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Chemistry

जैवबहुलक Additives की उपस्थिति में कैल्शियम कार्बोनेट गठन

Published: May 14, 2019 doi: 10.3791/59638
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Institute of Chemistry, Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, 2The Harvey M. Krueger Family Center for Nanoscience and Nanotechnology, Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

हम कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल की वर्षा और लक्षणीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो जैवबहुलकों की उपस्थिति में बनते हैं।

Abstract

जैव-खनिजीकरण कार्बनिक अणुओं की उपस्थिति में खनिजों का निर्माण होता है, जो प्रायः सजीवों में कार्यात्मक और/अथवा संरचनात्मक भूमिकाओं से संबंधित होता है। यह एक जटिल प्रक्रिया है और इसलिए एक सरल, इन विट्रो में, जैव खनिजीकरण प्रक्रिया पर पृथक अणुओं के प्रभाव को समझने के लिए प्रणाली की आवश्यकता होती है। कई मामलों में, जैवखनिजीकरण को कोशिकीय मैट्रिक्स में जैवबहुलकों द्वारा निर्देशित किया जाता है। इन विट्रो में कैल्साइट की आकृति विज्ञान और संरचना पर पृथक जैवबहुलकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, हमने कैल्शियम कार्बोनेट की वर्षा के लिए वाष्प विसरण विधि का उपयोग किया है, विशेषता के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और माइक्रो रमन को स्कैन किया है, और क्रिस्टल में एक biopolymer की मात्रा को मापने के लिए पराबैंगनी-दृश्य (यूवी/ इस विधि में, हम पृथक जैवबहुलकों को उजागर करते हैं, जो कैल्शियम क्लोराइड विलयन में घुलजादे होते हैं, जो ठोस अमोनियम कार्बोनेट के अपघटन से उत्पन्न होने वाली गैसीय अमोनिया और कार्बन डाइऑक्साइड को प्रकट करते हैं। उन परिस्थितियों के तहत जहां कैल्शियम कार्बोनेट के घुलनशील उत्पाद तक पहुँच जाता है, कैल्शियम कार्बोनेट वेग और क्रिस्टल बनते हैं। कैल्शियम कार्बोनेट में विभिन्न बहुरूप होते हैं जो उनकी ऊष्मागतिक स्थिरता में भिन्न होते हैं: अक्रिस्टलीय कैल्शियम कार्बोनेट, वैराइट, अरगोनाइट, और कैल्साइट। जैवबहुलकों की अनुपस्थिति में, स्वच्छ परिस्थितियों में कैल्शियम कार्बोनेट अधिकतर कैल्साइट रूप में होता है, जो कैल्शियम कार्बोनेट का सबसे ऊष्मागतिक रूप से स्थिर बहुरूप है। इस विधि की आकृति विज्ञान और कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल की संरचना पर biopolymeric additives के प्रभाव की जांच. यहाँ, हम कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल के गठन पर एक extracellular जीवाणु प्रोटीन, TapA, के अध्ययन के माध्यम से प्रोटोकॉल का प्रदर्शन. विशेष रूप से, हम प्रयोगात्मक सेट अप पर ध्यान केंद्रित, और विशेषता तरीकों, जैसे ऑप्टिकल और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी.

Introduction

जैव-खनिजीकरण कार्बनिक अणुओं की उपस्थिति में खनिजों का निर्माण होता है, जो प्रायः सजीवों में कार्यात्मक और/अथवा संरचनात्मक भूमिकाओं से संबंधित होता है। जैव-खनिजीकरण इंट्रासेल्यूलर हो सकता है, जैसे मैग्नेटोटेक्टिक बैक्टीरिया1, या एक्स्ट्रासेल्यूलर के अंदर मैग्नेटाइट के गठन में, जैसा कि समुद्र में कैल्शियम कार्बोनेट के गठन में2,हाइड्रॉक्सीपैटाइट का जो में कोलेजन से संबंधित है हड्डियों3 और तामचीनी कि दांतों में एमेलोजेनिन के साथ जुड़ा हुआ है4. जैव-खनिजीकरण एक जटिल प्रक्रिया है जो जीव में कई मापदंडों पर निर्भर करती है। इसलिए, अध्ययन के तहत प्रणाली को सरल बनाने के लिए, प्रक्रिया पर अलग-अलग घटकों के प्रभाव का मूल्यांकन करना आवश्यक है। कई मामलों में, जैव खनिजीकरण कोशिकाबाह्य जैवबहुलकों की उपस्थिति से प्रेरित होता है। यहाँ प्रस्तुत विधि का उद्देश्य इस प्रकार है: (1) एक वाष्प प्रसार विधि का उपयोग करते हुए, इन विट्रो में पृथक जैवबहुलकों की उपस्थिति में कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल का निर्माण करना। (2) कैल्शियम कार्बोनेट की आकृति विज्ञान और संरचना पर जैवबहुलकों के प्रभाव का अध्ययन करना।

