Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kalsium skrive formasjon i nærvær av Biopolymeric tilsetningsstoffer

Published: May 14, 2019 doi: 10.3791/59638
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Institute of Chemistry, Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, 2The Harvey M. Krueger Family Center for Nanoscience and Nanotechnology, Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Vi beskriver en protokoll for nedbør og karakterisering av kalsium og krystaller som dannes i nærvær av biopolymerer.

Abstract

Biomineralization er dannelsen av mineraler i nærvær av organiske molekyler, ofte knyttet til funksjonelle og/eller strukturelle roller i levende organismer. Det er en kompleks prosess og derfor en enkel, in vitro, systemet er nødvendig for å forstå effekten av isolerte molekyler på biomineralization prosessen. I mange tilfeller er biomineralization regissert av biopolymerer i ekstracellulære matrise. For å evaluere effekten av isolerte biopolymerer på morfologi og struktur av kalsitt in vitro, har vi brukt damp diffusjon metode for utfelling av kalsium, skanning elektron mikroskopi og mikro Raman for karakterisering, og ultrafiolett-synlig (UV/Vis) absorbansen for å måle mengden av en Biopolymer i krystaller. I denne metoden, utsetter vi den isolerte biopolymerer, oppløst i en kalsiumklorid løsning, til gass ammoniakk og karbondioksid som kommer fra nedbryting av solide ammonium. Under de forhold hvor løselighet produktet av kalsium er nådd, dannes kalsium precipitates og krystaller. Kalsium har forskjellige polymorphs som avviker i deres termodynamisk stabilitet: amorfe kalsium, vaterite, Aragonitt og kalsitt. I fravær av biopolymerer, under rene forhold, er kalsium, hovedsakelig til stede i kalsitt form, som er den mest termodynamisk stabile polymorf av kalsium. Denne metoden undersøker effekten av biopolymeric tilsetningsstoffer på morfologi og struktur av kalsium, og krystaller. Her demonstrerer vi protokollen gjennom studiet av et ekstracellulære bakterie protein, tapas, på dannelsen av krystaller med kalsium. Nærmere bestemt fokuserer vi på den eksperimentelle satt opp, og karakterisering metoder, for eksempel optiske og elektron mikroskopi samt Raman spektroskopi.

Introduction

Biomineralization er dannelsen av mineraler i nærvær av organiske molekyler, ofte knyttet til funksjonelle og/eller strukturelle roller i levende organismer. Biomineralization kan være intracellulære, som i dannelsen av magnetitt inne magnetotactic bakterier1, eller ekstracellulære, som i dannelsen av kalsium, i sjø Urchin pigger2, av hydroksyapatitt som er relatert med kollagen i Bones3 og emalje som er forbundet med amelogenin i tennene4. Biomineralization er en kompleks prosess som avhenger av mange parametre i den levende organismen. Derfor, for å forenkle systemet under studien, er det nødvendig å evaluere effekten av separate komponenter på prosessen. I mange tilfeller er biomineralization indusert av tilstedeværelsen av ekstracellulære biopolymerer. Formålet med metoden som presenteres her er som følger: (1) for å danne kalsium, og krystaller i nærvær av isolerte biopolymerer in vitro, ved hjelp av en damp diffusjon metode. (2) for å studere effekten av biopolymerer på morfologi og struktur av kalsium.

Tre viktigste metoder for å fremskynde kalsium, i vitro i nærvær av organiske tilsetningsstoffer brukes5,6. Den første metoden, som vi vil referere til som løsningen metoden, er basert på å blande et løselig salt av kalsium (f. eks CaCl2) med et løselig salt av Blandingsprosessen kan utføres på flere måter: inne i en reaktor med tre celler som er adskilt av porøse membraner7. Her inneholder hver av de ytre cellene et løselig salt og den sentrale cellen inneholder en løsning med tilsetningsstoff som skal testes. Kalsium og overflate diffus fra den ytre til den midterste cellen, noe som resulterer i utfelling av den mindre løselige kalsium-veggen når konsentrasjonene av kalsium og andre overskrider deres løselighet produkt, KSP = [ca2 +] [co3 2-]. En ekstra blanding metoden er dobbel-Jet prosedyre8. I denne metoden injiseres hvert løselig salt fra en separat sprøyte til en rørt løsning som inneholder tilsetningsstoffet, der kalsium precipitates. Her injeksjon og derfor blande hastigheten er godt kontrollert, i motsetning til den forrige metoden der miksing er kontrollert av diffusjon.

