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Chemistry

Formazione carbonato di calcio in presenza di additivi biopolimerici

Published: May 14, 2019 doi: 10.3791/59638
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Institute of Chemistry, Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, 2The Harvey M. Krueger Family Center for Nanoscience and Nanotechnology, Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Descriviamo un protocollo per la precipitazione e la caratterizzazione di cristalli di carbonato di calcio che si formano in presenza di biopolimeri.

Abstract

La biomineralizzazione è la formazione di minerali in presenza di molecole organiche, spesso correlate a ruoli funzionali e/o strutturali negli organismi viventi. Si tratta di un processo complesso e quindi è necessario un sistema semplice, in vitro, per comprendere l'effetto delle molecole isolate sul processo di biomineralizzazione. In molti casi, la biomineralizzazione è diretta da biopolimeri nella matrice extracellulare. Per valutare l'effetto dei biopolimeri isolati sulla morfologia e la struttura della calcite in vitro, abbiamo utilizzato il metodo di diffusione del vapore per la precipitazione del carbonato di calcio, la microscopia elettronica a scansione e il micro Raman per la caratterizzazione, e assorbimento visibile all'ultravioletto (UV/Vis) per misurare la quantità di un biopolimero nei cristalli. In questo metodo esponiamo i biopolimeri isolati, disciolti in una soluzione di cloruro di calcio, in ammoniaca gassosa e anidride carbonica che derivano dalla decomposizione del carbonato di ammonio solido. Nelle condizioni in cui viene raggiunto il prodotto di solubilità del carbonato di calcio, si formano precipitati e cristalli di carbonato di calcio. Il carbonato di calcio di calcio ha diversi polimorfi che differiscono nella loro stabilità termodinamica: carbonato di calcio amorfo, vaterite, aragonite e calcite. In assenza di biopolimeri, in condizioni pulite, il carbonato di calcio è presente principalmente nella forma di calcite, che è il polimorfo più termodinamicamente stabile del carbonato di calcio. Questo metodo esamina l'effetto degli additivi biopolimerici sulla morfologia e la struttura dei cristalli di carbonato di calcio. Qui, dimostriamo il protocollo attraverso lo studio di una proteina batterica extracellulare, TapA, sulla formazione di cristalli di carbonato di calcio. In particolare, ci concentriamo sull'impostazione sperimentale e sui metodi di caratterizzazione, come la microscopia ottica ed elettronica e la spettroscopia Raman.

Introduction

La biomineralizzazione è la formazione di minerali in presenza di molecole organiche, spesso correlate a ruoli funzionali e/o strutturali negli organismi viventi. La biomineralizzazione può essere intracellulare, come nella formazione di magnetite all'interno di batteri magnetotattici1, o extracellulare, come nella formazione di carbonato di calcio nei picchi di riccio di mare2, di idrossiapatite che è correlato con collagene in ossa3 e di smalto che è associato con amelogenin adenti4. La biomineralizzazione è un processo complesso che dipende da molti parametri nell'organismo vivente. Pertanto, al fine di semplificare il sistema in esame, è necessario valutare l'effetto di componenti separati sul processo. In molti casi, la biomineralizzazione è indotta dalla presenza di biopolimeri extracellulari. Lo scopo del metodo qui presentato è il seguente: (1) Formare cristalli di carbonato di calcio in presenza di biopolimeri isolati in vitro, utilizzando un metodo di diffusione del vapore. (2) Studiare l'effetto dei biopolimeri sulla morfologia e la struttura del carbonato di calcio.