कार्बनिक एडिटिव्स की उपस्थिति में इन विट्रो में कैल्शियम कार्बोनेट को वेग देने के तीन प्रमुख तरीकों का उपयोग किया जाता है5,6. पहली विधि, जिसे हम समाधान विधि के रूप में संदर्भित करेंगे, कैल्शियम का घुलनशील नमक (जैसे, CaCl2)कार्बोनेट के घुलनशील नमक (जैसे, सोडियम कार्बोनेट) के साथ मिश्रण पर आधारित है। मिश्रण प्रक्रिया कई तरीकों से की जा सकती है: एक रिएक्टर के अंदर तीन कोशिकाओं के साथ जो छिद्रयुक्त झिल्ली7से अलग होते हैं । यहाँ, बाहरी कोशिकाओं में से प्रत्येक में घुलनशील नमक होता है और केंद्रीय कोशिका में परीक्षण किए जाने वाले योज्य के साथ एक समाधान होता है। कैल्शियम और कार्बोनेट फैलाना बाहरी से मध्य कोशिका तक फैलाना, जिसके परिणामस्वरूप कम घुलनशील कैल्शियम कार्बोनेट की वर्षा होती है जब कैल्शियम और कार्बोनेट की सांद्रता उनके विलेयता उत्पाद से अधिक होती है, केएसपी [Ca2+]CO3 2-$. एक अतिरिक्त मिश्रण विधि डबल जेट प्रक्रिया8है. इस विधि में, प्रत्येक घुलनशील नमक एक अलग सिरिंज से एक हलचल समाधान योज्य युक्त करने के लिए इंजेक्शन है, जहां कैल्शियम कार्बोनेट वेग. यहाँ, इंजेक्शन और इसलिए मिश्रण दर अच्छी तरह से नियंत्रित किया जाता है, पिछले विधि जहां मिश्रण प्रसार द्वारा नियंत्रित किया जाता है के साथ इसके विपरीत.

CaCO3 को क्रिस्टलीकृत करने के लिए उपयोग की जाने वाली दूसरी विधि Kitano विधि9है। यह विधि कार्बोनेट/हाइड्रोजन कार्बोनेट संतुलन (2HCO3- (अ) + Ca2+(अ) Image 1 CaCO 3(s) + CO 2(g) + H2O (l)पर आधारित है। यहाँ, ब्व्2 एक ठोस रूप में CaCO3 युक्त समाधान में bubbled है, बाईं ओर संतुलन स्थानांतरण और इसलिए कैल्शियम कार्बोनेट भंग. अविलेय कैल्शियम कार्बोनेट फ़िल्टर किया जाता है और वांछित additives को बाइकार्बोनेट-रिच समाधान में जोड़ा जाता है। सीओ2 तो वाष्पित करने के लिए अनुमति दी है, जिससे दाईं ओर प्रतिक्रिया स्थानांतरण, additives की उपस्थिति में कैल्शियम कार्बोनेट बनाने.

कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टलीकरण की तीसरी विधि, जिसका हम यहां वर्णन करेंगे, वाष्प विसरण विधि10है। इस सेट-अप में, कैल्शियम क्लोराइड के विलयन में घुली हुई कार्बनिक योज्य को अमोनियम कार्बोनेट के पास एक बंद कक्ष में पाउडर के रूप में रखा जाता है। जब अमोनियम कार्बोनेट पाउडर कार्बन डाइऑक्साइड और अमोनिया में विघटित हो जाता है, तो वे कैल्शियम आयनों वाले समाधान (उदाहरण के लिए, CaCl2) और कैल्शियम कार्बोनेट वेगित हो जाता है (चित्र 1 उदाहरण के लिए देखें)। कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल धीमी वर्षा या तेजी से वर्षा से विकसित कर सकते हैं। धीमी वर्षा के लिए, CaCl2 समाधान में योज्य युक्त एक समाधान अमोनियम कार्बोनेट पाउडर के बगल में एक desiccator में रखा गया है। प्रोटोकॉल में लंबाई में वर्णित तीव्र वर्षा में, योज्य विलयन और अमोनियम कार्बोनेट दोनों को एक बहु-वेल प्लेट में एक साथ करीब रखा जाता है। धीमी गति से वर्षा विधि कम नाभिक केन्द्रों और बड़ा क्रिस्टल का उत्पादन होगा, और तेजी से वर्षा अधिक नाभिक केन्द्रों और छोटे क्रिस्टल में परिणाम होगा.

ऊपर वर्णित विधियों उनकी तकनीकी जटिलता में, नियंत्रण के स्तर में और वर्षा की प्रक्रिया की दर में अलग हैं. मिश्रण विधि डबल जेट और तीन सेल प्रणाली दोनों के लिए एक विशेष सेट अप6 की आवश्यकता है। मिश्रण विधि में, अन्य घुलनशील प्रतिआयनों (उदा., ना+, सीएल-)6 की उपस्थिति अपरिहार्य है, जबकि कितानो विधि में कैल्शियम और (बी) कार्बोनेट समाधान में केवल आयन हैं और इसमें अतिरिक्त की उपस्थिति शामिल नहीं है प्रति आयनों (उदा., ना+, सीएल-)। इसके अलावा, मिश्रण विधि अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा की आवश्यकता है और इसलिए यह महंगा biopolymers के साथ काम करने के लिए उपयुक्त नहीं है. डबल जेट का लाभ यह है कि यह समाधान इंजेक्शन की दर को नियंत्रित करने के लिए संभव है और यह अन्य तरीकों की तुलना में एक तेजी से प्रक्रिया है.