Den andre metoden som brukes til å utkrystallisere CaCO3 er den Kitano metoden9. Denne metoden er basert på likevekt/hydrogen-balanse (2HCO3- (AQ) + ca2 +(AQ) Image 1 caco3 (s) + co2 (g) + H2O (l)). Her, CO2 er boblet til en løsning som inneholder caco3 i en solid form, skiftende likevekt til venstre og derfor oppløses av kalsium. Den uoppløste kalsium er filtrert og ønsket tilsetningsstoffer er lagt til bikarbonat-rik løsning. CO2 er da lov til å fordampe, og dermed skiftende reaksjonen til høyre, forming kalsium i nærvær av tilsetningsstoffene.

Den tredje metoden for kalsium på krystallisering, som vi vil beskrive her, er dampen diffusjon metoden10. I dette oppsettet, den organiske tilsetningsstoff, oppløst i en løsning av kalsiumklorid, er plassert i et lukket kammer nær ammonium i pulverform. Når ammonium dekomponerer inn i karbondioksid og ammoniakk, diffus de inn i oppløsningen som inneholder kalsium ioner (f.eks. CaCl2), og det er utløst kalsium (se figur 1 for illustrasjon). Den kalsium med krystaller kan vokse ved langsom nedbør eller ved rask nedbør. For langsom nedbør plasseres en løsning som inneholder tilsetningsstoffet i CaCl2 -løsningen, i en desikator ved siden av ammonium. I den raske nedbøren, beskrevet i lengden i protokollen, er både additiv løsning og ammonium, plassert tettere sammen i en multi-brønn plate. Den langsomme nedbørs metoden vil produsere færre kjerne sentre og større krystaller, og den raske nedbøren vil føre til mer kjernedannelse sentre og mindre krystaller.

Metodene som er beskrevet ovenfor, varierer i deres tekniske kompleksitet, i nivået av kontroll og i hastigheten på nedbørs prosessen. Blandings metoden krever et spesielt oppsett6 for både dobbel stråle og tre celle system. I miksing metoden, tilstedeværelsen av andre oppløselige Counter ioner (f. eks na+, CL-)6 er uunngåelig, mens i Kitano metoden, kalsium og (BI) er de eneste ioner i løsningen, og det innebærer ikke tilstedeværelsen av ytterligere (f. eks na+, CL-). Videre, blande metoden krever relativt store volumer og derfor er det ikke egnet for å arbeide med dyre biopolymerer. Fordelen med dobbel stråle er at det er mulig å kontrollere frekvensen av løsnings injeksjon og at det er en rask prosess i forhold til andre metoder.

Fordelen med Kitano metoden og damp diffusjon metoden er at dannelsen av kalsium er kontrollert av diffusjon av CO2 inn/ut av en CaCl2 -løsning, og dermed tillater å undersøke tregere kjernedannelse og utfelling prosesser 11 flere , 12. Videre kan kalsium-formasjonen ved diffusjon av co2 ligne forkalkning prosesser i vivo13,14,15. I denne metoden, veldefinerte og separerte krystaller dannes16. Til sist kan effekten av enkelt-eller fler biopolymerer på dannelse av kalsium, testes. Dette gjør det mulig med en systematisk studie av effekten av en rekke tilsetnings konsentrasjoner på kalsium og en studie av blandinger av biopolymerer-alt utført på en kontrollert måte. Denne metoden er egnet for bruk med et stort utvalg av konsentrasjoner og mengder tilsetningsstoffer. Minimalt volum som brukes er omtrent 50 μL, og derfor er denne metoden fordelaktig når det er en begrenset mengde av de tilgjengelige biopolymerer. Det maksimale volumet avhenger av tilgjengeligheten til en større brønn plate, eller desikator som platen eller begeret med CaCl2 skal settes inn i. Metoden som er beskrevet nedenfor er optimalisert for arbeid i en 96-brønn plate med en Biopolymer valgt å være proteinet tapas17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. kalsium på krystallisering

