Summary
Vi beskriver en protokol til udfældning og karakterisering af calciumkarbonat krystaller, der dannes i nærværelse af biopolymere.
Abstract
Biomineralisering er dannelsen af mineraler i tilstedeværelsen af organiske molekyler, der ofte er forbundet med funktionelle og/eller strukturelle roller i levende organismer. Det er en kompleks proces, og derfor er et enkelt, in vitro-system påkrævet for at forstå effekten af isolerede molekyler på biomineraliserings processen. I mange tilfælde er Biomineralisering instrueret af biopolymere i den ekstracellulære matrix. For at evaluere effekten af isolerede Biopolymerer på morfologien og strukturen af calcit in vitro, har vi brugt damp diffusions metoden til udfældning af calciumcarbonat, scanning elektronmikroskopi og Micro Raman til karakterisering, og ultraviolet-synlig (UV/Vis) absorbans til måling af mængden af en biopolymer i krystallerne. I denne metode udsætter vi de isolerede Biopolymerer, opløst i en calciumchloridopløsning, for gasformigt ammoniak og kuldioxid, der stammer fra nedbrydningen af fast ammonium karbonat. Under de betingelser, hvor opløselighed produktet af calciumcarbonat er nået, dannes calciumcarbonat bundfald og krystaller. Calciumcarbonat har forskellige polymorffer, der adskiller sig i deres termodynamiske stabilitet: amorfe calciumcarbonat, vaterite, aragonite, og calcite. I fravær af biopolymere, under rene betingelser, calciumcarbonat er for det meste til stede i calcit form, som er den mest termodynamisk stabil polymorph af calciumcarbonat. Denne metode undersøger effekten af biopolykemeje tilsætningsstoffer på morfologien og strukturen af calciumkarbonat krystaller. Her viser vi protokollen gennem studiet af et ekstracellulært bakterielt protein, TapA, på dannelsen af calciumkarbonat krystaller. Specifikt fokuserer vi på den eksperimentelle opsætning, og karakterisering metoder, såsom optisk og elektronmikroskopi samt Raman spektroskopi.
Introduction
Biomineralisering er dannelsen af mineraler i tilstedeværelsen af organiske molekyler, der ofte er forbundet med funktionelle og/eller strukturelle roller i levende organismer. Biomineralisering kan være intracellulær, som i dannelsen af magnetit inde i magnetotaktiske bakterier1, eller ekstracellulære, som i dannelsen af calciumcarbonat i søpindsvin pigge2, af hydroxyapatit, der er relateret til kollagen i knogler3 og emalje, der er forbundet med amelogenin i tænder4. Biomineralisering er en kompleks proces, der afhænger af mange parametre i den levende organisme. For at forenkle det undersøgende system er det derfor nødvendigt at evaluere virkningen af særskilte komponenter på processen. I mange tilfælde induceres Biomineralisering af tilstedeværelsen af ekstracellulære biopolymere. Formålet med den her fremlagte metode er følgende: (1) at danne calciumkarbonat krystaller i tilstedeværelse af isolerede biopolymere in vitro, ved hjælp af en damp diffusions metode. (2) at undersøge Biopolymerer virkning på morfologien og strukturen af calciumcarbonat.
Der anvendes tre hovedmetoder til frem fældelse af calciumcarbonat in vitro ved tilstedeværelse af organiske tilsætningsstoffer på5,6. Den første metode, som vi vil referere til som løsningsmetode, er baseret på blanding af et opløseligt salt af calcium (f. eks. CaCl2) med et opløseligt salt af karbonat (f. eks. natriumkarbonat). Blande processen kan udføres på flere måder: inde i en reaktor med tre celler, der er adskilt af porøse membraner7. Her indeholder hver af de ydre celler et opløseligt salt, og den centrale celle indeholder en opløsning med det tilsætningsstof, der skal testes. Calcium og karbonat diffus fra den ydre til den midterste celle, hvilket resulterer i udfældningen af det mindre opløselige calciumcarbonat, når koncentrationerne af calcium og carbonat overstiger deres opløselighed, KSP = [ca2 +] [co3 2-]. En ekstra blandingsmetode er dobbelt jet-proceduren8. Ved denne metode injiceres hvert opløseligt salt fra en separat sprøjte til en omrørt opløsning, der indeholder tilsætningsstoffet, hvor calciumcarbonat udfældes. Her er injektionen og derfor blandings hastigheden velkontrolleret, i modsætning til den tidligere metode, hvor blandingen styres ved diffusion.