Kitano विधि और वाष्प प्रसार विधि का लाभ यह है कि कैल्शियम कार्बोनेट के गठन में सीओ2 के प्रसार द्वारा नियंत्रित किया जाता है / बाहर एक CaCl2 समाधान, इस प्रकार धीमी नाभिकन और वर्षा प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए अनुमति देता है 11 , 12इसके अतिरिक्त , ब् व्2 के विसरण द्वारा कैल्शियम कार्बोनेट का निर्माण विवो13,14,15में कैल्केंसेशन प्रक्रियाओं के समान हो सकता है . इस विधि में, अच्छी तरह से परिभाषित और अलग क्रिस्टल16का गठन कर रहे हैं. पिछले, कैल्शियम कार्बोनेट गठन पर एक या कई biopolymers के प्रभाव का परीक्षण किया जा सकता है. यह कैल्शियम कार्बोनेट गठन पर योज्य सांद्रता की एक श्रृंखला के प्रभाव के साथ-साथ biopolymers के मिश्रण का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है - सभी एक नियंत्रित तरीके से प्रदर्शन किया। इस विधि सांद्रता और additives की मात्रा की एक बड़ी रेंज के साथ उपयोग के लिए उपयुक्त है. उपयोग की गई न्यूनतम मात्रा लगभग 50 डिग्री सेल्सियस है और इसलिए यह विधि लाभप्रद है जब उपलब्ध जैवबहुलकों की सीमित मात्रा होती है। अधिकसेअधिक मात्रा एक बड़ा अच्छी तरह से प्लेट की पहुंच पर निर्भर करता है, या desiccator जिसमें प्लेट या CaCl2 युक्त बीकर डाला जा रहे हैं. नीचे वर्णित विधि को 96-वेल प्लेट में काम करने के लिए अनुकूलित किया गया है जिसमें एक बायोबहुलक को प्रोटीन टैपा17चुना गया है।