  1. Kontrollere klargjøring og optimalisering
    1. Forbered rent glass stykker. Bruk samme rengjøringsprosedyre for å rengjøre glasset.
      1. Bruk en diamant penn til å skjære deler av et glass mikroskop lysbilde slik at de passer i en brønn av en 96-brønn plate.
        Merk: 5 mm x 5 mm deler bør i stor grad passe.
      2. Plasser glassbitene i et beger med trippel destillert vann (TDW) slik at vannet dekker glass lysbildene og sonikere i et bad sonicator i 10 min.
      3. Dekanter vannet, tilsett etanol for å dekke glass lysbildene, og sonikere i et bad sonicator i 10 min.
      4. Tørk lysbildene og glass med en strøm av nitrogen gass og legg dem i en luft plasma renere i 10 min på 130 W.
    2. Optimaliser konsentrasjonen av CaCl2 brukes i forkalkning eksperimenter utført under ønsket eksperimentelle forhold for å oppnå en prøve rik med glatte kalsitt krystaller (uten eller i det minste med et knappe antall vaterite krystaller).
      1. Fyll brønnene i hjørnene av en 96 brønn plate med ammonium og forsegle platen med aluminiumsfolie; for å dekke folien med para fin film. Rengjør eventuelle rester av ammonium med nitrogen gass.
        FORSIKTIG: ammonium, irriterer nesen og lungene; Bruk inne i avtrekks panseret.
      2. Forbered en lagerløsning av 0,5 M CaCl2. Denne lagerløsning vil bli brukt til å utarbeide en gradient av konsentrasjoner av CaCl2 løsninger i multi-brønn plate.
        Merk: en 10 mL lagerløsning er tilstrekkelig for hele eksperimentet.
      3. Plasser den tidligere kuttet og renset glass brikker i fem forskjellige brønner. Bruk de nærmeste brønnene til sentrum.
      4. Fyll hver brønn med et glass stykke med 100 μL av en CaCl2 -løsning16. Bland TDW og 0,5 M CaCl2 (Stock) for å oppnå en økende konsentrasjon gradient på CaCl2 over de ulike brønnene. Hvis en annen størrelse godt plate brukes, justere konsentrasjonen av CaCl2 for å oppnå separate kalsitt krystaller (trinn 1.1.2.10, og se diskusjon delen).
        Merk: en økende CaCl2 -gradering på 10, 20, 30, 40, 50 mm konsentrasjoner i separate brønner brukes i denne protokollen. For å øke konsentrasjons området eller antall konsentrasjoner som er testet, bruk flere brønner.
      5. Punktering av dekket av hver av brønnene som inneholder ammonium, 3x med en nål.
      6. Sett tilbake lokket, forsegle grensene med parafin film og holde den ved 18 ° c i en inkubator for 20 h.
      7. Etter inkubasjons åpner du lokket forsiktig inne i en avtrekks hette og fjerner krystallene som dannes ved vann-/luft grensesnittet med en sløyfe.
      8. Bruk en TWEEZER til å overføre glassbitene til et beger som inneholder dobbelt ekstraksjonsprosedyre vann (DDW). Fjern prøvene fra begeret og bruk en dobbeltsidig tape for å feste glassbitene på undersiden av Petri-fatet.
      9. Tørk overdreven vann berøre grensene av lysbildet med vev kluter. Dekk Petri parabolen og legg den i en desikator for 24 h.
      10. Observer krystallene dannet på glasset stykker med en stereoscope (3.5 x forstørrelse) og/eller en oppreist optisk mikroskop (10x-40x forstørrelse). Hvis kontroll løsningene er rene, vil rhombohedral krystaller (mest sannsynlig kalsitt) observeres med et optisk mikroskop (figur 2A).
      11. Hvis i tillegg til rhombohedral krystaller, inneholder kontrollen sfæriske krystaller (mest sannsynlig vaterite, figur 2B), eller hvis skanning elektronmikroskop (SEM) bilder viser rhombohedral krystaller med grov snarere enn glatte ansikter ( Figur 3 A, B), gjentar krystallisering protokollen å sørge for at rengjøringen trinn (1.1.1) utføres på riktig måte. Videre, ta bedre vare på at det ikke er noen ammonium i områder på tallerkenen enn de dedikerte brønnene. Ellers fortsetter du til neste trinn.
  2. Krystallisering i nærvær av tilsetningsstoffene
    1. For å studere effekten av tilsetningsstoffene på krystallisering av CaCO3, sette opp en multi-brønn plate som inneholder (i forskjellige brønner), en kontroll CaCl2 løsning uten tilsetningsstoffer, og CaCl2 løsninger med tilsetningsstoffer. Bruk den optimale konsentrasjonen av CaCl2 funnet i Seksjon 1.1.2 for eksperimentet.
      Merk: protokollen nedenfor bruker optimale forhold som de som er rapportert i en tidligere studie16.
    2. Gjenta trinn-1.1.2.2.
    3. Plasser ammonium med pulver i hjørnene av platen som beskrevet i trinn 1.1.2.1.
    4. I hver brønn der nedbøren vil skje, plasserer et glass stykke som ble kuttet og rengjort som beskrevet i § 1.1.1.
    5. For å forberede kontroll brønner, Pipetter 90 μL av TDW i kontroll brønnene. Forbered minst en replikere av hver brønn inkludert kontrollen. Hvis tilsetningsstoffet som brukes er i en buffer løsning, deretter Pipetter 90 μL av buffer i stedet for TDW vann.
    6. Klargjør brønnene som inneholder tilsetningsstoffer. Gjenta trinn 1.2.5 ved å tilsette 90 μL av tilsetnings løsningen i vann. Hvis tilsetningsstoffet er i buffer (i stedet for TDW), pre-justere konsentrasjonen av tilsetningsstoff med buffer for å møte den ønskede endelige konsentrasjonen. Behold et total volum på 90 μL; Pipetter først tilsetningsstoff, deretter buffer.
      Merk: en siste konsentrasjon på 10 μM av proteinet tapas i 100 mM NaCl, 25 mM Tris pH 8,0 buffer16 brukes i denne protokollen.
    7. Tilsett 10 μL av 0,5 M CaCl2 Stock-løsningen (fremstilt i trinn 1.2.2) til både kontrollene og tilsetningsstoffene som inneholder brønnene, for å nå en endelig konsentrasjon på 50 mm CaCl2.
    8. Gjenta trinn 1.1.2.5-1.1.2.9.