Tre metodi principali per precipitare carbonato di calcio in vitro in presenza di additivi organici sono utilizzati5,6. Il primo metodo, che ci riferiremo come il metodo della soluzione, si basa sulla miscelazione di un sale solubile di calcio (ad esempio, CaCl2) con un sale di carbonato solubile (ad esempio, carbonato di sodio). Il processo di miscelazione può essere eseguito in diversi modi: all'interno di un reattore con tre cellule separate da membrane porose7. Qui, ciascuna delle cellule esterne contiene un sale solubile e la cella centrale contiene una soluzione con l'additivo da testare. Calcio e carbonato si diffondono dall'esterno alla cellula centrale, causando la precipitazione del carbonato di calcio meno solubile quando le concentrazioni di calcio e carbonato superano il loro prodotto di sobrietà, Ksp 2-]. Un ulteriore metodo di miscelazione è la procedura a doppio getto8. In questo metodo, ogni sale solubile viene iniettato da una siringa separata a una soluzione mescolata contenente l'additivo, dove precipita il carbonato di calcio. Qui, l'iniezione e quindi il tasso di miscelazione è ben controllato, in contrasto con il metodo precedente in cui la miscelazione è controllata dalla diffusione.

Il secondo metodo utilizzato per cristallizzare CaCO3 è il metodo Kitano9. Questo metodo si basa sull'equilibrio carbonato/idrogeno carbonato (2HCO3- (aq) - Ca2'(aq) Image 1 CaCO 3(s) - CO 2(g) - H2O (l)). Qui, CO2 viene bollato in una soluzione contenente CaCO3 in una forma solida, spostando l'equilibrio a sinistra e quindi sciogliendo il carbonato di calcio. Il carbonato di calcio non disciolto viene filtrato e gli additivi desiderati vengono aggiunti alla soluzione ricca di bicarbonato. Co2 è quindi lasciato evaporare, spostando così la reazione a destra, formando carbonato di calcio in presenza degli additivi.

Il terzo metodo di cristallizzazione carbonata di calcio, che descriveremo qui, è il metodo di diffusione del vapore10. In questo set-up, l'additivo organico, sciolto in una soluzione di cloruro di calcio, viene posto in una camera chiusa vicino al carbonato di ammonio in forma di polvere. Quando la polvere di carbonato di ammonio si decompone in anidride carbonica e ammoniaca, si diffondono nella soluzione contenente ioni di calcio (ad esempio, CaCl2), e il carbonato di calcio è precipitato (vedere la figura 1 a illustrazione). I cristalli di carbonato di calcio possono crescere da precipitazioni lente o da precipitazioni veloci. Per la lenta precipitazione, una soluzione contenente l'additivo nella soluzione CaCl2 viene posta in un desiccatore accanto alla polvere di carbonato di ammonio. Nella precipitazione veloce, descritta in lunghezza nel protocollo, sia la soluzione additiva che il carbonato di ammonio vengono posizionati più vicini in una piastra multi-bene. Il metodo di precipitazione lenta produrrà meno centri di nucleazione e cristalli più grandi, e la precipitazione veloce si tradurrà in più centri di nucleazione e cristalli più piccoli.

I metodi sopra descritti differiscono nella loro complessità tecnica, nel livello di controllo e nella velocità del processo di precipitazione. Il metodo di miscelazione richiede un set-up speciale6 sia per il doppio getto che per il sistema a tre celle. Nel metodo di miscelazione, la presenza di altri controioni solubili (ad es., Na,Cl-)6 è inevitabile, mentre nel metodo Kitano, il calcio e il (bi) carbonato sono gli unici ioni in soluzione e non comporta la presenza di ulteriori ioni contatore (ad es., Na,Cl-). Inoltre, il metodo di miscelazione richiede volumi relativamente grandi e quindi non è adatto per lavorare con biopolimeri costosi. Il vantaggio del doppio getto è che è possibile controllare la velocità di iniezione della soluzione e che si tratta di un processo rapido rispetto ad altri metodi.