Den anden metode, der bruges til at krystallisere CaCO3 , er Kitano-metoden9. Denne metode er baseret på ligevægt mellem karbonat/hydrogencarbonat (2hco3- (aq) + ca2 +(aq) 
CaCO3 (s) + Co2 (g) + H2O (l)). Her er CO2 bukkede i en opløsning, der indeholder CaCO3 i en fast form, flytte balancen til venstre og derfor opløse calciumcarbonat. Det uopløste calciumcarbonat filtreres, og de ønskede additiver tilsættes til den bicarbonat-rige opløsning. CO2 får derefter lov til at fordampe og derved flytte reaktionen til højre og danne calciumcarbonat ved tilstedeværelse af tilsætningsstofferne.
Den tredje metode til calciumcarbonat krystallisering, som vi vil beskrive her, er damp diffusion metode10. I denne opsætning anbringes det organiske tilsætningsstof, opløst i en opløsning af calciumchlorid, i et lukket kammer nær ammonium karbonat i pulverform. Når ammonium karbonat pulver nedbrydes til kuldioxid og ammoniak, diffus de i opløsningen indeholdende calciumioner (fx CaCl2), og calciumcarbonat er fældet (Se figur 1 for illustration). Calciumkarbonat krystaller kan vokse ved langsom nedbør eller ved hurtig nedbør. Til den langsomme nedbør anbringes en opløsning, der indeholder tilsætningsstoffet i CaCl2 , i en ekssikkator ved siden af ammonium karbonat pulveret. I den hurtige nedbør, der er beskrevet udførligt i protokollen, anbringes både additiv opløsningen og ammonium karbonat tættere sammen i en multi-brønd plade. Den langsomme nedbør metode vil producere færre nukleation Centre og større krystaller, og den hurtige nedbør vil resultere i flere kimdannelse Centre og mindre krystaller.
De metoder, der er beskrevet ovenfor, adskiller sig i deres tekniske kompleksitet, i kontrolniveauet og i satsen for udfældnings processen. Blandings metoden kræver en speciel opsætning6 for både dobbelt jet og tre-cellet system. I blandings metoden er tilstedeværelsen af andre opløselige modoner (f. eks. na+, CL-)6 uundgåelig, hvorimod i Kitano-metoden er calcium og (BI) carbonat de eneste ioner i opløsning, og det indebærer ikke tilstedeværelsen af yderligere (f. eks. na+, CL-). Desuden kræver blandings metoden relativt store volumener, og derfor egner den sig ikke til at arbejde med dyre biopolymere. Fordelen ved den dobbelte jet er, at det er muligt at kontrollere satsen for opløsning injektion, og at det er en hurtig proces i forhold til andre metoder.
Fordelen ved Kitano-metoden og damp diffusions metoden er, at dannelsen af calciumcarbonat styres ved diffusion af CO2 til/fra en CaCl2 -opløsning, hvilket gør det muligt at sonde langsommere nukleation og nedfældnings processer 11 , 12. Desuden kan dannelse af calciumcarbonat ved diffusion af co2 ligne forkalknings processer i vivo13,14,15. I denne metode, veldefinerede og adskilte krystaller dannes16. Endelig kan virkningen af enkelt eller flere biopolymere på dannelsen af calciumcarbonat testes. Dette muliggør en systematisk undersøgelse af virkningen af en række additiv koncentrationer på dannelse af calciumcarbonat samt en undersøgelse af blandinger af biopolymere-alle udført på en kontrolleret måde. Denne metode er velegnet til brug med et stort udvalg af koncentrationer og volumener af tilsætningsstoffer. Den minimale mængde, der anvendes, er ca. 50 μL, og derfor er denne metode fordelagtig, når der er en begrænset mængde af de tilgængelige biopolymere. Den maksimale volumen afhænger af tilgængeligheden af en større brønd plade eller af den ekssikkator, hvori pladen eller bægerglasset med CaCl2 skal indsættes. Metoden beskrevet nedenfor er blevet optimeret til at arbejde i en 96-brønd plade med en biopolymer valgt til at være proteinet TapA17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. krystallisering af calciumcarbonat
- Forberedelse og optimering af kontrol
- Forbered rene glas stykker. Brug den samme rengøringsprocedure til at rengøre glasvarer.
- Brug en diamant pen til at klippestykker af en glasmikroskop slide, så de passer i en brønd af en 96-brønd plade.