2. karakterisering av kalsium og krystaller

  1. Med et skanne elektronmikroskop, observere kalsium, som dannes i nærvær av tilsetningsstoffene ved en høyere oppløsning enn det som oppnås ved optisk microcopy (se trinn 1.1.2.10).
    1. Monter glassbitene som inneholder krystaller på en aluminium spire med dobbeltsidig karbon tape.
    2. Coat med et lag av au/PD for 40-50 s.
    3. Skaff bildene ved 5 kV akselerasjon spenning.
      Merk: Figur 3a viser et representativt SEM-bilde av kalsium, som dannes i et forsvarlig kontroll eksperiment, mens Figur 4 viser representative bilder av krystaller av kalsium, som dannes i nærvær av et protein tapas .
  2. Utfør mikro-Raman spektroskopi for å bestemme kalsium polymorphs som dannes. Micro Raman tillater innsamling av et Raman spektrum fra enkle krystaller i stedet for fra et helt pulver.
    1. Bruk en 20x målsetting av mikroskopet til å velge krystall av interesse.
    2. Samle Raman spektrum i et område på 100 − 3200 cm-1 ved hjelp av en 514 NM Argon-laser.
      Merk: figur 5 viser representative Spectra av kalsitt (A) og Vaterite (B). For spekteret av Aragonitt, se referanse18.
  3. Kvantifisering av massen prosentandel av tilsetningsstoffene i CaCO3 precipitates
    1. Verifisere/måle utryddelse koeffisient (ε) av tilsetningsstoff som brukes. Den utryddelse koeffisient av et protein kan gis av online servere19. Hvis utryddelse koeffisienten er ukjent, måle absorbansen av tilsetningsstoff i ulike konsentrasjoner, plotte absorbansen g. konsentrasjon og beregne utryddelse koeffisienten fra skråningen av kurven.
    2. Veie glasset stykker der krystaller dannet, fortrinnsvis bruke en mikrovekt.
    3. Skrap krystallene av glasset i 1,2 mL 0,1 M eddiksyreløsning, Vortex og sonikere prøven. Oppbevar prøven ved romtemperatur i 24 timer.
      FORSIKTIG: eddiksyre er svært farlig i tilfelle hud eller øyekontakt; forsiktig og kasser etter forskriftene.
    4. Veie glasset lysbildet etter skraping av krystaller.
    5. Mål UV/Vis absorbansen (A) spektrum av løsningen. Hvis tilsetningsstoffet er et protein, måle absorbansen ved 280 NM og beregne konsentrasjonen (C), ved hjelp av Beer-Lambert ligning:
      Equation 1
      der l er den optiske stien inne i Cuvette.
    6. Bruk konsentrasjonen (C) funnet i 2.3.5 og volumet som brukes (V = 1,2 ml) for å beregne massen (m) av tilsetningsstoffene i/på krystallene. Hvis konsentrasjonen er i mg/ml, bruk ligningen C ● V = m.
      1. Hvis konsentrasjonen er i mol/L, deretter beregne føflekker (n) søker C ● V = n. Deretter bruker du Molekylvekten (MW) til å beregne massen (m) av tilsetningsstoffene (m = n ● MW).
    7. Beregn vektprosent av tilsetningsstoffene i/på krystallene ved hjelp av ligningen: Equation 2 , hvor m er massen av tilsetningsstoffene, og Δms er massen av kalsium og andre krystaller som ble vraket av glasset Stykke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En skjematisk av den eksperimentelle satt opp er vist i figur 1. Kort, er Diffusion metoden som brukes for å danne kalsium kilt krystaller i 96-brønn plater og teste effekten av biopolymerer på morfologi og struktur av kalsium med krystaller. I disse eksperimentene deles ammonium inn i ammoniakk og CO2, som diffus i løsninger for kalsium, noe som resulterte i dannelse av kalsium-krystaller (figur 1 og figur 2).