Il vantaggio del metodo Kitano e del metodo di diffusione del vapore è che la formazione di carbonato di calcio è controllata dalla diffusione di CO2 in una soluzione CaCl2, permettendo così di sondare processi di nucleazione e precipitazioni più lenti 11 Del sistema di , 12. Inoltre, la formazione di carbonato di calcio per diffusione di CO2 può assomigliare ai processi di calcificazione in vivo13,14,15. In questo metodo, i cristalli ben definiti e separati sono formati16. Infine, è possibile testare l'effetto di biopolimeri singoli o multipli sulla formazione di carbonato di calcio. Ciò consente uno studio sistematico dell'effetto di una serie di concentrazioni additive sulla formazione di carbonato di calcio, nonché uno studio di miscele di biopolimeri - il tutto eseguito in modo controllato. Questo metodo è adatto per l'uso con una vasta gamma di concentrazioni e volumi di additivi. Il volume minimo utilizzato è di circa 50 gradi e quindi questo metodo è vantaggioso quando c'è una quantità limitata di biopolimeri disponibili. Il volume massimo dipende dall'accessibilità di un pozzo più grande o dal desiccatore in cui devono essere inseriti la piastra o il becher contenente CaCl 2. Il metodo descritto di seguito è stato ottimizzato per lavorare in una piastra di 96 pozze con un biopolimero scelto per essere la proteina TapA17.

