Summary
We beschrijven een protocol voor de precipitatie en karakterisering van calciumcarbonaat kristallen die vormen in de aanwezigheid van biopolymeren.
Abstract
Biomineralisatie is de vorming van mineralen in de aanwezigheid van organische moleculen, vaak gerelateerd aan functionele en/of structurele rollen in levende organismen. Het is een complex proces en daarom is een eenvoudig, in vitro systeem nodig om het effect van geïsoleerde moleculen op het biomineralisatie proces te begrijpen. In veel gevallen wordt biomineralisatie geregisseerd door biopolymeren in de extracellulaire matrix. Om het effect van geïsoleerde biopolymeren op de morfologie en de structuur van calciet in vitro te evalueren, hebben we de damp diffusiemethode gebruikt voor het neerslaan van calciumcarbonaat, het scannen van elektronenmicroscopie en micro Raman voor de karakterisering, en ultraviolette-zichtbare (UV/VIS) extinctie voor het meten van de hoeveelheid biopolymeer in de kristallen. Bij deze methode worden de geïsoleerde biopolymeren, opgelost in een calciumchloride oplossing, blootgesteld aan gasvormige ammoniak en koolstofdioxide die afkomstig zijn van de afbraak van massief ammoniumcarbonaat. Onder de omstandigheden waarin het oplosmiddel van calciumcarbonaat wordt bereikt, worden precipiteert calciumcarbonaat en kristallen gevormd. Calciumcarbonaat heeft verschillende polymorfen die verschillen in hun thermodynamische stabiliteit: amorfe calciumcarbonaat, vaterite, aragoniet, en calciet. Bij afwezigheid van biopolymeren, onder schone omstandigheden, is calciumcarbonaat meestal aanwezig in de calciet vorm, wat de meest thermodynamisch stabiele polymorf van calciumcarbonaat is. Deze methode onderzoekt het effect van de biopolymere additieven op de morfologie en structuur van calciumcarbonaat kristallen. Hier demonstreren we het protocol door de studie van een extracellulair bacterieel eiwit, TapA, op de vorming van calciumcarbonaat kristallen. Specifiek richten we ons op de experimentele opstelling, en karakterisatie methoden, zoals optische en elektronenmicroscopie evenals Raman-spectroscopie.
Introduction
Biomineralisatie is de vorming van mineralen in de aanwezigheid van organische moleculen, vaak gerelateerd aan functionele en/of structurele rollen in levende organismen. Biomineralisatie kan intracellulaire, zoals in de vorming van magnetiet binnen magnetotactische bacteriën1, of extracellulaire, zoals in de vorming van calciumcarbonaat in zee--egels spikes2, van hydroxyapatiet die is gerelateerd met collageen in botten3 en glazuur die wordt geassocieerd met amelogenin in tanden4. Biomineralisatie is een complex proces dat afhangt van vele parameters in het levende organisme. Daarom is het, om het onderzochte systeem te vereenvoudigen, noodzakelijk om het effect van afzonderlijke componenten op het proces te evalueren. In veel gevallen wordt biomineralisatie geïnduceerd door de aanwezigheid van extracellulaire biopolymeren. Het doel van de hier gepresenteerde methode is als volgt: (1) het vormen van calciumcarbonaat kristallen in aanwezigheid van geïsoleerde biopolymeren in vitro, met behulp van een damp diffusie methode. (2) om het effect van de biopolymeren op de morfologie en structuur van calciumcarbonaat te bestuderen.
In de aanwezigheid van organische additieven worden in vitro drie methoden gebruikt voor het neerslaan van calciumcarbonaat in de nabijheid van5,6. De eerste methode, die wij als oplossingsmethode noemen, is gebaseerd op het mengen van een oplosbaar zout calcium (bv. CaCl2) met een oplosbaar zout van carbonaat (bv. natriumcarbonaat). Het mengproces kan op verschillende manieren worden uitgevoerd: binnen een reactor met drie cellen die worden gescheiden door poreuze membranen7. Hier bevat elk van de buitenste cellen een oplosbaar zout en de centrale cel bevat een oplossing met het te testen toevoegingsmiddel. Calcium en carbonaat diffuus van de buitenste naar de middelste cel, resulterend in het neerslaan van het minder oplosbare calciumcarbonaat wanneer de concentraties van calcium en carbonaat hun oplosbaarheids product overschrijden, KSP = [CA2 +] [co3 2-]. Een extra Meng methode is de double-Jet procedure8. Bij deze methode wordt elk oplosbaar zout van een afzonderlijke injectiespuit geïnjecteerd in een geroerd oplossing die het toevoegingsmiddel bevat, waarbij calciumcarbonaat neervalt. Hier, de injectie en dus de mengsnelheid is goed gecontroleerd, in tegenstelling tot de vorige methode waarbij menging wordt geregeld door diffusie.
