
4-well plates | Nunclon Delta | 176740 | |
5% Donkey Serum | Sigma | D9663 | |
Anti Nuclear pore complex | Abcam | ab24609 | Mouse monoclonal, use 1:1000 |
Anti-Id1 | Biocheck | 37-2 | Rabbit polyclonal, use 1:200 |
Anti-Lamin B1 | Abcam | ab16048 | Rabbit polyclonal, use 1:1000 |
Anti-Tbra | R&D | AF2085 | Goat ployclonal, use 1:400 |
Blocking Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 5% Donkey Serum 0.003% Sodium Azide In PBS |
CGR8 mESC | NA | NA | Reference: Mountford et al. PNAS, 1994 |
Fixation solution | NA | NA | 4% PFA diluted in washing solution |
Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance |
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma | G5154 | |
Laboratory Film | VWR | 291-1212 | |
Layout Editor Software | LayoutEditor | NA | https://layouteditor.com/ |
Layout Editor Software | Klayout | NA | https://www.klayout.de/ |
L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
LIF | Millipore | ESG1107 | |
MEM NEAA | Gibco | 11140-035 | |
mESC Culture medium | NA | NA | GMEM 10% FCS 100 U/ml LIF 100 nM 2-mercaptoethanol 1× non-essential amino acids, 2 mM L- glutamine 1 mM sodium pyruvate |
NH4Cl 50mM | Sigma | 9718 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment |
PBS (immunostaining) | Sigma | P4417 | Dilute in 200ml of ddH2O |
PBS (tissue culture) | Gibco | 11140-035 | |
Plastic slides | Ibidi | IB-10813 | |
Poloxamer 407 | Sigma | P2443 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | P36930 | |
Sodium Azide | Sigma | 8591 | CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
TritonX-100 | Sigma | T8532 | |
Trypsin | Gibco | 25200056 | |
UVO cleaner | Jetlight, USA | 42-220 | CAUTION: Follow manufacturer’s safety recommendations |
Washing Solution | NA | NA | 0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 In PBS |