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Protocol

1. कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टलीकरण

  1. नियंत्रण तैयारी और अनुकूलन
    1. साफ कांच के टुकड़े तैयार करें। कांच के बर्तनों को साफ करने के लिए एक ही सफाई प्रक्रिया का उपयोग करें।
      1. एक हीरे की कलम का उपयोग करने के लिए एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड के टुकड़े में कटौती इतनी है कि वे एक 96 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में फिट.
        नोट: 5 मिमी x 5 मिमी टुकड़े काफी हद तक फिट होना चाहिए.
      2. ट्रिपल आसुत पानी (TDW) के साथ एक बीकर में कांच के टुकड़े प्लेस इतना है कि पानी कांच स्लाइड को शामिल किया गया और 10 मिनट के लिए एक स्नान sonicator में sonicate.
      3. पानी decant, कांच स्लाइड को कवर करने के लिए इथेनॉल जोड़ने के लिए, और 10 मिनट के लिए एक स्नान sonicator में sonicate।
      4. स्लाइड और नाइट्रोजन गैस की एक धारा के साथ कांच के बर्तन सूखी और उन्हें 130 W पर 10 मिनट के लिए एक हवा प्लाज्मा क्लीनर में जगह है.
    2. CaCl की एकाग्रता का अनुकूलन2 वांछित प्रयोगात्मक शर्तों के तहत प्रदर्शन किया कैल्शियम प्रयोगों में इस्तेमाल किया चिकनी faceted calcite क्रिस्टल के साथ अमीर एक नमूना प्राप्त करने के लिए (बिना या कम से कम vaterite की एक दुर्लभ संख्या के साथ क्रिस्टल)।
      1. अमोनियम कार्बोनेट पाउडर के साथ एक 96-वेल प्लेट के कोनों पर कुओं को भरें और एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग करके प्लेट को सील करें; पैराफिन फिल्म के साथ पन्नी को कवर. नाइट्रोजन गैस का उपयोग करकिसी अवशिष्ट अमोनियम कार्बोनेट को साफ करें।
        चेतावनी: अमोनियम कार्बोनेट नाक और फेफड़ों को परेशान करता है; केवल धूआं हुड के अंदर का उपयोग करें।
      2. 0.5 एम CaCl2का एक शेयर समाधान तैयार करें। इस स्टॉक समाधान का उपयोग बहु-वेल प्लेट में CaCl2 समाधानों की सांद्रता की प्रवणता तैयार करने के लिए किया जाएगा।
        नोट: एक 10 एमएल स्टॉक समाधान पूरे प्रयोग के लिए पर्याप्त है.
      3. पहले से काट दिया और पांच अलग कुओं में कांच के टुकड़े साफ रखें. केंद्र के निकटतम कुओं का प्रयोग करें।
      4. प्रत्येक अच्छी तरह से एक CaCl2 समाधान16के 100 $L के साथ एक गिलास टुकड़ा असर भरें. मिश्रण TDW और 0.5 एम CaCl2 (स्टॉक) विभिन्न कुओं भर में CaCl2 की बढ़ती एकाग्रता ढाल को प्राप्त करने के लिए. यदि एक अलग आकार अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग किया जाता है, अलग कैल्साइट क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए CaCl2 की एकाग्रता को समायोजित (चरण 1.1.2.10, और चर्चा अनुभाग देखें).
        नोट: एक बढ़ती CaCl2 10, 20, 30, 40 ,50 एमएम सांद्रता की ढाल अलग कुओं में इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है. एकाग्रता रेंज या परीक्षण सांद्रता की संख्या में वृद्धि करने के लिए, अतिरिक्त कुओं का उपयोग करें.
      5. अमोनियम कार्बोनेट 3x वाले प्रत्येक कुएं के आवरण को सुई के साथ पंचर करें।
      6. ढक्कन वापस रखो, पैराफिन फिल्म के साथ सीमाओं को सील और 20 एच के लिए एक इनक्यूबेटर में 18 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      7. ऊष्मायन के बाद, एक धूआं हुड के अंदर ध्यान से ढक्कन खोलें और एक लूप के साथ पानी/वायु इंटरफ़ेस पर बने क्रिस्टल को हटा दें।
      8. कांच के टुकड़ों को डबल आसुत जल (डीडब्ल्यू) युक्त बीकर में स्थानांतरित करने के लिए एक टिमेजर का उपयोग करें। बीकर से नमूने निकालें और पेट्री डिश के तल पर कांच के टुकड़े को ठीक करने के लिए एक दो तरफा टेप का उपयोग करें।
      9. ऊतक पोंछे के साथ स्लाइड की सीमाओं को छू तेजाना अत्यधिक पानी। पेट्री डिश को कवर करें और इसे 24 ज के लिए एक desiccator में रखें।
      10. एक स्टीरियोस्कोप (3.5x आवर्धन) और / या एक ईमानदार ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप (10x-40x आवर्धन) के साथ कांच के टुकड़े पर गठित क्रिस्टल का निरीक्षण करें। यदि नियंत्रण समाधान स्वच्छ हैं, तो समचतुर्भुजीय क्रिस्टल (सबसे अधिक संभावना कैलसाइट) को ऑप्टिकल सूक्ष्मदर्शी के साथ देखा जाएगा (चित्र 2क)।
      11. यदि विषमकोणात्मक क्रिस्टल के अतिरिक्त, नियंत्रण में गोलाकार क्रिस्टल (सबसे अधिक संभावना वाले वैटेराइट, चित्र 2ठ) होते हैं, या यदि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी (एसईएम) छवियों में चिकनी चेहरे के बजाय किसी न किसी के साथ विषमकोणात्मक क्रिस्टल दिखाई देते हैं ( चित्र 3 ए,बी),क्रिस्टलीकरण प्रोटोकॉल को दोहराने सुनिश्चित करें कि सफाई चरण (1.1.1) सही ढंग से किया जाता है। इसके अलावा, बेहतर देखभाल करें कि समर्पित कुओं के अलावा प्लेट पर कोई अमोनियम कार्बोनेट नहीं है। अन्यथा, अगले चरण पर जारी रखें।
  2. additives की उपस्थिति में क्रिस्टलीकरण
    1. CaCO3के क्रिस्टलीकरण पर additives के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, एक बहु अच्छी तरह से थाली है कि (विभिन्न कुओं में), additives के बिना एक नियंत्रण CaCl2 समाधान, और additives के साथ CaCl2 समाधान की स्थापना की. प्रयोग के लिए अनुभाग 1.1.2 में पाए गए CaCl2 की इष्टतम सांद्रता का उपयोग करें.
      नोट: नीचे दिए गए प्रोटोकॉल इष्टतम स्थितियों का उपयोग करता है के रूप में उन एक पिछले अध्ययन में रिपोर्ट16.
    2. चरण 1.1.2.2 दोहराएँ.
    3. चरण 1-1-1 में वर्णित अमोनियम कार्बोनेट चूर्ण को प्लेट के कोनों में रखें।
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से जहां वर्षा हो जाएगा में, एक गिलास टुकड़ा है कि काट दिया गया था और साफ के रूप में अनुभाग 1.1.1 में वर्णित जगह है.
    5. नियंत्रण कुओं को तैयार करने के लिए, नियंत्रण कुओं में TDW के पिपेट 90 डिग्री एल. नियंत्रण सहित प्रत्येक अच्छी तरह से कम से कम एक प्रतिकृति तैयार करें। यदि उपयोग किया गया योज्य एक बफर समाधान में है, तो TDW पानी के बजाय बफर के pipette 90 $L.
    6. योज्य युक्त कुओं को तैयार की। जल में योज्य विलयन का 90 डिग्री सेल्सियस जोड़कर चरण 1ण्2ण्5 दोहराएँ। यदि योज्य बफ़र (TDW के बजाय) में है, तो वांछित अंतिम एकाग्रता को पूरा करने के लिए बफ़र के साथ योज्य की सांद्रता को पूर्व-समायोजित करें। 90 डिग्री सेल्सियस की कुल मात्रा रखें; पिपेट पहले योज्य, फिर बफर।
      नोट: 100 एमएम NaCl में प्रोटीन TapA के 10 डिग्री सेल्सियस की एक अंतिम एकाग्रता, 25 m Tris pH 8.0 बफर16 इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है।
    7. 50 एम CaCl2 स्टॉक समाधान के 10 $L जोड़ें (चरण 1.2.2 में तैयार) दोनों नियंत्रण और additives युक्त कुओं के लिए 50 एम CaCl2की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए.
    8. कदम दोहराएँ 1.1.2.5-1.1.2.9.

2. कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल की विशेषता

  1. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी के साथ, ऑप्टिकल माइक्रोकॉपी द्वारा प्राप्त की तुलना में एक उच्च संकल्प पर additives की उपस्थिति में गठित कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल का निरीक्षण (चरण 1.1.2.10 देखें)।
    1. दो तरफा कार्बन टेप के साथ एक एल्यूमीनियम स्टब पर क्रिस्टल युक्त कांच के टुकड़े माउंट.
    2. 40-50 एस के लिए Au/Pd की एक परत के साथ कोट.
    3. 5 केवी त्वरण वोल्टेज पर छवियों का अधिग्रहण.
      नोट: चित्र 3ए एक उचित नियंत्रण प्रयोग में गठित कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल के एक प्रतिनिधि SEM छवि से पता चलता है, जबकि चित्र 4 प्रोटीन TapA की उपस्थिति में गठित कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल के प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है .
  2. निर्मित कैल्शियम कार्बोनेट बहुरूप निर्धारित करने के लिए माइक्रो रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी करें। माइक्रो रमन एक पूरे पाउडर के बजाय एकल क्रिस्टल से एक रमन स्पेक्ट्रम के संग्रह की अनुमति देता है।
    1. ब्याज के क्रिस्टल का चयन करने के लिए माइक्रोस्कोप के एक 20x उद्देश्य का प्रयोग करें।
    2. एक 514 एनएम argon लेजर का उपयोग कर 100 डिग्री 3200 सेमी-1 की एक सीमा में रमन स्पेक्ट्रम लीजिए।
      नोट: चित्र 5 कैल्साइट (ए) और वेटेराइट (बी) के प्रतिनिधि स्पेक्ट्रम से पता चलता है। अरगोनाइट के स्पेक्ट्रम के लिए, संदर्भ18का संदर्भ लें।
  3. CaCO3 वेग में additives के बड़े पैमाने पर प्रतिशत की मात्रा
    1. उपयोग किए गए योज्य के विलुप्त होने गुणांक ($) का सत्यापन/माप करें। एक प्रोटीन के विलुप्त होने गुणांक ऑनलाइन सर्वर19द्वारा दिया जा सकता है . यदि विलुप्त गुणांक अज्ञात है, विभिन्न सांद्रता में योज्य के अवशोषण को मापें, अवशोषण बनाम संकेन्द्रण को आलेखित करें और वक्र की ढलान से विलुप्त होने गुणांक की गणना करें।
    2. कांच के टुकड़े जहां क्रिस्टल का गठन वजन, अधिमानतः एक microbalance का उपयोग करें.
    3. 0.1 एम एसिटिक एसिड समाधान, भंवर के 1.2 एमएल में कांच से क्रिस्टल स्क्रैप और नमूना sonicate. 24 ज के लिए कमरे के तापमान पर नमूना स्टोर.
      चेतावनी: एसिटिक एसिड त्वचा या आंख से संपर्क के मामले में बहुत खतरनाक है; सावधानी से संभालें और नियमों का पालन करते हुए निपटान करें।
    4. क्रिस्टल बंद scraping के बाद कांच स्लाइड वजन.
    5. समाधान के यूवी/विस अवशोषण (ए) स्पेक्ट्रम को मापें। यदि योज्य एक प्रोटीन है, 280 एनएम पर अवशोषण उपाय और इसकी एकाग्रता की गणना (सी), बीयर-लैम्बर्ट समीकरण का उपयोग कर:
      Equation 1
      जहां l cuvette के अंदर ऑप्टिकल पथ है.
    6. 2ण्3ण्5 में पाई जाने वाली सांद्रता (ब्) का उपयोग करें तथा क्रिस्टलों में आपस में योज्यों के द्रव्यमान (उ) की गणना करने के लिए प्रयुक्त आयतन (ट र् 1ण्2ल) का उपयोग करें। यदि सांद्रता मिलीग्राम/उल में है, तो समीकरण ब् र् े उ का उपयोग करें।
      1. यदि सांद्रता मोलधे में है, तो मोल (द) को लागू करने वाले ब् ़ ़ द दकी गणना कीजिए। फिर एडिटिव्स के द्रव्यमान (उ) की गणना करने के लिए आण्विक भार (एमडब्ल्यू) का उपयोग करें (उ र् द र् उ) ।
    7. समीकरण का उपयोग करके क्रिस्टलों में एडिटिव्स Equation 2 के भार प्रतिशत की गणना करें: , जहाँ उ एडिटिव्स का द्रव्यमान है, और $ms कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल का द्रव्यमान है जिसे कांच से हटा दिया गया था टुकड़ा.