De tweede methode die gebruikt wordt om CaCO3 te kristalliseren is de Kitano methode9. Deze methode is gebaseerd op het carbonaat/waterstof carbonaat-evenwicht (2hco3- (AQ) + CA2 +(AQ) 
CaCO3 (s) + co2 (g) + H2O (l)). Hier wordt CO2 in een vaste vorm in een oplossing met CaCO3 gebubbeld, waardoor het evenwicht naar links verschuift en het calciumcarbonaat daardoor oplost. Het onopgeloste calciumcarbonaat wordt gefilterd en de gewenste additieven worden toegevoegd aan de bicarbonaat-rijke oplossing. CO2 mag dan verdampen, waardoor de reactie naar rechts verschuift en calciumcarbonaat ontstaat in aanwezigheid van de additieven.
De derde methode van kristallisatie van calciumcarbonaat, die we hier zullen beschrijven, is de damp diffusiemethode10. In deze opstelling wordt het organische toevoegingsmiddel, opgelost in een oplossing van calciumchloride, in een gesloten kamer in de buurt van ammoniumcarbonaat in een poedervorm geplaatst. Wanneer ammoniumcarbonaat poeder in kooldioxide en ammoniak ontbindt, worden ze diffuus in de oplossing die calciumionen bevat (bv. CaCl2), en wordt calciumcarbonaat neergeprecipiteerd (Zie afbeelding 1 voor illustratie). De calciumcarbonaat kristallen kunnen groeien door langzame neerslag of door snelle neerslag. Voor de langzame neerslag wordt een oplossing die het toevoegingsmiddel in CaCl2 -oplossing bevat, in een exsiccator naast het ammoniumcarbonaat-poeder geplaatst. Bij de snelle neerslag, beschreven in de lengte van het Protocol, worden zowel de additieve oplossing als het ammoniumcarbonaat dichter bij elkaar geplaatst in een multi-well plaat. De langzame neerslag methode zal minder nucleatie centra en grotere kristallen produceren, en de snelle neerslag zal resulteren in meer nucleatie centra en kleinere kristallen.
De hierboven beschreven methoden verschillen in hun technische complexiteit, in het niveau van controle en in de snelheid van het neerslag proces. De Meng methode vereist een speciale set-up6 voor zowel de dubbele straal als het driecellige systeem. In de Meng methode is de aanwezigheid van andere oplosbare contra-ionen (bijv. na+, cl-)6 onvermijdelijk, terwijl in de Kitano-methode calcium en (BI) carbonaat de enige ionen in oplossing zijn en de aanwezigheid van extra tegen ionen (bijv. na+, cl-). Bovendien, de Meng methode vereist relatief grote volumes en daarom is het niet geschikt voor het werken met dure biopolymeren. Het voordeel van de dubbele straal is dat het mogelijk is om de snelheid van de oplossing injectie te regelen en dat het een snel proces is in vergelijking met andere methoden.
Het voordeel van de Kitano-methode en de damp diffusiemethode is dat de vorming van calciumcarbonaat wordt geregeld door diffusie van CO2 in/uit een CACL2 -oplossing, waardoor tragere nucleatie-en neerslag processen kunnen worden sonde 11 , 12. Bovendien kan de vorming van calciumcarbonaat door diffusie van co2 lijken op calcificatie processen in vivo13,14,15. In deze methode worden goed gedefinieerde en gescheiden kristallen gevormd16. Ten slotte kan het effect van enkelvoudige of meervoudige biopolymeren op de vorming van calciumcarbonaat worden getest. Dit maakt een systematische studie mogelijk van het effect van een reeks additieve concentraties op de vorming van calciumcarbonaat, evenals een studie van mengsels van biopolymeren-allemaal uitgevoerd op een gecontroleerde manier. Deze methode is geschikt voor gebruik met een groot aantal concentraties en volumes additieven. Het minimale gebruikte volume is ongeveer 50 μL en daarom is deze methode voordelig wanneer er een beperkte hoeveelheid beschikbare biopolymeren is. Het maximale volume is afhankelijk van de toegankelijkheid van een grotere goed plaat, of de exsiccator waarin de plaat of beker die CaCl2 bevat, moet worden ingebracht. De hieronder beschreven methode is geoptimaliseerd voor het werken in een 96-put plaat met een biopolymeer gekozen als de proteïne TapA17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kristallisatie van calcium carbonaat
- Controle voorbereiding en optimalisatie
- Maak schone glazen stukken. Gebruik dezelfde reinigingsprocedure om het glaswerk te reinigen.