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Protocol

1. Cristallizzazione carbonata di calcio di calcio

  1. Preparazione e ottimizzazione dei controlli
    1. Preparare pezzi di vetro puliti. Utilizzare la stessa procedura di pulizia per pulire la vetreria.
      1. Utilizzare una penna a diamante per tagliare pezzi di un vetrino del microscopio in vetro in modo che si adattino in un pozzo di una piastra di 96 pozzetti.
        NOTA: i pezzi da 5 mm x 5 mm devono adattarsi in gran parte.
      2. Mettere i pezzi di vetro in un becher con tripla acqua distillata (TDW) in modo che l'acqua copra gli scivoli di vetro e sonica in un toelettatore da bagno per 10 min.
      3. Decant l'acqua, aggiungere etanolo per coprire gli scivoli di vetro, e sonicare in un toelista bagno per 10 min.
      4. Asciugare i vetrini e le vetrerie con un flusso di gas di azoto e metterli in un detergente al plasma d'aria per 10 min a 130 W.
    2. Ottimizzare la concentrazione del CaCl2 utilizzato negli esperimenti di calcificazione eseguiti nelle condizioni sperimentali desiderate per ottenere un campione ricco di cristalli di calcite sfaccettati (senza o almeno con un numero scarso di vaterite cristalli).
      1. Riempire i pozze agli angoli di una piastra di 96 pozze con polvere di carbonato di ammonio e sigillare la piastra utilizzando un foglio di alluminio; coprire la pellicola con pellicola di paraffina. Pulire qualsiasi carbonato di ammonio residuo utilizzando gas di azoto.
        AVVISO: il carbonato di ammonio irrita naso e polmoni; utilizzare solo all'interno del cofano del fume.
      2. Preparare una soluzione di riserva di 0,5 M CaCl2. Questa soluzione stock sarà utilizzata per preparare un gradiente di concentrazioni di soluzioni CaCl2 nella piastra multi-bene.
        NOTA: una soluzione di riserva da 10 mL è sufficiente per l'intero esperimento.
      3. Collocare i pezzi di vetro precedentemente tagliati e puliti in cinque pozzi diversi. Utilizzare i pozzi più vicini al centro.
      4. Riempire ogni pozzetto con un pezzo di vetro con 100 gradi di una soluzione CaCl2 16. Mescolare TDW e 0,5 M CaCl2 (stock) per ottenere un gradiente di concentrazione crescente di CaCl2 attraverso i diversi pozzi. Se viene utilizzata una piastra di dimensioni diverse, regolare la concentrazione di CaCl2 per ottenere cristalli di calcite separati (passaggio 1.1.2.10 e vedere sezione Discussione).
        NOTA: in questo protocollo viene utilizzata una sfumatura CaCl2 crescente di 10, 20, 30, 40,50 mM in pozze separate. Per aumentare l'intervallo di concentrazione o il numero di concentrazioni testate, utilizzare pozzi aggiuntivi.
      5. Forare il coperchio di ciascuno dei pozzi contenenti carbonato di ammonio 3x con un ago.
      6. Rimettere il coperchio, sigillare i bordi con pellicola di paraffina e tenerlo a 18 gradi centigradi in un'incubatrice per 20 h.
      7. Dopo l'incubazione, aprire il coperchio con attenzione all'interno di un cappuccio fume e rimuovere i cristalli formati all'interfaccia acqua/aria con un anello.
      8. Utilizzare una pinzetta per trasferire i pezzi di vetro in un becher contenente doppia acqua distillata (DDW). Togliere i campioni dal becher e utilizzare un nastro a due lati per fissare i pezzi di vetro sul fondo della piastra Petri.
      9. Asciugare l'acqua eccessiva toccando i bordi del vetrino con salviette tissutali. Coprire il piatto di Petri e metterlo in un desiccatore per 24 ore.
      10. Osservare i cristalli formati sui pezzi di vetro con uno stereoscopio (ingrandimento 3,5x) e/o un microscopio ottico verticale (ingrandimento 10x-40x). Se le soluzioni di controllo sono pulite, i cristalli romboedri (molto probabilmente calcite) saranno osservati con un microscopio ottico (Figura 2A).
      11. Se oltre ai cristalli romboedri, il controllo contiene cristalli sferici (molto probabilmente vaterite, Figura 2B),o se le immagini al microscopio elettronico a scansione (SEM) mostrano cristalli romboedri con facce ruvide piuttosto che lisce ( Figura 3 A,B), ripetere il protocollo di cristallizzazione assicurandosi che la fase di pulizia (1.1.1) venga eseguita correttamente. Inoltre, fare meglio cura che non c'è carbonato di ammonio in aree sulla piastra diversa dai pozzi dedicati. In caso contrario, continuare con il passaggio successivo.
  2. Cristallizzazione in presenza degli additivi
    1. Per studiare l'effetto degli additivi sulla cristallizzazione di CaCO3, impostare una piastra multi-bene che contiene (in diversi pozzi), un controllo CaCl2 soluzione senza gli additivi, e CaCl2 soluzioni con gli additivi. Utilizzare la concentrazione ottimale di CaCl2 trovata nella sezione 1.1.2 per l'esperimento.
      NOTA: il protocollo riportato di seguito utilizza condizioni ottimali come quelle riportate in uno studio precedente16.
    2. Ripetere il passaggio 1.1.2.2.
    3. Collocare la polvere di carbonato di ammonio negli angoli della piastra come descritto al punto 1.1.2.1.
    4. In ogni pozzo in cui si verificheranno le precipitazioni, posizionare un pezzo di vetro che è stato tagliato e pulito come descritto nella sezione 1.1.1.
    5. Per preparare i pozzi di controllo, pipetta 90 -L di TDW nei pozzetti di controllo. Preparare almeno una replica di ogni pozzo, incluso il controllo. Se l'additivo utilizzato si trova in una soluzione di buffer, la pipetta è 90 - di tampone invece di acqua TDW.
    6. Preparare i pozzi contenenti additivi. Ripetere il passaggio 1.2.5 aggiungendo 90 gradi l della soluzione additiva in acqua. Se l'additivo è in tampone (invece di TDW), preregolare la concentrazione dell'additivo con buffer per soddisfare la concentrazione finale desiderata. Mantenere un volume totale di 90 l; pipetta prima l'additivo, poi il buffer.
      NOTA: In questo protocollo viene utilizzata una concentrazione finale di 10M della proteina TapA in 100 mM NaCl, 25 mM tris pH 8.0 buffer16.
    7. Aggiungere 10 l della soluzione di riserva CaCl2 da 0,5 M (preparata al punto 1.2.2) sia ai controlli che ai pozze di cassa contenenti additivi per raggiungere una concentrazione finale di 50 mM CaCl2.
    8. Ripetere i passaggi 1.1.2.5-1.1.2.9.