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Representative Results

प्रायोगिक व्यवस्था का एक योजनाबद्ध चित्र 1में दिखाया गया है। संक्षेप में, प्रसार विधि 96 अच्छी तरह से प्लेटों में कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल बनाने के लिए और आकारिकी और कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल की संरचना पर biopolymers के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इन प्रयोगों में अमोनियम कार्बोनेट अमोनिया तथा सीओ2में विघटित हो जाता है, जो कैल्शियम कार्बोनेट समाधानों में विसरित होता है जिसके परिणामस्वरूप कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल का निर्माण होता है (चित्र1 तथा चित्र2)।

biopolymers के प्रभाव के साथ और बिना (नियंत्रण) additives का गठन कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। additives के अलावा करने से पहले, अनुकूलित कैल्शियम कार्बोनेट एकाग्रता चुना जाता है और समाधान और कांच के बर्तन की सफाई का परीक्षण किया जाता है। चित्र 2 एक नियंत्रण प्रयोग है, जहां अलग विषमकोण कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल का गठन कर रहे हैं की एक प्रतिनिधि छवि से पता चलता है. ये क्रिस्टल कैलसाइट की सर्वाधिक संभावना होते हैं (चित्र 5देखें )। यदि समाधान या प्लास्टिक या कांच के बर्तनों को ठीक से साफ नहीं किया गया है तो गोलाकार क्रिस्टल बन जाएंगे (चित्र 2बी, लाल वृत्तों के साथ चिह्नित), विषमकोण के कैलसाइट क्रिस्टल के अतिरिक्त। गोलीय क्रिस्टल सबसे अधिक संभावना वाले वैराइट हैं (चित्र 5देखें)। उचित परिस्थितियों के उपयोग के लिए एक अतिरिक्त संकेत, नियंत्रण प्रयोग में कैल्साइट चेहरे की चिकनाई है. यह SEM के साथ देखा जा सकता है, जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है। चित्र 3 एक चिकनी कैल्साइट चेहरे के साथ एक उचित नियंत्रण से पता चलता है, जबकि चित्र 3बी कदम से बना चेहरे के साथ कैल्साइट क्रिस्टल से पता चलता है। यहाँ गोलाकार क्रिस्टल वेटेराइट हैं। नियंत्रण क्रिस्टल को अलग और चिकनी-चेहरे की आवश्यकता है ताकि क्रिस्टल आकारिकी पर additives का प्रभाव स्पष्ट हो।

कैल्शियम कार्बोनेट की आकृति विज्ञान पर एक biopolymer के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए, हम यहाँ प्रोटीन TapA इस्तेमाल किया है. चित्र 4 विलयन में तपा की उपस्थिति में निर्मित कैल्शियम कार्बोनेट के क्रिस्टल दर्शाते हैं। क्रिस्टल नियंत्रण क्रिस्टल से अलग हैं। वे एक जटिल गोलाकार कैल्शियम कार्बोनेट असेंबली बनाते हैं, जो अनेक कैल्साइट माइक्रोक्रिस्टलसे बना होता है (चित्र 5में रमन स्पेक्ट्रम देखें)। क्रिस्टल की संरचना की विशेषता के लिए एक विधि रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी है. चित्र 5 कैलसाइट के विशिष्ट स्पेक्ट्रम को दर्शाता है (चित्र 5क) और वेटेराइट (चित्र 5ठ), जो सफल (ए) और असफल (ठ) नियंत्रण प्रयोगों से लिया गया है . विशिष्ट अवशोषण चोटियों20 की सीमा में हैं 100 डिग्री 400 सेमी-1 (जाली मोड), $710 सेमी-1 पर एक चोटी (सीओ32-केसममित झुकने ) और पर $1090 सेमी-1 (सीओ3 के सममित खींच 2-)। रमन पारी का विभाजन 1080 से.मी.-1 पर नोट की है जो वेटराइट21की सबसे स्पष्ट विशेषता है। Aragonite की एक पूर्ण स्पेक्ट्रम के लिए संदर्भ22 का संदर्भ लें. तपा की उपस्थिति में बने क्रिस्टलों का रमन स्पेक्ट्रम कैल्साइट स्पेक्ट्रम के समान है (चित्र 5क) मामलों में जहां अतिरिक्त चोटियों दिखाई देते हैं जो एक भी कैल्शियम कार्बोनेट polymorph, या उन में से एक संयोजन के एक एकल स्पेक्ट्रम के अनुरूप नहीं है, वे कैल्शियम क्लोराइड है कि अच्छी तरह से कदम 1.1.2.8 में धोया नहीं गया है की एक अतिरिक्त के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है.