Bemærk: 5 mm x 5 mm stykker skal i høj grad passe. - Placer glas stykkerne i et bæger med tredobbelt destilleret vand (TDW), så vandet dækker glas gliderne og soniker i et bad sonicator i 10 minutter.
- Decant vandet, tilsæt ethanol til at dække glas slides, og sonikatet i et bad sonicator i 10 min.
- Tør slides og glasvarer med en strøm af nitrogen gas og placere dem i en luft plasma renere i 10 min ved 130 W.
- Brug en diamant pen til at klippestykker af en glasmikroskop slide, så de passer i en brønd af en 96-brønd plade.
- Optimer koncentrationen af CaCl2 , der anvendes i forkalkning eksperimenter udført under de ønskede eksperimentelle betingelser for at opnå en prøve rig med glat facetteret calcit krystaller (uden eller i det mindste med et begrænset antal vaterite krystaller).
- Fyld brøndene i hjørnerne af en 96-brønd plade med ammonium karbonat pulver og forsegle pladen ved hjælp af aluminiumsfolie; dæk folien med paraffin folie. Rengør eventuelt rest ammonium karbonat ved hjælp af nitrogen gas.
Forsigtig: ammonium karbonat irriterer næse og lunger; Brug kun inde i røghætten. - Forbered en stamopløsning på 0,5 M CaCl2. Denne stamopløsning vil blive brugt til at forberede en gradient af koncentrationer af CaCl2 opløsninger i multi-brønd pladen.
Bemærk: en 10 mL stamopløsning er tilstrækkelig til hele forsøget. - Placer de tidligere klippede og rengjorte glas stykker i fem forskellige brønde. Brug de nærmeste brønde til centrum.
- Fyld hver brønd forsynet med et glas stykke med 100 μL af en CaCl2 opløsning16. Bland TDW og 0,5 M CaCl2 (lager) for at opnå en stigende koncentrations gradient af CaCl2 på tværs af de forskellige brønde. Hvis der anvendes en anden størrelse brønd plade, justeres koncentrationen af CaCl2 for at opnå separate calcit krystaller (trin 1.1.2.10, og se diskussions afsnit).
Bemærk: en stigende CaCl2 gradient af 10, 20, 30, 40, 50 mm koncentrationer i separate brønde anvendes i denne protokol. For at øge koncentrationsintervallet eller antallet af testede koncentrationer skal du bruge ekstra brønde. - Punktering dækslet af hver af brøndene indeholder ammoniumcarbonat 3x med en nål.
- Sæt låget på igen, Forsegl grænserne med paraffin folie, og opbevar det ved 18 °C i en inkubator i 20 timer.
- Efter inkubationen, Åbn låget forsigtigt inde i en stinkhætte og fjern krystallerne dannet ved vand/luft-grænsefladen med en løkke.
- Brug en pincet til at overføre glasstykkerne til et bægerglas, der indeholder dobbeltdestilleret vand (DDW). Fjern prøverne fra bægerglasset, og brug et dobbeltsidet tape til at fastgøre glas stykkerne på bunden af Petri skålen.
- Tør overdreven vand røre kanterne af diaset med væv klude. Dæk Petri skålen, og anbring den i en ekssikkator i 24 timer.
- Overhold krystallerne dannet på glas stykker med et stereoskop (3.5 x forstørrelse) og/eller et opretstående optisk mikroskop (10x-40x forstørrelse). Hvis kontrol løsningerne er rene, vil der blive observeret rhombohedral krystaller (sandsynligvis calcite) med et optisk mikroskop (figur 2A).
- Hvis det ud over de rhombohedral krystaller, kontrolelementet indeholder sfæriske krystaller (mest sandsynlige vaterite, figur 2B), eller hvis scanning elektronmikroskop (SEM) billeder viser rhombohedral krystaller med rå snarere end glatte ansigter ( Figur 3 A, B), skal du gentage krystalliserings protokollen for at sikre, at rense trinnet (1.1.1) er udført korrekt. Ydermere skal man passe bedre på, at der ikke findes ammonium karbonat i andre områder end de dedikerede brønde. Ellers skal du fortsætte til næste trin.
- Fyld brøndene i hjørnerne af en 96-brønd plade med ammonium karbonat pulver og forsegle pladen ved hjælp af aluminiumsfolie; dæk folien med paraffin folie. Rengør eventuelt rest ammonium karbonat ved hjælp af nitrogen gas.
- Forbered rene glas stykker. Brug den samme rengøringsprocedure til at rengøre glasvarer.