2. Caratterizzazione dei cristalli di carbonato di calcio

  1. Con un microscopio elettronico a scansione, osservare i cristalli di carbonato di calcio formati in presenza degli additivi ad una risoluzione superiore a quella ottenuta dalla microscopia ottica (vedi passo 1.1.2.10).
    1. Montare i pezzi di vetro contenenti i cristalli su uno stub di alluminio con nastro di carbonio a doppia lato.
    2. Cappotto con strato di Au/Pd per 40-50 s.
    3. Acquisire le immagini a 5 kV di tensione di accelerazione.
      NOTA: La figura 3A mostra un'immagine SEM rappresentativa dei cristalli di carbonato di calcio formatisi in un corretto esperimento di controllo, mentre la Figura 4 mostra immagini rappresentative di cristalli di carbonato di calcio formati si formano in presenza della proteina TapA .
  2. Eseguire la spettroscopia micro Raman per determinare i polimorfi di carbonato di calcio formati. Micro Raman permette la raccolta di uno spettro Raman da singoli cristalli piuttosto che da una polvere intera.
    1. Utilizzare un obiettivo 20x del microscopio per scegliere il cristallo di interesse.
    2. Raccogliere lo spettro Raman in un range di 100-3200 cm-1 utilizzando un laser argon 514 nm.
      NOTA: la figura 5 mostra gli spettri rappresentativi della calcite (A) e del vaterite (B). Per lo spettro dell'aragonite, fare riferimento al riferimento18.
  3. Quantificazione della percentuale di massa degli additivi nei precipitati CaCO3
    1. Verificare/misurare il coefficiente di estinzione dell'additivo utilizzato. Il coefficiente di estinzione di una proteina può essere somministrato dai server online19. Se il coefficiente di estinzione è sconosciuto, misurare l'assorbimento dell'additivo a diverse concentrazioni, tracciare l'assorbimento rispetto alla concentrazione e calcolare il coefficiente di estinzione dalla pendenza della curva.
    2. Pesare i pezzi di vetro dove si sono formati i cristalli, preferibilmente utilizzare un microequilibrio.
    3. Raschiare i cristalli dal vetro in 1,2 mL di 0,1 M soluzione di acido acetico, vortice e sonicare il campione. Conservare il campione a temperatura ambiente per 24 ore.
      DATIERAzione: l'acido acetico è molto pericoloso in caso di contatto con la pelle o con gli occhi; essere prudenti e disporre seguendo le normative.
    4. Pesare lo scivolo di vetro dopo aver raschiato i cristalli.
    5. Misurare lo spettro uv/vis absorbance (A) della soluzione. Se l'additivo è una proteina, misurare l'assorbimento a 280 nm e calcolarne la concentrazione (C), utilizzando l'equazione di Beer-Lambert:
      Equation 1
      dove l è il percorso ottico all'interno della cuvette.
    6. Utilizzare la concentrazione (C) che si trova nella versione 2.3.5 e il volume utilizzato (V : 1,2 mL) per calcolare la massa (m) degli additivi nei cristalli. Se la concentrazione è in mg/mL, utilizzare l'equazione C
      1. Se la concentrazione è in mol/L, calcolare le talpe (n) applicando C Quindi utilizzare il peso molecolare (Mw) per calcolare la massa (m) degli additivi (m
    7. Calcolare la percentuale di peso degli additivi nei Equation 2 cristalli utilizzando l'equazione: , dove m è la massa degli additivi, e s è la massa dei cristalli di carbonato di calcio che sono stati demoliti dal vetro pezzo.

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Representative Results

Uno schema del set up sperimentale è illustrato nella Figura 1. In breve, il metodo di diffusione viene utilizzato per formare cristalli di carbonato di calcio in piastre di 96 pozze e testare l'effetto dei biopolimeri sulla morfologia e la struttura dei cristalli di carbonato di calcio. In questi esperimenti, il carbonato di ammonio viene decomposto in ammoniaca e CO2, che si diffondono in soluzioni di carbonato di calcio, con conseguente formazione di cristalli di carbonato di calcio (Figura 1 e Figura 2).