प्रोटोकॉल के अंतिम भाग में, हमने कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल के अंदर या कार्बनिक सामग्री का प्रतिशत (वजन/ क्रिस्टल एसिटिक एसिड में भंग कर रहे थे और biopolymer समाधान में जारी किया गया था. ऐसे मामलों में जहां जैवबहुलक में एक विशेषता अवशोषण स्पेक्ट्रम होता है, समाधान में इसकी सांद्रता निर्धारित की जा सकती है। सुगंधित पक्ष समूहों युक्त प्रोटीन के मामले में, के रूप में TapA के मामले में यहाँ अध्ययन में, 280 एनएम पर अवशोषण का उपयोग किया जाता है. तपा का अवशोषण स्पेक्ट्रम, जो अम्ल में क्रिस्टलों के विघटन के बाद मापा जाता है, नियंत्रण के स्पेक्ट्रम के साथ चित्र 6 (हरा) में दिखाया गया है (अम्ल-विघटनित कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल बिना योज्य; काले)। बीयर-लैम्बर्ट के कानून का उपयोग करना (चरण 2.3.5 देखें) और 29,700 एम-1 सेमी-1के विलुप्त होने गुणांक का उपयोग करते हुए हमने पाया है कि TapA का सामूहिक प्रतिशत 1.8% था - 0.2%। अम्ल में क्रिस्टल विघटन के बाद समाधान के अवशोषण को मापने संभव है जब biopolymers कम पीएच पर कुल नहीं है. योज्य युक्त विलयन के अवशोषण का शून्य संकेत इसके एकत्रीकरण का संकेत है। इस मामले में, विभिन्न विश्लेषण विधियों, जैसे थर्मल गुरुत्वाकर्षण विश्लेषण (TGA) के अंदर / क्रिस्टल पर मौजूद additives के द्रव्यमान का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1 : कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल के गठन के लिए तेजी से वाष्प प्रसार विधि का योजनाबद्ध विवरण। एक कैल्शियम युक्त घुलनशील नमक (उदा., कैल्शियम क्लोराइड) एक अमोनियम कार्बोनेट पाउडर के पास रखा जाता है। यहाँ हम एक 96 अच्छी थाली में दो कुओं दिखा. प्लेट तो सील है, और अमोनियम कार्बोनेट अमोनिया और कार्बन डाइऑक्साइड है कि कैल्शियम युक्त अच्छी तरह से फैलाना में विघटित, कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल की वर्षा में जिसके परिणामस्वरूप (एक कैल्साइट क्रिस्टल के SEM छवि द्वारा यहाँ दिखाया). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल के ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवियों। एक स्वच्छ नियंत्रण में अधिकतर कैल्साइट होता है, जो विषमकोणीय क्रिस्टल (ए) की विशेषता होती है। जब नियंत्रण नमूने गोलाकार क्रिस्टल शामिल हैं (जैसे कि एकलाल वृत्त द्वारा चिह्नित उन) (बी), अनुभाग 1.1.1 में सुझाए गए के रूप में सफाई प्रोटोकॉल दोहराएँ. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : दो नियंत्रण प्रयोगों में निर्मित कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ स्कैन िंग। (क) एक नमूने का एक प्रतिबिंब जिसमें अधिकतर समचतुर्भुजीय क्रिस्टल (कैल्साइट) होते हैं। (बी) टूटे कैल्साइट पहलुओं और गोलाकार क्रिस्टल ों के साथ एक नमूने का माइक्रोग्राफ जो संभवतः वेराइट होते हैं। इस स्थिति में, नियंत्रण प्रयोगों को दोहराया जाना चाहिए. यह आंकड़ा Azulay एट अल16से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : प्रोटीन TapA की उपस्थिति में गठित कैल्साइट क्रिस्टल के SEM छवियों. स्केल बार क्रमशः 50 डिग्री उ (ए) और 10 डिग्री उ (ठ) का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा Azulay एट अल16से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : कैल्शियम कार्बोनेट के दो बहुरूपों के रमन स्पेक्ट्रम. (ए) कैल्साइट। (बी) वैराइट। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 : टपा (हरा) और एक बफर समाधान (100 एमएम NaCl, 25 m Tris पीएच 8.0; काले) की यूवी / अवशोषण का उपयोग अम्ल में उनके विघटन के बाद कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल में टैपा की सांद्रता की गणना करने के लिए किया जाता था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ वर्णित विधि कार्बनिक additives की उपस्थिति में कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल बनाने और आकृति विज्ञान और इन विट्रो में कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल की संरचना पर कार्बनिक biopolymers के प्रभाव का मूल्यांकन करने के उद्देश्य से है। विधि नियंत्रण प्रयोग में गठित कैल्साइट क्रिस्टल के लिए कार्बनिक additives की उपस्थिति में गठित क्रिस्टल की तुलना पर आधारित है। हमने दिखाया है कि कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल बनाने के लिए प्रसार विधि का उपयोग कैसे करें, ऑप्टिकल और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उनकी आकृति विज्ञान की विशेषता कैसे करें, रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके उनकी संरचना की विशेषता कैसे करें, और कार्बनिक सामग्री का निर्धारण कैसे करें (वजन/वजन प्रतिशत) क्रिस्टल का।