Effekten av biopolymerer vurderes ved sammenligning av krystallene av kalsium, som dannes med og uten (kontroll) tilsetningsstoffene. Før tilsetning av tilsetningsstoffene velges den optimaliserte konsentrasjonen av kalsium, og renheten på løsningene og glasstøyet testes. Figur 2 A viser et representativt bilde av en kontroll eksperiment, der distinkte rhombohedral kalsium styr krystaller dannes. Disse krystallene er mest sannsynlig kalsitt (se figur 5). Hvis løsningene eller plast eller glass ikke har blitt skikkelig rengjort da sfærisk krystaller vil danne (figur 2B, merket med røde sirkler), i tillegg til rhombohedral kalsitt krystaller. De sfæriske krystallene er mest sannsynlig vaterite (se figur 5). En ekstra indikasjon for bruk av riktige forhold, er glatthet av kalsitt ansikter i kontroll eksperimentet. Dette kan observeres med SEM, som vist i Figur 3. Figur 3 A viser en skikkelig kontroll med glatte kalsitt ansikter, mens Figur 3B viser kalsitt krystaller med ansikter bestående av trinn. Den sfæriske krystaller her er vaterite. Kontroll krystallene må skilles og glatte, slik at effekten av tilsetningsstoffene på krystall morfologi er klar.

For å demonstrere effekten av en Biopolymer på morfologi av kalsium, har vi brukt proteinet tapas. Figur 4 viser krystallene av kalsium, som dannes i nærvær av tapas i løsningen. Krystallene er forskjellig fra kontroll krystallene. De danner en kompleks sfærisk kalsium, sammensatt av flere kalsitt microcrystals (se Raman spektrum i figur 5). En metode for å karakterisere strukturen av krystallene er Raman spektroskopi. Figur 5 viser typiske Spectra av kalsitt (figur 5A) og vaterite (figur 5B), tatt fra vellykket (A) og mislykket (B) kontroll eksperimenter. Typiske absorbansen topper20 er i størrelsesklasse 100 − 400 cm-1 (gitter moduser), en topp på ~ 710 cm-1 (symmetrisk bøying av co32-) og på ~ 1090 cm-1 (symmetrisk strekking av co3 2-). Merk delingen av Raman Skift ved ~ 1080 cm-1 som er den mest åpenbare karakteristisk for vaterite21. Referer til referanse22 for et fullt spekter av Aragonitt. Den Raman spekteret av krystaller som dannes i nærvær av tapas ligner på spekteret av kalsitt (figur 5A). I tilfeller der flere topper vises som ikke samsvarer med et enkelt spektrum av en enkelt kalsium polymorf, eller en kombinasjon av disse, kan de tilskrives et overskudd av kalsiumklorid som ikke har blitt vasket grundig i trinn 1.1.2.8.