L'effetto dei biopolimeri viene valutato confrontando i cristalli di carbonato di calcio formati con e senza (controllo) gli additivi. Prima dell'aggiunta degli additivi, viene scelta la concentrazione ottimizzata di carbonato di calcio e viene testata la pulizia delle soluzioni e della vetreria. Figura 2 A mostra un'immagine rappresentativa di un esperimento di controllo, in cui si formano cristalli di carbonato di calcio rombohedrali. Questi cristalli sono molto probabilmente calcite (vedi Figura 5). Se le soluzioni o plastica o vetro non sono stati puliti correttamente poi cristalli sferici si formeranno (Figura 2B, contrassegnati con cerchi rossi), oltre ai cristalli romboherdi. I cristalli sferici sono molto probabilmente vaterite (vedi Figura 5). Un'ulteriore indicazione per l'uso di condizioni adeguate, è la levigatezza delle facce calcite nell'esperimento di controllo. Questo può essere osservato con SEM, come mostrato nella Figura 3. Figura 3 A mostra un controllo corretto con facce calcite lisce, mentre la figura 3B mostra cristalli di calcite con facce composte da passi. I cristalli sferici qui sono vaterite. I cristalli di controllo devono essere separati e sfaccettati in modo che l'effetto degli additivi sulla morfologia dei cristalli sia chiaro.

Per dimostrare l'effetto di un biopolimero sulla morfologia del carbonato di calcio, abbiamo usato qui la proteina TapA. Figura 4 mostra i cristalli di carbonato di calcio formato in presenza di TapA nella soluzione. I cristalli sono distinti dai cristalli di controllo. Essi formano un complesso assemblaggio sferico di carbonato di calcio, composto da più microcristalli di calcite (vedi spettro Raman in Figura 5). Un metodo per caratterizzare la struttura dei cristalli è la spettroscopia Raman. Nella figura 5 sono illustrati gli spettri tipici di calcite (Figura 5A) e vaterite (Figura 5B), tratti da esperimenti di controllo riusciti (A) e non riusciti (B). I picchi tipici di assorbimento20 sono compresi nell'intervallo di 100-400 cm-1 (modalità reticolo), un picco a 710 cm-1 (piegatura simmetrica del CO32-) e a 1090 cm-1 (allungamento simmetrico del CO3) 2-). Si noti la divisione dello spostamento Raman a 1080 cm-1 che è la caratteristica più evidente del vaterite21. Fare riferimento al riferimento22 per un intero spettro di aragonite. Lo spettro Raman dei cristalli formati in presenza di TapA è simile allo spettro della calcite (Figura 5A). Nei casi in cui compaiono picchi aggiuntivi che non corrispondono a un singolo spettro di un singolo polimorfo carbonato di calcio, o a una combinazione di questi, possono essere attribuiti ad un eccesso di cloruro di calcio che non è stato lavato accuratamente nel passaggio 1.1.2.8.

Nella sezione finale del protocollo, abbiamo misurato la percentuale (peso/peso) del contenuto organico all'interno o sui cristalli di carbonato di calcio. I cristalli sono stati disciolti nell'acido acetico e il biopolimero è stato rilasciato nella soluzione. Nei casi in cui il biopolimero ha uno spettro di assorbimento caratteristico, la sua concentrazione nella soluzione può essere determinata. Nel caso di proteine contenenti gruppi laterali aromatici, come nel caso di studio qui di TapA, viene utilizzata l'assorbimento a 280 nm. Lo spettro di assorbimento di TapA, misurato in seguito alla dissoluzione dei cristalli nell'acido, è mostrato nella Figura 6 (verde) insieme allo spettro del controllo (cristalli di carbonato di calcio disciolto dall'acido senza l'additivo; nero). Utilizzando la legge di Beer-Lambert (vedi passo 2.3.5) e utilizzando un coefficiente di estinzione di 29.700 M-1 cm-1, abbiamo scoperto che la percentuale di massa di TapA era 1.8% - 0.2%. Misurare l'assorbimento della soluzione dopo la dissoluzione del cristallo nell'acido è possibile quando i biopolimeri non si aggregano a basso pH. Un segnale nullo dell'assorbimento della soluzione contenente l'additivo è indicativo della sua aggregazione. In questo caso, diversi metodi di analisi, come l'analisi termogravitazionale (TGA) possono essere utilizzati per stimare la massa di additivi presenti all'interno/sui cristalli.