- Gebruik een diamant pen om stukjes van een glazen Microscoop Slide te knippen zodat ze in een put van een 96-well plaat passen.
Opmerking: 5 mm x 5 mm stukken moeten grotendeels passen. - Plaats de glazen stukken in een bekerglas met drievoudig gedestilleerd water (TDW) zodat water de glaasjes en soniceren in een badsonicator gedurende 10 minuten bedekt.
- Decanteren het water, voeg ethanol toe om de glaasjes te bedekken en soniceren in een badsonicator gedurende 10 minuten.
- Droog de glaasjes en het glaswerk met een stroom stikstofgas en plaats ze gedurende 10 minuten in een lucht plasma reiniger bij 130 W.
- Gebruik een diamant pen om stukjes van een glazen Microscoop Slide te knippen zodat ze in een put van een 96-well plaat passen.
- Optimaliseer de concentratie van de CaCl2 die wordt gebruikt in de calcificatie-experimenten die worden uitgevoerd onder de gewenste experimentele omstandigheden om een monster rijk aan gladde calciet kristallen te bereiken (zonder of ten minste met een schaars aantal vateriet kristallen).
- Vul de putjes in de hoeken van een 96-boorput met ammoniumcarbonaat poeder en verzegel de plaat met behulp van aluminiumfolie; Bedek de folie met paraffine folie. Reinig alle residuele ammoniumcarbonaat met behulp van stikstofgas.
Let op: ammonium carbonaat irriteert neus en longen; Gebruik alleen binnen de rook afzuigkap. - Maak een stamoplossing van 0,5 M CaCl2. Deze voorraadoplossing wordt gebruikt om een gradiënt van concentraties CaCl2 oplossingen in de multi-well plaat te bereiden.
Opmerking: een 10 mL stockoplossing is voldoende voor het hele experiment. - Plaats de eerder gesneden en gereinigde glas stukken in vijf verschillende putjes. Gebruik de dichtstbijzijnde putjes naar het midden.
- Vul elke put met een glas stuk met 100 μL van een CaCl2 -oplossing16. Meng TDW en 0,5 M CaCl2 (Stock) om een toenemende concentratie gradiënt van CACL2 over de verschillende putjes te bereiken. Als een andere grootte goed plaat wordt gebruikt, pas de concentratie van CaCl2 om afzonderlijke calciet kristallen (stap 1.1.2.10, en zie discussie sectie).
Opmerking: in dit protocol wordt een toenemende CaCl2 gradiënt van 10, 20, 30, 40, 50 mm concentraties in afzonderlijke putten gebruikt. Gebruik extra putten om het concentratiebereik of het aantal geteste concentraties te verhogen. - Prik de afdekking van elk van de putjes met ammoniumcarbonaat 3x met een naald.
- Zet het deksel terug, sluit de randen af met paraffine folie en houd het op 18 °C in een incubator voor 20 uur.
- Na de incubatie, open het deksel voorzichtig in een rook afzuigkap en verwijder de kristallen gevormd aan de water/lucht-interface met een lus.
- Gebruik een pincet om de glazen stukken over te brengen in een bekerglas met dubbel distilleerd water (DDW). Verwijder de monsters uit het bekerglas en gebruik een dubbelzijdige tape om de glazen stukjes op de bodem van de Petri schaal te bevestigen.
- Droog overmatig water aanraken van de grenzen van de glijbaan met weefsel doekjes. Bedek de petrischaal en plaats hem in een exsiccator voor 24 uur.
- Let op de kristallen gevormd op de glazen stukken met een stereoscoop (3.5 x vergroting) en/of een rechtopstaande optische Microscoop (10x-40x vergroting). Als de controleoplossingen schoon zijn, zullen rombohedrale kristallen (hoogstwaarschijnlijk calciet) worden waargenomen met een optische Microscoop (Figuur 2A).
- Als naast de rhombohedral kristallen, de controle bevat sferische kristallen (hoogstwaarschijnlijk vaterite, Figuur 2B), of als scanning elektronen microscoop (SEM) beelden tonen rhombohedral kristallen met ruwe in plaats van gladde gezichten ( Figuur 3 A, B), herhaalt u het kristallisatie protocol om ervoor te zorgen dat de reinigingsstap (1.1.1) correct wordt uitgevoerd. Zorg er bovendien voor dat er geen ammoniumcarbonaat is in andere gebieden op de plaat dan de speciale putten. Ga anders verder met de volgende stap.
- Vul de putjes in de hoeken van een 96-boorput met ammoniumcarbonaat poeder en verzegel de plaat met behulp van aluminiumfolie; Bedek de folie met paraffine folie. Reinig alle residuele ammoniumcarbonaat met behulp van stikstofgas.