I den siste delen av protokollen, har vi målt prosentandelen (vekt/vekt) av det organiske innholdet inne i eller på de kalsium-krystallene. Krystallene ble oppløst i eddiksyre og Biopolymer ble sluppet inn i løsningen. I tilfeller der Biopolymer har et karakteristisk absorbansen spektrum, kan konsentrasjonen i løsningen fastslås. I tilfelle av proteiner som inneholder aromatiske Sidegrupper, som i Case-studien her av tapas, brukes absorbansen ved 280 NM. Det absorbansen spekteret av tapas, målt etter oppløsning av krystallene i syre, er vist i figur 6 (grønn) sammen med spekteret av kontrollen (syre-oppløst kalsium uten tilsetning, svart). Ved hjelp av Beer-Lambert ' s lov (se trinn 2.3.5) og ved hjelp av en utryddelse koeffisient på 29 700 M-1 cm-1, har vi funnet at massen prosent av tapas var 1,8% ± 0,2%. Måle absorbansen av løsningen etter krystall oppløsningen i syre er mulig når biopolymerer ikke samlet ved lav pH. Et null signal for absorbansen av oppløsningen som inneholder tilsetningsstoffet er en indikasjon på dens aggregering. I dette tilfellet kan ulike analysemetoder, slik som termisk tyngdekraft analyse (TGA) brukes til å anslå massen av tilsetningsstoffer stede inne/på krystaller.

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk beskrivelse av rask damp diffusjon metode for dannelsen av kalsium og krystaller. Et kalsium-inneholdende løselig salt (f.eks. kalsiumklorid) er plassert i nærheten av et ammonium. Her viser vi to brønner i en 96 brønn plate. Platen er så forseglet, og ammonium som deles inn i ammoniakk og karbondioksid som diffus i kalsium-inneholder godt, noe som resulterer i utfelling av kalsium, som vises her av SEM-bildet av en kalsitt krystall). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Optiske mikroskop bilder av kalsium-krystaller. En ren kontroll inneholder det meste kalsitt, som er preget av rhombohedral krystaller (A). Når kontroll prøven inkluderer sfæriske krystaller (for eksempel de som er merket med en rød sirkel) (B), gjentar du rengjørings protokollen som foreslått i punkt 1.1.1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Scanning elektron micrographs av kalsium med krystaller som dannes i to kontroll eksperimenter. (A) et bilde av en prøve som inneholder det meste rhombohedral krystaller (kalsitt). (B) en mikroskop av en prøve med ødelagte kalsitt fasetter og sfæriske krystaller som er mest sannsynlig vaterite. I dette tilfellet må kontroll eksperimenter gjentas. Dette tallet er blitt modifisert fra Alı et al.16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : SEM-bilder av kalsitt krystaller som dannes i nærvær av et protein tapas. Skala linjer representerer henholdsvis 50 μm (A) og 10 μm (B). Dette tallet er blitt modifisert fra Alı et al.16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Raman Spectra av to polymorphs. (A) kalsitt. (B) Vaterite. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : UV/Vis absorbansen Spectra av tapas (grønn) og en buffer løsning (100 mm NaCl, 25 mm Tris pH 8,0; svart). Absorbansen ble brukt til å beregne konsentrasjonen av tapas i de kalsium-krystallene, etter at de ble oppløst i syre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden som er beskrevet her er rettet mot forming kalsium på krystaller i nærvær av organiske tilsetningsstoffer og evaluere effekten av organiske biopolymerer på morfologi og struktur av kalsium på krystaller in vitro. Metoden er basert på sammenligning av krystaller dannet i nærvær av organiske tilsetningsstoffer til kalsitt krystaller dannet i kontrollen eksperimentet. Vi har vist hvordan du bruker Diffusion metode for å danne kalsium, hvordan å karakterisere deres morfologi ved hjelp av optiske og elektron mikroskopi, hvordan å karakterisere deres struktur ved hjelp av Raman spektroskopi, og hvordan å bestemme organisk innhold (vekt/vektprosent) av krystallene.