- Krystallisering ved tilstedeværelse af tilsætningsstofferne
- For at studere virkningen af tilsætningsstofferne på krystalliseringen af CaCO3, oprette en multi-brønd plade, der indeholder (i forskellige brønde), en kontrol CaCl2 løsning uden tilsætningsstoffer, og CaCl2 opløsninger med tilsætningsstofferne. Brug den optimale koncentration af CaCl2 , som findes i afsnit 1.1.2 for eksperimentet.
Bemærk: nedenstående protokol bruger optimale betingelser som dem, der er rapporteret i et tidligere studie16. - Gentag trin 1.1.2.2.
- Ammonium karbonat pulver placeres i hjørnerne af pladen som beskrevet i trin 1.1.2.1.
- I hver brønd, hvor udfældning vil forekomme, skal du placere et glas stykke, der blev skåret og renset som beskrevet i punkt 1.1.1.
- For at tilberede kontrol brønde skal du afpipettere 90 μL TDW i kontrol brøndene. Forbered mindst én replikat af hver brønd, herunder kontrol. Hvis det anvendte tilsætningsstof er i en bufferopløsning, skal der pipetteres 90 μL buffer i stedet for TDW-vand.
- Forbered de additiv-holdige brønde. Gentag trin 1.2.5 ved at tilsætte 90 μL af den additive opløsning i vand. Hvis tilsætningsstoffet er i buffer (i stedet for TDW), skal du forjustere koncentrationen af tilsætningsstoffet med buffer for at opfylde den ønskede endelige koncentration. Opbevar et samlet volumen på 90 μL; pipetten først tilsætningsstoffet, derefter bufferen.
Bemærk: en endelig koncentration på 10 μM af proteinet TapA i 100 mM NaCl, 25 mM Tris pH 8,0 buffer16 anvendes i denne protokol. - Der tilsættes 10 μL 0,5 M CaCl2 stamopløsning (forberedt i trin 1.2.2) til både kontrollerne og de tilsætningsstoffer, der indeholder brønde, for at nå en endelig koncentration på 50 mm CaCl2.
- Gentag trin 1.1.2.5-1.1.2.9.
- For at studere virkningen af tilsætningsstofferne på krystalliseringen af CaCO3, oprette en multi-brønd plade, der indeholder (i forskellige brønde), en kontrol CaCl2 løsning uden tilsætningsstoffer, og CaCl2 opløsninger med tilsætningsstofferne. Brug den optimale koncentration af CaCl2 , som findes i afsnit 1.1.2 for eksperimentet.
2. karakterisering af calciumkarbonat krystaller
- Med et scannings elektronmikroskop, observere de calciumkarbonat krystaller dannet i nærværelse af tilsætningsstofferne ved en højere opløsning end den, der opnås ved optisk mikrokopi (Se trin 1.1.2.10).
- Monter de glas stykker, der indeholder krystallerne, på en aluminiums stub med dobbeltsidet Carbon tape.
- Coat med et lag af AU/PD til 40-50 s.
- Erhverve billederne ved 5 kV acceleration spænding.
Bemærk: figur 3a viser en repræsentativ SEM billede af calciumkarbonat krystaller dannet i en ordentlig kontrol eksperiment, mens figur 4 viser repræsentative billeder af calciumkarbonat krystaller dannet i nærværelse af protein TapA .
- Udfør Micro Raman spektroskopi for at bestemme calciumkarbonat polymorphs dannet. Micro Raman tillader indsamling af et Raman spektrum fra enkelt krystaller snarere end fra et helt pulver.
- Brug en 20x mål af mikroskopet til at vælge den krystal af interesse.
- Saml Raman spektret i et område på 100 − 3200 cm-1 ved hjælp af en 514 nm argon laser.
Bemærk: figur 5 viser repræsentative spektre af calcit (A) og vaterite (B). For spektret af aragonit henvises til reference18.
-
Kvantificering af masse procenten af tilsætningsstofferne i CaCO3 -udfældningen
- Efterprøvning/måling af ekstinktionskoefficienten (ε) for det anvendte tilsætningsstof. En proteinets ekstinktionskoefficient kan gives af online servere19. Hvis ekstinktionskoefficienten er ukendt, måles absorbansen af tilsætningsstoffet i forskellige koncentrationer, plot absorbansen vs. koncentrationen og Beregn udslettelses koefficienten fra kurvens hældning.
- Vejeglas stykker, hvor krystallerne dannes, helst bruge en mikrobalance.