- Maak schone glazen stukken. Gebruik dezelfde reinigingsprocedure om het glaswerk te reinigen.
- Kristallisatie in aanwezigheid van additieven
- Om het effect van de additieven op de kristallisatie van CaCO3te bestuderen, stelt u een multi-well plaat in die (in verschillende putjes), een Control CACL2 -oplossing zonder de additieven en CACL2 -oplossingen met de additieven bevat. Gebruik de optimale concentratie van CaCl2 , gevonden in punt 1.1.2 voor het experiment.
Opmerking: het onderstaande protocol maakt gebruik van optimale omstandigheden zoals gerapporteerd in een eerdere studie16. - Herhaal stap 1.1.2.2.
- Plaats ammoniumcarbonaat poeder in de hoeken van de plaat zoals beschreven in stap 1.1.2.1.
- In elke put waar de neerslag zal voorkomen, plaats een glas stuk dat werd gesneden en gereinigd zoals beschreven in punt 1.1.1.
- Pipetteer 90 μL TDW in de controle putten om de controle putten voor te bereiden. Bereid ten minste één repliceren van elk goed met inbegrip van het besturingselement. Als het gebruikte additief in een bufferoplossing zit, pipetteer dan 90 μL buffer in plaats van TDW water.
- Bereid de additieve bevattende putten. Herhaal stap 1.2.5 door 90 μL van de additieve oplossing in water toe te voegen. Als het toevoegingsmiddel in buffer is (in plaats van TDW), moet de concentratie van het toevoegingsmiddel vooraf worden aangepast met buffer om te voldoen aan de gewenste eindconcentratie. Een totaal volume van 90 μL bewaren; Pipetteer eerst het additief, dan de buffer.
NB: een eindconcentratie van 10 μM eiwit TapA in 100 mM NaCl, 25 mM tris pH 8,0 buffer16 wordt in dit protocol gebruikt. - Voeg 10 μL van de 0,5 M CaCl2 -stamoplossing (in stap 1.2.2) toe aan zowel de bedieningsorganen als de toevoegingsmiddelen die een eindconcentratie van 50 mm CACL2bereiken.
- Herhaal de stappen 1.1.2.5-1.1.2.9.
- Om het effect van de additieven op de kristallisatie van CaCO3te bestuderen, stelt u een multi-well plaat in die (in verschillende putjes), een Control CACL2 -oplossing zonder de additieven en CACL2 -oplossingen met de additieven bevat. Gebruik de optimale concentratie van CaCl2 , gevonden in punt 1.1.2 voor het experiment.
2. karakterisering van calciumcarbonaat kristallen
- Met een scanning elektronen microscoop, observeren de calciumcarbonaat kristallen gevormd in de aanwezigheid van de additieven met een hogere resolutie dan die verkregen door optische micro kopie (zie stap 1.1.2.10).
- Monteer de glazen stukken met kristallen op een aluminium stub met dubbelzijdige Carbon tape.
- Jas met een laag au/pd voor 40-50 s.
- Verkrijg de beelden op 5 kV acceleratie spanning.
Opmerking: Figuur 3a toont een representatief SEM-beeld van calciumcarbonaat kristallen gevormd in een goed controle-experiment, terwijl Figuur 4 representatieve beelden toont van calciumcarbonaat kristallen gevormd in de aanwezigheid van de proteïne TapA .
- Voer micro Raman-spectroscopie uit om de gevormde calciumcarbonaat polymorfen te bepalen. Micro Raman laat de verzameling van een Raman spectrum van enkele kristallen in plaats van een hele poeder.
- Gebruik een 20x doelstelling van de Microscoop om het kristal van belang te kiezen.
- Verzamel het Raman-spectrum in een bereik van 100 − 3200 cm-1 met behulp van een 514 nm argon-laser.
Opmerking: Figuur 5 toont representatieve spectra van calciet (a) en vaterite (B). Voor het spectrum van aragoniet, zie referentie18.
-
Kwantificering van het massapercentage van de toevoegingsmiddelen in de CaCO3 precipitaten
- Controleer/meet de extinctiecoëfficiënt (ε) van het gebruikte toevoegingsmiddel. De extinctiecoëfficiënt van een eiwit kan worden gegeven door online servers19. Als de extinctiecoëfficiënt niet bekend is, meet de absorptie van het toevoegingsmiddel bij verschillende concentraties, plot de absorptie versus concentratie en bereken de extinctiecoëfficiënt vanaf de helling van de curve.
- Weeg de glazen stukken af waar de kristallen gevormd zijn, gebruik bij voorkeur een microbalans.