Figure 1
Figura 1 : Descrizione schematica del metodo di diffusione del vapore veloce per la formazione di cristalli di carbonato di calcio. Un sale solubile contenente calcio (ad esempio, cloruro di calcio) viene posto vicino a una polvere di carbonato di ammonio. Qui mostriamo due pozzi in un piatto da 96 pozze. La piastra viene quindi sigillata e il carbonato di ammonio decomposto in ammoniaca e anidride carbonica che si diffondono nel pozzo contenente calcio, con conseguente precipitazione di cristalli di carbonato di calcio (mostrato qui dall'immagine SEM di un cristallo di calcite). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : immagini ottiche al microscopio dei cristalli di carbonato di calcio. Un controllo pulito contiene principalmente calcite, caratterizzata da cristalli romboedri (A). Quando il campione di controllo include cristalli sferici (ad esempio quelli contrassegnati da un cerchio rosso) (B), ripetere il protocollo di pulizia come indicato nella sezione 1.1.1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Scansione di micrografie elettroniche di cristalli di carbonato di calcio formatisi in due esperimenti di controllo. (A) Immagine di un campione che contiene per lo più cristalli romhedrali (calcite). (B) Una micrografia di un campione con sfaccettature di calcite rotte e cristalli sferici che sono molto probabilmente vaterite. In questo caso, gli esperimenti di controllo devono essere ripetuti. Questa cifra è stata modificata da Azulay et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : immagini SEM di cristalli di calcite formati in presenza della proteina TapA. Le barre della scalarappresentano rispettivamente 50 m ( ) e 10 m (B). Questa cifra è stata modificata da Azulay et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : spettri Raman di due polimorfi di carbonato di calcio. (A) Calcite. (B) Vaterite. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : spettri di assorbimento UV/vis di TapA (verde) e una soluzione tampone (100 mM NaCl, 25 mM Tris pH 8.0; nero). L'assorbimento è stato utilizzato per calcolare la concentrazione di TapA nei cristalli di carbonato di calcio, in seguito alla loro dissoluzione nell'acido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il metodo qui descritto è volto a formare cristalli di carbonato di calcio in presenza di additivi organici e a valutare l'effetto dei biopolimeri organici sulla morfologia e la struttura dei cristalli di carbonato di calcio in vitro. Il metodo si basa sul confronto dei cristalli formati in presenza degli additivi organici ai cristalli di calcite formati nell'esperimento di controllo. Abbiamo dimostrato come utilizzare il metodo di diffusione per formare i cristalli di carbonato di calcio, come caratterizzare la loro morfologia utilizzando la microscopia ottica ed elettronica, come caratterizzare la loro struttura usando la spettroscopia Raman e come determinare il contenuto organico (percentuale peso/peso) dei cristalli.

Abbiamo descritto il protocollo che abbiamo usato per valutare l'effetto di una proteina extracellulare batterica, TapA, sulla morfologia e la struttura del carbonato di calcio, ma il protocollo può essere speso a qualsiasi altro polimero biologicamente purificato o sintetizzato. Oltre all'effetto di un singolo biopolimero, questo metodo può essere utilizzato con miscele di biopolimeri al fine di valutare qualsiasi reciprocità tra diversi polimeri nel loro effetto sulle precipitazioni di carbonato di calcio. Abbiamo limitato l'allestito sperimentale a una piastra da 96 pozze; tuttavia, qualsiasi altro set-up in cui le soluzioni di carbonato di calcio sono posizionate e fisicamente separate dalla fonte di carbonato di ammonio (cioè, le soluzioni e la polvere sono collocate in un recipiente sigillato), è possibile. I vasi tipici utilizzati sono piastre multi-bene e un tipico intervallo di concentrazione di 10-50 mM viene utilizzato per un set-up sperimentale con piastre 96 pozze10,16,23. Può essere utilizzato anche un becher sigillato o un desiccatore.