- Skrot krystallerne af glasset i 1,2 mL 0,1 M eddikesyre opløsning, vortex og sonikatet prøven. Prøven opbevares ved stuetemperatur i 24 timer.
Forsigtig: eddikesyre er meget farlig i tilfælde af hud-eller øjenkontakt; håndteres med forsigtighed og bortskaffes efter forskrifterne. - Vejning glasset glide efter skrabning af krystallerne.
- Mål UV/Vis-absorbans (A) -spektret af opløsningen. Hvis tilsætningsstoffet er et protein, måles absorbansen ved 280 Nm, og dens koncentration (C)beregnes ved hjælp af Beer-Lambert-ligningen:
hvor l er den optiske vej inde i kuvetten. - Brug koncentrationen (C) , der findes i 2.3.5, og den anvendte mængde (V = 1,2 ml) til at beregne massen (m) af tilsætningsstofferne i/på krystallerne. Hvis koncentrationen er i mg/ml, skal du bruge ligningen C ● V = m.
- Hvis koncentrationen er i mol/L, beregnes molerne (n) , der anvender C ● V = n. Brug derefter molekylvægten (MW) til at beregne massen (m) af additiver (m = n ● MW).
- Beregn vægtprocenten af tilsætningsstofferne i/på krystallerne ved hjælp af ligningen:
, hvor m er massen af tilsætningsstofferne, og δms er massen af de calciumkarbonat krystaller, der blev skrottet af glasset Stykke.
, hvor m er massen af tilsætningsstofferne, og δms er massen af de calciumkarbonat krystaller, der blev skrottet af glasset Stykke.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skematisk af den eksperimentelle opsætning er vist i figur 1. Kort sagt anvendes diffusions metoden for at danne calciumkarbonat krystaller i 96-brønd plader og teste effekten af Biopolymerer på morfologien og strukturen af calciumkarbonat krystaller. I disse forsøg nedbrydes ammoniumcarbonat til ammoniak og CO2, som diffus til calciumkarbonat opløsninger, hvilket resulterer i dannelsen af calciumkarbonat krystaller (figur 1 og figur 2).
Virkningen af biopolymerne evalueres ved sammenligning af de calciumkarbonat krystaller, der dannes med og uden (kontrol) tilsætningsstofferne. Før tilsætning af tilsætningsstofferne vælges den optimerede calciumkarbonat koncentration, og renholdelse af opløsninger og glasvarer testes. Figur 2 A viser et repræsentativt billede af et kontrol eksperiment, hvor der dannes særskilte rhombohedral calciumkarbonat krystaller. Disse krystaller er sandsynligvis calcit (Se figur 5). Hvis løsningerne eller plast-eller glasvarer ikke er blevet rengjort korrekt, vil sfæriske krystaller dannes (figur 2B, mærket med røde cirkler) ud over de rhombohedral calcit krystaller. De sfæriske krystaller er sandsynligvis vaterite (Se figur 5). En yderligere indikation for brugen af korrekte betingelser, er glathed af calcit ansigter i kontrol eksperiment. Dette kan observeres med SEM, som vist i figur 3. Figur 3 A viser en ordentlig kontrol med glatte calcit ansigter, mens figur 3B viser calcit krystaller med ansigter sammensat af trin. De sfæriske krystaller her er vaterite. Kontrol krystallerne skal adskilles og være glat facetteret, så virkningen af tilsætningsstofferne på krystal morfologien er klar.
For at demonstrere effekten af en biopolymer på morfologien af calciumcarbonat, har vi brugt her protein TapA. Figur 4 viser krystallerne af calciumcarbonat dannet i nærværelse af TapA i opløsningen. Krystallerne adskiller sig fra kontrol krystaller. De danner en kompleks sfærisk calciumcarbonat samling, sammensat af flere calcit mikrokrystaller (Se Raman spektrum i figur 5). En metode til at karakterisere strukturen af krystallerne er Raman spektroskopi. Figur 5 viser den typiske spektre af calcit (figur 5A) og vaterite (figur 5B), taget fra vellykkede (A) og mislykket (b) kontrol eksperimenter. Typiske absorbans toppe20 er i intervallet 100 − 400 cm-1 (gitter tilstande), et højdepunkt ved ~ 710 cm-1 (symmetrisk bøjning af co32-) og ved ~ 1090 cm-1 (symmetrisk strækning af co3 2-). Bemærk opdelingen af Raman Shift på ~ 1080 cm-1 , der er den mest indlysende karakteristisk for vaterite21. Henvis til reference22 for et fuldt spektrum af aragonit. Den Raman spektrum af krystaller dannet i nærværelse af TapA er magen til spektret af calcit (figur 5A). I tilfælde, hvor der forekommer yderligere toppe, som ikke svarer til et enkelt spektrum af en enkelt calciumcarbonat polymorph, eller en kombination af disse, kan de tilskrives et overskud af calciumchlorid, der ikke er blevet vasket grundigt i trin 1.1.2.8.