Vi beskrev protokollen som vi har brukt til å evaluere effekten av en bakteriell ekstracellulære protein, tapas, på morfologi og struktur av kalsium, men protokollen kan bli brukt til andre polymer som er biologisk renset eller syntetisert. I tillegg til effekten av en enkelt Biopolymer, kan denne metoden brukes med blandinger av biopolymerer for å evaluere eventuelle gjensidighet mellom ulike polymerer i deres effekt på kalsium og utfelling. Vi har begrenset den eksperimentelle satt opp til en 96-brønn plate; men alle andre oppsett der løsninger for ammonium er plassert og fysisk adskilt fra kilden for de fysiske kildene (dvs. løsningene og pulveret er plassert i et forseglet fartøy), er mulig. Typiske fartøy som brukes er multi-brønn plater og et typisk konsentrasjons område på 10-50 mm brukes til et eksperimentelt oppsett med 96-brønn platene10,16,23. Et forseglet beger eller en desikator kan også brukes.

Denne metoden er enkel å bruke og den er kompatibel med lave konsentrasjoner og lave volumer av biopolymeric tilsetningsstoffer. Arbeid i en multi-brønn plate gjør at screening av flere parametre på samme tid i en multi-brønn plate eksperiment. Denne metoden kan være følsom for den relative plasseringen av kalsium-og ammonium i forhold til posisjonen til det aktuelle pulver stoffet. Derfor må det utvises forsiktighet for å alltid bruke brønner i samme posisjon i multi-brønn plate og også for å kontrollere at endring av plasseringen av brønnene ikke påvirker resultatene. Normalt, ved hjelp av en stor nok avstand mellom brønnene der eksperimentene finner sted og ammonium pulver, sikrer at resultatene er reproduserbar. I tillegg er det avgjørende å justere konsentrasjonen av CaCl2 -løsningen slik at separate krystaller dannes i kontroll eksperimentet, som beskrevet i avsnitt 1.1.2. Konsentrasjonen av tilsetningsstoffene bør også være optimalisert for å overstige en minimal konsentrasjon nedenfor som ingen effekt er observert. Merk at metoden er svært følsom for konsentrasjonen av tilsetningsstoffene; ulike tilsetnings konsentrasjoner kan indusere en annen effekt på morfologi og struktur av kalsium, krystaller24.

En stor begrensning av denne metoden er at ammoniakk og CO2 både diffus i kalsiumklorid test løsninger og derfor er det dårlig kontroll av pH gjennom eksperimentet. Som et resultat av spredningen av ammoniakk, øker pH i løsningen (når ammoniakk blir ammonium), som vist i likevekt ligninger5,6 ((NH4)2co3 (s) → 2NH3 (g) + co2 (g) + H 2 andre priser O(l), NH3 (AQ) + H2O(l) → NH4+(AQ) + oh-(AQ), ca2 +(AQ) + co2 (AQ) + 2OH-(AQ) Image 1 Caco3 (s) + H2O (l)) og det favoriserer dannelsen av kalsium. 