Questo metodo è facile da usare ed è compatibile con basse concentrazioni e bassi volumi di additivi biopolimerici. Lavorare in una piastra multi-bene permette lo screening di più parametri contemporaneamente in un esperimento multi-bene piastra. Questo metodo può essere sensibile alla posizione relativa dei pozzi di carbonato di calcio rispetto alla posizione della polvere di carbonato di ammonio. Pertanto, è necessario prestare attenzione a utilizzare sempre pozzi nella stessa posizione nella piastra multi-bene e anche per verificare che la modifica della posizione dei pozzi non influisca sui risultati. Normalmente, l'utilizzo di una distanza sufficiente tra i pozzi in cui si svolgono gli esperimenti e la polvere di carbonato di ammonio, assicura che i risultati siano riproducibili. Inoltre, è fondamentale regolare la concentrazione della soluzione CaCl2 in modo che si formino cristalli separati nell'esperimento di controllo, come descritto nella sezione 1.1.2. La concentrazione degli additivi dovrebbe anche essere ottimizzata per superare una concentrazione minima al di sotto della quale non si osserva alcun effetto. Si noti che il metodo è altamente sensibile alla concentrazione degli additivi; diverse concentrazioni additive possono indurre un diverso effetto sulla morfologia e la struttura dei cristalli di carbonato di calcio24.

Una delle principali limitazioni di questo metodo è che l'ammoniaca e la CO2 si diffondono entrambe nelle soluzioni di test del cloruro di calcio e quindi c'è uno scarso controllo del pH durante l'esperimento. Come risultato della diffusione dell'ammoniaca, il pH nella soluzione aumenta (quando l'ammoniaca diventa ammoniaca), come mostrato nelle equazioni di equilibrio5 ,6 ((NH4)2CO3(s) 2 Il nome del sistema O(l), NH3 (aq) , H2O(l) , NH4,(aq) , OH-(aq), Ca2(aq) , CO 2(aq) - 2OH-(aq) Image 1 CaCO3 (s) - H2O (l)) e favorisce la formazione di carbonato di calcio. 

Rispetto ai metodi aggiuntivi descritti nell'introduzione, questo metodo è tecnicamente semplice. A causa del lento processo di precipitazione, la crescita dei cristalli può essere seguita in tempo reale, utilizzando tecniche di assorbimento o dispersione dalla tecnica trasparente multi-pozzo. Inoltre, al fine di seguire la cinetica della crescita del cristallo, si può anche sondare la morfologia del cristallo e la struttura in diversi punti temporali, piuttosto che dopo 20 ore, come eseguito nel nostro studio. Questo metodo può essere ampliato per studiare la precipitazione di altri sali di carbonato recanti un Ksp abbastanza piccolo, come i carbonati di magnesio, barium e cadmio.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il professor Lia Addadi, il professor Jonathan Erez e il dr. Yael Politi per le fruttuose discussioni. Questa ricerca è stata sostenuta dalla Israeli Science Foundation (ISF), sovvenzione 1150/14.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Gadot 64-19-7
Ammonium carbonate Sigma-Aldrich 506-87-6
Calcium chloride dihydrate Merck KGaA 10035-04-8
Ethanol Absolute Gadot 64-17-5
Micro-Raman Renishaw inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope
Microscope Nikon Eclipse 90i model
Nis elements Br software Nikon For microscope imaging
Scanning Electron Microscope ThermoFisher Scientific FEI Sirion microscope
Spectrophotometer JASCO V-670 model
Sputter coater Polaron SC7640 model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Formazione carbonato di calcio in presenza di additivi biopolimerici
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Azulay, D. N., Chai, L. Calcium… More

Azulay, D. N., Chai, L. Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives. J. Vis. Exp. (147), e59638, doi:10.3791/59638 (2019).

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