- Schroot de kristallen van het glas in 1,2 ml van 0,1 M azijnzuur oplossing, Vortex en sonificeren het monster. Bewaar het monster op kamertemperatuur gedurende 24 uur.
Let op: azijnzuur is zeer gevaarlijk in geval van huid-of oogcontact; voorzichtig omgaan en de voorschriften afvoeren. - Weeg de glazen schuif na het afschrapen van de kristallen.
- Meet het spectrum van de UV/VIS-extinctie (A) van de oplossing. Als het toevoegingsmiddel een eiwit is, meet dan de extinctie op 280 nm en bereken de concentratie (C), met behulp van de bier-Lambert vergelijking:
waarbij l het optische pad in de Cuvette is. - Gebruik de concentratie (C) gevonden in 2.3.5 en het gebruikte volume (V = 1,2 ml) om de massa (m) van de additieven in/op de kristallen te berekenen. Als de concentratie in mg/ml is, gebruik dan de vergelijking C ● V = m.
- Als de concentratie in mol/L ligt, bereken dan de mollen (n) die C ● V = ntoepassen. Gebruik vervolgens het molecuulgewicht (MW) om de massa (m) van de additieven (m = n ● MW) te berekenen.
- Bereken het gewichtspercentage van de additieven in/op de kristallen met behulp van
de vergelijking:, waarbij m de massa van de additieven is en δms de massa van de calciumcarbonaat kristallen die van het glas zijn gesloopt Stuk.
de vergelijking:, waarbij m de massa van de additieven is en δms de massa van de calciumcarbonaat kristallen die van het glas zijn gesloopt Stuk.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schematische weergave van de experimentele opstelling is afgebeeld in Figuur 1. In het kort wordt de diffusie methode gebruikt om calciumcarbonaat kristallen in 96-well Plates te vormen en het effect van biopolymeren op de morfologie en structuur van de calciumcarbonaat kristallen te testen. Bij deze experimenten wordt ammoniumcarbonaat ontleed in ammoniak en CO2, die zich verspreiden in oplossingen van calciumcarbonaat, wat resulteert in de vorming van calciumcarbonaat kristallen (Figuur 1 en Figuur 2).
Het effect van de biopolymeren wordt geëvalueerd door vergelijking van de calciumcarbonaat kristallen gevormd met en zonder (controle) de additieven. Voorafgaand aan de toevoeging van de additieven wordt de geoptimaliseerde concentratie van calciumcarbonaat gekozen en wordt de reinheid van de oplossingen en het glaswerk getest. Figuur 2 A toont een representatief beeld van een controle-experiment, waarbij verschillende rhombohedrale calciumcarbonaat kristallen worden gevormd. Deze kristallen zijn hoogstwaarschijnlijk calciet (Zie Figuur 5). Als de oplossingen of kunststof of glaswerk niet goed zijn gereinigd, zullen sferische kristallen worden vormgegeven (Figuur 2B, gemarkeerd met rode cirkels), naast de rhombohedral calciet kristallen. De sferische kristallen zijn hoogstwaarschijnlijk vateriet (Zie Figuur 5). Een extra indicatie voor het gebruik van de juiste omstandigheden, is de gladheid van de calciet gezichten in de controle-experiment. Dit kan worden waargenomen met SEM, zoals weergegeven in Figuur 3. Figuur 3 A toont een goede controle met gladde calciet gezichten, terwijl Figuur 3B toont calciet kristallen met gezichten samengesteld uit stappen. De sferische kristallen hier zijn vaterite. De controle kristallen moeten worden gescheiden en glad-facetten zodat het effect van de additieven op de kristal morfologie duidelijk is.
Om het effect van een biopolymeer op de morfologie van calciumcarbonaat aan te tonen, hebben we hier de proteïne TapA gebruikt. Figuur 4 toont de kristallen van calciumcarbonaat gevormd in de aanwezigheid van TapA in de oplossing. De kristallen onderscheiden zich van de controle kristallen. Ze vormen een complexe sferische calciumcarbonaat assemblage, samengesteld uit meerdere calciet microkristallen (Zie Raman spectrum in Figuur 5). Een methode om de structuur van de kristallen te karakteriseren is Raman-spectroscopie. Figuur 5 toont de typische spectra van calciet (Figuur 5A) en vateriet (Figuur 5B), afkomstig van succesvolle (a) en mislukte (B) controle experimenten. Typische extinctie pieken20 zijn in het bereik van 100 − 400cm-1 (Lattice modes), een piek bij ~ 710 cm-1 (symmetrische buigen van de co32-) en bij ~ 1090 cm-1 (symmetrische stretching van de co3 2-). Opmerking de splitsing van de Raman Shift op ~ 1080 cm-1 dat is de meest duidelijke kenmerk van vaterite21. Zie referentie22 voor een volledig spectrum van aragoniet. Het Raman spectrum van de kristallen gevormd in de aanwezigheid van TapA is vergelijkbaar met het spectrum van calciet (Figuur 5A). In gevallen waarin extra pieken voorkomen die niet overeenkomen met één enkel spectrum van één enkele calciumcarbonaat Polymorph of een combinatie daarvan, kunnen zij worden toegeschreven aan een overmaat calciumchloride dat niet grondig is gewassen in stap 1.1.2.8.