हम प्रोटोकॉल है कि हम एक जीवाणु extracellular प्रोटीन के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया है वर्णित, TapA, आकृति विज्ञान और कैल्शियम कार्बोनेट की संरचना पर, लेकिन प्रोटोकॉल जैविक रूप से शुद्ध या संश्लेषित है कि किसी भी अन्य बहुलक के लिए खर्च किया जा सकता है. एक एकल biopolymer के प्रभाव के अलावा, इस विधि biopolymers के मिश्रण के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है ताकि कैल्शियम कार्बोनेट वर्षा पर उनके प्रभाव में विभिन्न पॉलिमर के बीच किसी भी पारस्परिकता का मूल्यांकन करने के लिए. हम एक 96 अच्छी थाली के लिए प्रयोगात्मक सेट अप सीमित है; हालांकि, किसी भी अन्य सेट अप जहां कैल्शियम कार्बोनेट समाधान तैनात कर रहे हैं और शारीरिक रूप से अमोनियम कार्बोनेट स्रोत से अलग (यानी, समाधान और पाउडर एक सील पोत में रखा जाता है), संभव है. प्रयुक्त विशिष्ट जलयान बहु-वेल प्लेट होते हैं और 10-50 एम एम की एक विशिष्टसांद्रता श्रेणी का प्रयोग 96-वेल प्लेट10 ,16,23के साथ प्रायोगिक सेट-अप के लिए किया जाता है। एक सील बीकर या एक desicator भी इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस विधि का उपयोग करने के लिए आसान है और यह कम सांद्रता और biopolymeric additives के कम मात्रा के साथ संगत है. एक बहु अच्छी तरह से प्लेट में कार्य करना एक बहु अच्छी तरह से प्लेट प्रयोग में एक ही समय में कई मापदंडों की स्क्रीनिंग की अनुमति देता है. यह विधि अमोनियम कार्बोनेट पाउडर की स्थिति के संबंध में कैल्शियम कार्बोनेट कूपों की सापेक्ष स्थिति के प्रति संवेदनशील हो सकती है। इसलिए, बहु-वेल प्लेट में एक ही स्थान पर हमेशा कुओं का उपयोग करने के लिए और यह भी जांचने की आवश्यकता है कि कुओं के स्थान को बदलने से परिणाम प्रभावित नहीं होते हैं। आम तौर पर, कुओं के बीच एक बड़ी पर्याप्त दूरी का उपयोग कर जहां प्रयोग होते हैं और अमोनियम कार्बोनेट पाउडर, यह सुनिश्चित करता है कि परिणाम पुन: उत्पादनीय हैं। इसके अतिरिक्त, CaCl2 विलयन की सांद्रता को समायोजित करना महत्वपूर्ण है ताकि नियंत्रण प्रयोग में पृथक क्रिस्टल बन सकें, जैसा कि अनुभाग 1ण्1ण्2 में वर्णित है। additives की एकाग्रता भी नीचे जो कोई प्रभाव नहीं मनाया जाता है एक न्यूनतम एकाग्रता से अधिक करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। ध्यान दें कि विधि additives की एकाग्रता के लिए अत्यधिक संवेदनशील है; विभिन्न योज्य सांद्रता कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल की आकृति विज्ञान और संरचना पर एक अलग प्रभाव पैदा कर सकतीहै 24.

इस विधि की एक प्रमुख सीमा यह है कि अमोनिया और सीओ2 दोनों कैल्शियम क्लोराइड परीक्षण समाधान में फैलाना और इसलिए वहाँ प्रयोग भर में पीएच के गरीब नियंत्रण है. अमोनिया के प्रसार के परिणामस्वरूप विलयन में चह बढ़ जाती है (जब अमोनिया अमोनियम बन जाती है), जैसा कि संतुलन समीकरणों में दर्शाया गया है,6 (एनएच4)2ब्व्3 (स) ] 2छ3 (छ) + ब्2(छ) + भ् २ O(l), NH3 (अ) + H2O(l) ] NH4+(अ) + OH-(क), Ca 2+(क) + CO 2(अ) +2OH-(अ) Image 1 कैको3 (स) + व्2व् (ल)और यह कैल्शियम कार्बोनेट के गठन के पक्ष में है। 

परिचय में वर्णित अतिरिक्त विधियों की तुलना में, यह विधि तकनीकी रूप से सरल है। धीमी वर्षा की प्रक्रिया के कारण, क्रिस्टल विकास पारदर्शी बहु अच्छी तरह से तकनीक से अवशोषण या प्रकीर्णन तकनीक का उपयोग कर, वास्तविक समय में पीछा किया जा सकता है। इसके अलावा, क्रिस्टल विकास की गतिजता का पालन करने के लिए, एक भी क्रिस्टल आकृति विज्ञान और संरचना अलग अलग समय बिंदुओं पर जांच कर सकते हैं, बजाय 20 घंटे के बाद, के रूप में हमारे अध्ययन में प्रदर्शन किया. इस विधि का विस्तार कार्बोनेट के अन्य लवणों की वर्षा का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जिसमें एक छोटा सा पर्याप्त Ksp होता है, जैसे मैग्नीशियम, बेरियम और कैडमियम कार्बोनेट।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखक ों यथावकेत प्रो लिया अदी, प्रो जोनाथन इरेज़ और डॉ. इस शोध इजरायल विज्ञान फाउंडेशन (ISF), अनुदान 1150/

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Gadot 64-19-7
Ammonium carbonate Sigma-Aldrich 506-87-6
Calcium chloride dihydrate Merck KGaA 10035-04-8
Ethanol Absolute Gadot 64-17-5
Micro-Raman Renishaw inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope
Microscope Nikon Eclipse 90i model
Nis elements Br software Nikon For microscope imaging
Scanning Electron Microscope ThermoFisher Scientific FEI Sirion microscope
Spectrophotometer JASCO V-670 model
Sputter coater Polaron SC7640 model

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References

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जोवे में इस महीने अंक 147 biominalization कैल्शियम कार्बोनेट biopolymers TapA जीवाणु extracellular मैट्रिक्स वर्षा biofilms.
जैवबहुलक Additives की उपस्थिति में कैल्शियम कार्बोनेट गठन
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Azulay, D. N., Chai, L. Calcium… More

Azulay, D. N., Chai, L. Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives. J. Vis. Exp. (147), e59638, doi:10.3791/59638 (2019).

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