I den sidste del af protokollen, har vi målt procentdelen (vægt/vægt) af det organiske indhold i eller på calciumkarbonat krystaller. Krystallerne blev opløst i eddikesyre og biopolymer blev frigivet i opløsningen. I tilfælde, hvor biopolymer har et karakteristisk absorbans spektrum, kan dets koncentration i opløsningen bestemmes. For proteiner, der indeholder aromatiske sidegrupper, anvendes absorbansen ved 280 Nm som i casestudie her for TapA. Den absorbans spektrum af TapA, målt efter opløsningen af krystallerne i syre, er vist i figur 6 (grøn) sammen med spektret af kontrol (syre-opløst calciumkarbonat krystaller uden tilsætningsstoffet; sort). Ved hjælp af Beer-Lamberts lov (Se trin 2.3.5) og ved hjælp af en ekstinktionskoefficient på 29.700 M-1 cm-1, har vi konstateret, at massen procent af TapA var 1,8% ± 0,2%. Det er muligt at måle absorbansen af opløsningen efter krystal opløsningen i syre, når biopolymerne ikke aggregerer ved lav pH. Et null-signal for absorbansen af opløsningen, der indeholder tilsætningsstoffet, er en indikation af dets sammenlægning. I dette tilfælde, forskellige analysemetoder, såsom termisk gravitations analyse (TGA) kan anvendes til at anslå massen af tilsætningsstoffer til stede inde/på krystallerne.
Figur 1 : Skematisk beskrivelse af den hurtige damp diffusions metode til dannelse af calciumkarbonat krystaller. Et calcium-indeholdende opløseligt salt (f. eks. calciumchlorid) anbringes i nærheden af et ammonium karbonat pulver. Her viser vi to brønde i en 96-brønd plade. Pladen forsegles derefter, og ammonium karbonat nedbrydes til ammoniak og kuldioxid, der diffust ind i calcium-holdige brønd, hvilket resulterer i udfældningen af calciumkarbonat krystaller (vist her ved SEM billede af en calcit krystal). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Optiske mikroskop billeder af calciumkarbonat krystaller. En ren kontrol indeholder for det meste calcite, som er karakteriseret ved rhombohedral krystaller (A). Når kontrolprøven omfatter sfæriske krystaller (f. eks. dem, der er markeret med en rød cirkel) (B), gentages rense protokollen som foreslået i punkt 1.1.1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Scanning af elektron mikrografer af calciumkarbonat krystaller dannet i to kontrol eksperimenter. A) et billede af en prøve, der hovedsagelig indeholder rhombohedral krystaller (calcite). (B) en Mikrograf af en prøve med knuste calcit facetter og sfæriske krystaller, der er mest sandsynligt vaterite. I dette tilfælde skal kontrol eksperimenter gentages. Dette tal er blevet modificeret fra Azulay et al.16. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : SEM billeder af calcit krystaller dannet i nærværelse af protein TapA. Skala søjler repræsenterer henholdsvis 50 μm (A) og 10 μm (B). Dette tal er blevet modificeret fra Azulay et al.16. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Raman Spectra af to polymorffer af calciumcarbonat. (A) calcite. B) vaterite. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : UV/Vis absorbans spektre af TapA (grøn) og en bufferopløsning (100 mm NaCl, 25 mm Tris pH 8,0; sort). Absorbansen blev anvendt til at beregne koncentrationen af TapA i calciumkarbonat krystallerne efter deres opløsning i syre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metode, der er beskrevet her, har til formål at danne calciumkarbonat krystaller i tilstedeværelse af organiske tilsætningsstoffer og evaluere effekten af organiske Biopolymerer på morfologien og strukturen af calciumkarbonat krystaller in vitro. Metoden er baseret på sammenligningen af de krystaller, der dannes i tilstedeværelsen af de organiske tilsætningsstoffer, til de calcit krystaller, der dannes i kontrol forsøget. Vi har vist, hvordan man bruger diffusions metoden til dannelse af calciumkarbonat krystaller, hvordan man karakteriserer deres morfologi ved hjælp af optisk og elektronmikroskopi, hvordan man karakteriserer deres struktur ved hjælp af Raman spektroskopi, og hvordan man kan bestemme det organiske indhold (vægt/vægtprocent) af krystallerne.