In het laatste deel van het protocol hebben we het percentage (gewicht/gewicht) van het organische gehalte binnen of op de kristallen van calciumcarbonaat gemeten. De kristallen werden opgelost in azijnzuur en de biopolymeer werd vrijgegeven in de oplossing. In gevallen waarin het biopolymeer een karakteristiek absorptiespectrum heeft, kan de concentratie ervan in de oplossing worden bepaald. In het geval van eiwitten die aromatische zijgroepen bevatten, zoals in de casestudy hier van TapA, wordt de extinctie bij 280 nm gebruikt. Het extinctie spectrum van TapA, gemeten na ontbinding van de kristallen in zuur, wordt weergegeven in Figuur 6 (groen) samen met het spectrum van de controle (zuur-opgeloste calciumcarbonaat kristallen zonder het additief; zwart). Met behulp van de wet van bier-Lambert (zie stap 2.3.5) en met een extinctiecoëfficiënt van 29.700 M-1 cm-1, hebben we geconstateerd dat de massaprocent van TapA 1,8% ± 0,2% was. Het meten van de extinctie van de oplossing na het kristal oplossen in zuur is mogelijk wanneer de biopolymeren niet samenvoegen bij lage pH. Een nulsignaal van de extinctie van de oplossing die het toevoegingsmiddel bevat, is indicatief voor de aggregatie ervan. In dit geval kunnen verschillende analysemethoden, zoals thermische zwaartekracht analyse (TGA), worden gebruikt om de massa van de aanwezige additieven in/op de kristallen te schatten.
Figuur 1 : Schematische beschrijving van de snelle damp diffusiemethode voor de vorming van calciumcarbonaat kristallen. Een calcium-bevattende oplosbaar zout (bijv. calciumchloride) wordt in de buurt van een ammoniumcarbonaat poeder geplaatst. Hier tonen we twee putten in een 96-wells plaat. De plaat wordt vervolgens verzegeld en het ammoniumcarbonaat ontleed in ammoniak en koolstofdioxide dat diffuus in de calcium-bevattende put, resulterend in de precipitatie van calciumcarbonaat kristallen (hier weergegeven door het SEM-beeld van een calciet kristal). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Optische Microscoop beelden van de calciumcarbonaat kristallen. Een schone controle bevat meestal calciet, dat wordt gekenmerkt door rhombohedrale kristallen (a). Wanneer het controlemonster sferische kristallen bevat (zoals die gemarkeerd door een rode cirkel) (B), herhaalt u het reinigings protocol zoals voorgesteld in punt 1.1.1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Scanning elektronen micro foto's van calciumcarbonaat kristallen gevormd in twee controle experimenten. A) een afbeelding van een monster dat voornamelijk rhombohedrale kristallen (calciet) bevat. B) een micro graaf van een monster met gebroken calciet facetten en sferische kristallen die hoogstwaarschijnlijk vateriet zijn. In dit geval moeten controle experimenten worden herhaald. Dit cijfer is gewijzigd van Azulay et al.16. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : SEM beelden van calciet kristallen gevormd in de aanwezigheid van de eiwit TapA. Schaalbalken vertegenwoordigen respectievelijk 50 μm (a) en 10 μm (B). Dit cijfer is gewijzigd van Azulay et al.16. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Raman spectra van twee polymorfen van calciumcarbonaat. A) calciet. B) vaterite. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : UV/VIS-extinctie spectra van TapA (groen) en een bufferoplossing (100 mm NaCl, 25 mm tris pH 8,0; zwart). De extinctie werd gebruikt om de concentratie van TapA in de calciumcarbonaat kristallen te berekenen, na de ontbinding in zuur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methode is gericht op het vormen van calciumcarbonaat kristallen in de aanwezigheid van organische additieven en het evalueren van het effect van organische biopolymeren op de morfologie en structuur van calciumcarbonaat kristallen in vitro. De methode is gebaseerd op de vergelijking van de kristallen gevormd in de aanwezigheid van de organische additieven aan de calciet kristallen gevormd in de controle-experiment. We hebben laten zien hoe we de diffusie methode gebruiken om de calciumcarbonaat kristallen te vormen, hoe ze hun morfologie karakteriseren met behulp van optische en elektronenmicroscopie, hoe ze hun structuur karakteriseren met behulp van Raman-spectroscopie, en hoe de organische inhoud te bepalen (gewicht/gewichtspercentage) van de kristallen.
We hebben het protocol beschreven dat we hebben gebruikt om het effect van een bacterieel extracellulair eiwit, TapA, op de morfologie en structuur van calciumcarbonaat te evalueren, maar het protocol kan worden besteed aan elk ander polymeer dat biologisch gezuiverd of gesynthetiseerd is. Naast het effect van een enkele biopolymeer, kan deze methode worden gebruikt met mengsels van biopolymeren om onderlinge verschillen tussen verschillende polymeren in hun effect op de precipitatie van calciumcarbonaat te evalueren. We hebben de experimentele set-up beperkt tot een 96-goed plaat; elke andere opstelling waarbij oplossingen van calciumcarbonaat worden gepositioneerd en fysiek van de bron van ammoniumcarbonaat worden gescheiden (d.w.z. de oplossingen en het poeder worden in een verzegeld vat geplaatst), is echter mogelijk. Typische vaten die gebruikt worden zijn multi-well platen en een typisch concentratiebereik van 10-50 mm wordt gebruikt voor een experimentele opstelling met 96-well platen10,16,23. Een verzegeld bekerglas of een exsiccator kan ook worden gebruikt.
Deze methode is gemakkelijk te gebruiken en is compatibel met lage concentraties en lage volumes van de biopolymeric additieven. Werken in een multi-well plaat maakt het mogelijk om meerdere parameters tegelijk te screenen in één Multi-well plate experiment. Deze methode kan gevoelig zijn voor de relatieve positie van de calciumcarbonaat putten met betrekking tot de positie van het ammoniumcarbonaat poeder. Daarom moet zorg worden genomen om altijd putten op dezelfde positie in de multi-well plaat te gebruiken en ook om te controleren of het veranderen van de locatie van de putten geen invloed heeft op de resultaten. Normaalgesproken zorgt het gebruik van een groot genoeg afstand tussen de putten waar de experimenten plaatsvinden en het ammoniumcarbonaat poeder ervoor dat de resultaten reproduceerbaar zijn. Bovendien is het van cruciaal belang om de concentratie van de CaCl2 -oplossing aan te passen, zodat afzonderlijke kristallen worden gevormd in het controle-experiment, zoals beschreven in punt 1.1.2. De concentratie van de additieven moet ook worden geoptimaliseerd om een minimale concentratie te overschrijden, beneden welke geen effect wordt waargenomen. Merk op dat de methode zeer gevoelig is voor de concentratie van de additieven; verschillende additieve concentraties kunnen een ander effect op de morfologie en de structuur van calciumcarbonaat kristallen24veroorzaken.
Een belangrijke beperking van deze methode is dat ammoniak en CO2 zowel diffuus in de calciumchloride testoplossingen en daarom is er slechte controle van de pH gedurende het experiment. Als gevolg van de diffusie van ammoniak neemt de pH in oplossing toe (wanneer ammoniak ammonium wordt), zoals weergegeven in de evenwichtsvergelijkingen 5,6 ((NH 4)2co3 (s) → 2NH3 (g) + co2 (g) + H 2 O(l), NH3 (AQ) + H2O(l) → NH4+(AQ) + Oh-(AQ), CA2 +(AQ) + co2 (AQ) + 2OH-(AQ) CaCO3 (s) + H2O (l)) en het bevordert de vorming van calciumcarbonaat.
Vergeleken met de aanvullende methoden die in de inleiding worden beschreven, is deze methode technisch eenvoudig. Door het langzame neerslag proces kan kristalgroei in real-time worden gevolgd, waarbij gebruik wordt gemaakt van absorptie-of verstrooiings technieken uit de transparante multi-well techniek. Daarnaast kan men, om de kinetiek van de kristalgroei te volgen, ook de kristal morfologie en de structuur op verschillende tijdstippen in plaats van na 20 uur, zoals uitgevoerd in onze studie, sonde leren. Deze methode kan worden uitgebreid om de precipitatie van andere zouten van carbonaat met een klein genoeg KSP, zoals magnesium, barium en cadmium carbonaten, te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Prof. Lia Addadi, Prof. Jonathan Erez en Dr. Yael Politi bedanken voor de vruchtbare besprekingen. Dit onderzoek werd gesteund door de Israëlische Science Foundation (ISF), Grant 1150/14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Gadot | 64-19-7 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 506-87-6 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 10035-04-8 | |
| Ethanol Absolute | Gadot | 64-17-5 | |
| Micro-Raman | Renishaw | inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 90i model | |
| Nis elements Br software | Nikon | For microscope imaging | |
| Scanning Electron Microscope | ThermoFisher Scientific | FEI Sirion microscope | |
| Spectrophotometer | JASCO | V-670 model | |
| Sputter coater | Polaron | SC7640 model |
References
- Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190 (4212), 377-379 (1975).
- Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase. Science. 306 (5699), 1161-1164 (2004).
- Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. Journal of Structural Biology. 183 (2), 258-269 (2013).
- Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. Biomineralization: from nature to application. 12, John Wiley & Sons. (2008).
- Nielsen, M. H., Lee, J. R. I. Methods in Enzymology. De Yoreo, J. J. 532, Academic Press. 209-224 (2013).
- Page, M. G., Cölfen, H. Improved Control of CaCO3 Precipitation by Direct Carbon Dioxide Diffusion: Application in Mesocrystal Assembly. Crystal Growth & Design. 6 (8), 1915-1920 (2006).
- Wang, H., Huang, W., Han, Y. Diffusion-reaction compromise the polymorphs of precipitated calcium carbonate. Particuology. 11 (3), 301-308 (2013).
- Sedlák, M., Antonietti, M., Cölfen, H. Synthesis of a new class of double-hydrophilic block copolymers with calcium binding capacity as builders and for biomimetic structure control of minerals. Macromolecular Chemistry and Physics. 199 (2), 247-254 (1998).
- Kitano, Y., Park, K., Hood, D. W. Pure aragonite synthesis. Journal of Geophysical Research. 67 (12), 4873-4874 (1962).
- Politi, Y., Mahamid, J., Goldberg, H., Weiner, S., Addadi, L. Asprich mollusk shell protein: in vitro experiments aimed at elucidating function in CaCO3 crystallization. CrystEngComm. 9 (12), 1171-1177 (2007).
- Gehrke, N., Cölfen, H., Pinna, N., Antonietti, M., Nassif, N. Superstructures of Calcium Carbonate Crystals by Oriented Attachment. Crystal Growth & Design. 5 (4), 1317-1319 (2005).
- Rudloff, J., et al. Double-Hydrophilic Block Copolymers with Monophosphate Ester Moieties as Crystal Growth Modifiers of CaCO3. Macromolecular Chemistry and Physics. 203 (4), 627-635 (2002).
- Boquet, E., Boronat, A., Ramos-Cormenzana, A. Production of Calcite (Calcium Carbonate) Crystals by Soil Bacteria is a General Phenomenon. Nature. 246, 527 (1973).
- Cohen, A. L., McConnaughey, T. A. Geochemical Perspectives on Coral Mineralization. Reviews in Mineralogy and Geochemistry. 54 (1), 151-187 (2003).
- Erez, J. Vital effect on stable-isotope composition seen in foraminifera and coral skeletons. Nature. 273, 199 (1978).
- Azulay, D. N., et al. Biopolymers from a Bacterial Extracellular Matrix Affect the Morphology and Structure of Calcium Carbonate Crystals. Crystal Growth & Design. 18 (9), 5582-5591 (2018).
- Abbasi, R., et al. The Bacterial Extracellular Matrix Protein TapA Is a Two-Domain Partially Disordered Protein. ChemBioChem. , (2018).
- Gauldie, R. W., Sharma, S. K., Volk, E. Micro-raman spectral study of vaterite and aragonite otoliths of the coho salmon, Oncorhynchus kisutch. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 118 (3), 753-757 (1997).
- Gasteiger, E., et al. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer. 571-607 (2005).
- Gunasekaran, S., Anbalagan, G., Pandi, S. Raman and infrared spectra of carbonates of calcite structure. Journal of Raman Spectroscopy. 37 (9), 892-899 (2006).
- Trushina, D. B., Bukreeva, T. V., Kovalchuk, M. V., Antipina, M. N. CaCO3 vaterite microparticles for biomedical and personal care applications. Materials Science and Engineering: C. 45, 644-658 (2014).
- Weiss, I. M., Tuross, N., Addadi, L., Weiner, S. Mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite. Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 478-491 (2002).
- Yamamoto, Y., Nishimura, T., Saito, T., Kato, T. CaCO3/chitin-whisker hybrids: formation of CaCO3 crystals in chitin-based liquid-crystalline suspension. Polymer Journal. 42, 583 (2010).
- Magnabosco, G., et al. Insights on the interaction of calcein with calcium carbonate and its implications in biomineralization studies. CrystEngComm. 20 (30), 4221-4224 (2018).