Vi beskrev den protokol, som vi har brugt til at evaluere effekten af en bakteriel ekstracellulær protein, TapA, på morfologien og strukturen af calciumcarbonat, men protokollen kan bruges til enhver anden polymer, der er biologisk renset eller syntetiseret. Ud over effekten af en enkelt biopolymer kan denne metode anvendes sammen med blandinger af biopolymere for at vurdere enhver gensidighed mellem forskellige polymerer i deres virkning på calciumcarbonat nedbør. Vi har begrænset den eksperimentelle set-up til en 96-brønd plade; enhver anden opsætning, hvor calciumkarbonat opløsninger er anbragt og fysisk adskilt fra ammonium karbonat kilden (dvs. at opløsninger og pulver anbringes i et forseglet fartøj), er dog mulig. Typiske anvendte beholdere er multi-brønd plader og et typisk koncentrationsområde på 10-50 mm anvendes til en eksperimentel opsætning med 96-brønd plader10,16,23. Der kan også anvendes et forseglet bægerglas eller en ekssikkator.
Denne metode er nem at bruge og det er kompatibelt med lave koncentrationer og lave volumener af biopolykemeje tilsætningsstoffer. Arbejde i en multi-brønd plade tillader screening af flere parametre på samme tid i en multi-brønd plade eksperiment. Denne metode kan være følsom over for den relative position af calciumkarbonat brønde med hensyn til placeringen af ammonium karbonat pulver. Derfor skal der udvises forsigtighed for altid at bruge brønde på samme position i multi-brønd pladen og også for at kontrollere, at ændring af placeringen af brøndene ikke påvirker resultaterne. Normalt, ved hjælp af en stor nok afstand mellem brøndene, hvor forsøgene finder sted, og ammonium karbonat pulver, sikrer, at resultaterne er reproducerbare. Desuden er det afgørende at justere koncentrationen af CaCl2 opløsning, således at der dannes separate krystaller i kontrol forsøget, som beskrevet i punkt 1.1.2. Koncentrationen af tilsætningsstofferne bør også optimeres til at overskride en minimal koncentration, hvorunder der ikke observeres nogen effekt. Bemærk, at metoden er meget følsom over for koncentrationen af tilsætningsstofferne; forskellige additiv koncentrationer kan fremkalde en anden virkning på morfologien og strukturen af calciumkarbonat krystaller24.
En væsentlig begrænsning af denne metode er, at ammoniak og CO2 både diffus i calciumklorid testopløsninger og derfor er der dårlig kontrol af ph gennem hele eksperimentet. Som følge af spredningen af ammoniak øges pH i opløsningen (når ammoniak bliver ammonium), som vist i ligevægts ligninger5,6 ((NH4)2Co3 (s) → 2nh3 (g) + Co2 (g) + H 2 O(l), NH3 (aq) + H2O(l) → NH4+(aq) + Oh-(aq), ca2 +(aq) + Co2 (aq ) + 2OH-(aq) CaCO3 (s) + H2O (l)) og det favoriserer dannelsen af calciumcarbonat.
Sammenlignet med de yderligere metoder, der er beskrevet i indledningen, er denne metode teknisk enkel. På grund af den langsomme nedbør proces, kan krystalvækst følges i realtid, ved hjælp af absorbans eller spredning teknikker fra den gennemsigtige multi-brønd teknik. Hertil kommer, for at følge kinetikken af krystalvæksten, kan man også sonde krystal morfologi og struktur på forskellige tidspunkter, snarere end efter 20 timer, som udføres i vores undersøgelse. Denne metode kan udvides til at studere udfældningen af andre salte af carbonat forsynet med en lille nok KSP, såsom magnesium, barium og cadmium carbonater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Prof. Lia Addadi, Prof. Jonathan eRez og Dr. Yael politi for frugtbare diskussioner. Denne forskning er blevet støttet af den israelske videnskabs fond (ISF), Grant 1150/14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Gadot | 64-19-7 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 506-87-6 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 10035-04-8 | |
| Ethanol Absolute | Gadot | 64-17-5 | |
| Micro-Raman | Renishaw | inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 90i model | |
| Nis elements Br software | Nikon | For microscope imaging | |
| Scanning Electron Microscope | ThermoFisher Scientific | FEI Sirion microscope | |
| Spectrophotometer | JASCO | V-670 model | |
| Sputter coater | Polaron | SC7640 model |
References
- Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190 (4212), 377-379 (1975).
- Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase. Science. 306 (5699), 1161-1164 (2004).
- Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. Journal of Structural Biology. 183 (2), 258-269 (2013).
- Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. Biomineralization: from nature to application. 12, John Wiley & Sons. (2008).
- Nielsen, M. H., Lee, J. R. I. Methods in Enzymology. De Yoreo, J. J. 532, Academic Press. 209-224 (2013).
- Page, M. G., Cölfen, H. Improved Control of CaCO3 Precipitation by Direct Carbon Dioxide Diffusion: Application in Mesocrystal Assembly. Crystal Growth & Design. 6 (8), 1915-1920 (2006).
- Wang, H., Huang, W., Han, Y. Diffusion-reaction compromise the polymorphs of precipitated calcium carbonate. Particuology. 11 (3), 301-308 (2013).
- Sedlák, M., Antonietti, M., Cölfen, H. Synthesis of a new class of double-hydrophilic block copolymers with calcium binding capacity as builders and for biomimetic structure control of minerals. Macromolecular Chemistry and Physics. 199 (2), 247-254 (1998).
- Kitano, Y., Park, K., Hood, D. W. Pure aragonite synthesis. Journal of Geophysical Research. 67 (12), 4873-4874 (1962).
- Politi, Y., Mahamid, J., Goldberg, H., Weiner, S., Addadi, L. Asprich mollusk shell protein: in vitro experiments aimed at elucidating function in CaCO3 crystallization. CrystEngComm. 9 (12), 1171-1177 (2007).
- Gehrke, N., Cölfen, H., Pinna, N., Antonietti, M., Nassif, N. Superstructures of Calcium Carbonate Crystals by Oriented Attachment. Crystal Growth & Design. 5 (4), 1317-1319 (2005).
- Rudloff, J., et al. Double-Hydrophilic Block Copolymers with Monophosphate Ester Moieties as Crystal Growth Modifiers of CaCO3. Macromolecular Chemistry and Physics. 203 (4), 627-635 (2002).
- Boquet, E., Boronat, A., Ramos-Cormenzana, A. Production of Calcite (Calcium Carbonate) Crystals by Soil Bacteria is a General Phenomenon. Nature. 246, 527 (1973).
- Cohen, A. L., McConnaughey, T. A. Geochemical Perspectives on Coral Mineralization. Reviews in Mineralogy and Geochemistry. 54 (1), 151-187 (2003).
- Erez, J. Vital effect on stable-isotope composition seen in foraminifera and coral skeletons. Nature. 273, 199 (1978).
- Azulay, D. N., et al. Biopolymers from a Bacterial Extracellular Matrix Affect the Morphology and Structure of Calcium Carbonate Crystals. Crystal Growth & Design. 18 (9), 5582-5591 (2018).
- Abbasi, R., et al. The Bacterial Extracellular Matrix Protein TapA Is a Two-Domain Partially Disordered Protein. ChemBioChem. , (2018).
- Gauldie, R. W., Sharma, S. K., Volk, E. Micro-raman spectral study of vaterite and aragonite otoliths of the coho salmon, Oncorhynchus kisutch. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 118 (3), 753-757 (1997).
- Gasteiger, E., et al. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer. 571-607 (2005).
- Gunasekaran, S., Anbalagan, G., Pandi, S. Raman and infrared spectra of carbonates of calcite structure. Journal of Raman Spectroscopy. 37 (9), 892-899 (2006).
- Trushina, D. B., Bukreeva, T. V., Kovalchuk, M. V., Antipina, M. N. CaCO3 vaterite microparticles for biomedical and personal care applications. Materials Science and Engineering: C. 45, 644-658 (2014).
- Weiss, I. M., Tuross, N., Addadi, L., Weiner, S. Mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite. Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 478-491 (2002).
- Yamamoto, Y., Nishimura, T., Saito, T., Kato, T. CaCO3/chitin-whisker hybrids: formation of CaCO3 crystals in chitin-based liquid-crystalline suspension. Polymer Journal. 42, 583 (2010).
- Magnabosco, G., et al. Insights on the interaction of calcein with calcium carbonate and its implications in biomineralization studies. CrystEngComm. 20 (30), 4221-4224 (2018).