Sammenlignet med de ekstra metodene som er beskrevet i innledningen, er denne metoden teknisk enkel. På grunn av den langsomme nedbørs prosessen, kan krystallvekst følges i sanntid, ved hjelp av absorbansen eller spredning teknikker fra den gjennomsiktige multi-brønnteknikk. I tillegg, for å følge Kinetics av krystallveksten, kan man også undersøke krystall morfologi og struktur på ulike tidspunkt, i stedet for etter 20 timer, som utført i vår studie. Denne metoden kan utvides til å studere utfelling av andre salter av, som bærer en liten nok ksp, som magnesium, barium og kadmium karbonater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Prof. Lia Addadi, Prof Jonathan Erez, og Dr. Yael politi for fruktbart diskusjoner. Denne forskningen har blitt støttet av den israelske Science Foundation (ISF), Grant 1150/14.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Gadot 64-19-7
Ammonium carbonate Sigma-Aldrich 506-87-6
Calcium chloride dihydrate Merck KGaA 10035-04-8
Ethanol Absolute Gadot 64-17-5
Micro-Raman Renishaw inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope
Microscope Nikon Eclipse 90i model
Nis elements Br software Nikon For microscope imaging
Scanning Electron Microscope ThermoFisher Scientific FEI Sirion microscope
Spectrophotometer JASCO V-670 model
Sputter coater Polaron SC7640 model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190 (4212), 377-379 (1975).
  2. Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase. Science. 306 (5699), 1161-1164 (2004).
  3. Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. Journal of Structural Biology. 183 (2), 258-269 (2013).
  4. Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. Biomineralization: from nature to application. 12, John Wiley & Sons. (2008).
  5. Nielsen, M. H., Lee, J. R. I. Methods in Enzymology. De Yoreo, J. J. 532, Academic Press. 209-224 (2013).
  6. Page, M. G., Cölfen, H. Improved Control of CaCO3 Precipitation by Direct Carbon Dioxide Diffusion: Application in Mesocrystal Assembly. Crystal Growth & Design. 6 (8), 1915-1920 (2006).
  7. Wang, H., Huang, W., Han, Y. Diffusion-reaction compromise the polymorphs of precipitated calcium carbonate. Particuology. 11 (3), 301-308 (2013).
  8. Sedlák, M., Antonietti, M., Cölfen, H. Synthesis of a new class of double-hydrophilic block copolymers with calcium binding capacity as builders and for biomimetic structure control of minerals. Macromolecular Chemistry and Physics. 199 (2), 247-254 (1998).
  9. Kitano, Y., Park, K., Hood, D. W. Pure aragonite synthesis. Journal of Geophysical Research. 67 (12), 4873-4874 (1962).
  10. Politi, Y., Mahamid, J., Goldberg, H., Weiner, S., Addadi, L. Asprich mollusk shell protein: in vitro experiments aimed at elucidating function in CaCO3 crystallization. CrystEngComm. 9 (12), 1171-1177 (2007).
  11. Gehrke, N., Cölfen, H., Pinna, N., Antonietti, M., Nassif, N. Superstructures of Calcium Carbonate Crystals by Oriented Attachment. Crystal Growth & Design. 5 (4), 1317-1319 (2005).
  12. Rudloff, J., et al. Double-Hydrophilic Block Copolymers with Monophosphate Ester Moieties as Crystal Growth Modifiers of CaCO3. Macromolecular Chemistry and Physics. 203 (4), 627-635 (2002).
  13. Boquet, E., Boronat, A., Ramos-Cormenzana, A. Production of Calcite (Calcium Carbonate) Crystals by Soil Bacteria is a General Phenomenon. Nature. 246, 527 (1973).
  14. Cohen, A. L., McConnaughey, T. A. Geochemical Perspectives on Coral Mineralization. Reviews in Mineralogy and Geochemistry. 54 (1), 151-187 (2003).
  15. Erez, J. Vital effect on stable-isotope composition seen in foraminifera and coral skeletons. Nature. 273, 199 (1978).
  16. Azulay, D. N., et al. Biopolymers from a Bacterial Extracellular Matrix Affect the Morphology and Structure of Calcium Carbonate Crystals. Crystal Growth & Design. 18 (9), 5582-5591 (2018).
  17. Abbasi, R., et al. The Bacterial Extracellular Matrix Protein TapA Is a Two-Domain Partially Disordered Protein. ChemBioChem. , (2018).
  18. Gauldie, R. W., Sharma, S. K., Volk, E. Micro-raman spectral study of vaterite and aragonite otoliths of the coho salmon, Oncorhynchus kisutch. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 118 (3), 753-757 (1997).
  19. Gasteiger, E., et al. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer. 571-607 (2005).
  20. Gunasekaran, S., Anbalagan, G., Pandi, S. Raman and infrared spectra of carbonates of calcite structure. Journal of Raman Spectroscopy. 37 (9), 892-899 (2006).
  21. Trushina, D. B., Bukreeva, T. V., Kovalchuk, M. V., Antipina, M. N. CaCO3 vaterite microparticles for biomedical and personal care applications. Materials Science and Engineering: C. 45, 644-658 (2014).
  22. Weiss, I. M., Tuross, N., Addadi, L., Weiner, S. Mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite. Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 478-491 (2002).
  23. Yamamoto, Y., Nishimura, T., Saito, T., Kato, T. CaCO3/chitin-whisker hybrids: formation of CaCO3 crystals in chitin-based liquid-crystalline suspension. Polymer Journal. 42, 583 (2010).
  24. Magnabosco, G., et al. Insights on the interaction of calcein with calcium carbonate and its implications in biomineralization studies. CrystEngComm. 20 (30), 4221-4224 (2018).

Tags

Denne måned i JoVE biomineralization kalsium biopolymerer tapas bakteriell ekstracellulære matrise utfelling biofilm.
Kalsium skrive formasjon i nærvær av Biopolymeric tilsetningsstoffer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azulay, D. N., Chai, L. Calcium… More

Azulay, D. N., Chai, L. Calcium Carbonate Formation in the Presence of Biopolymeric Additives. J. Vis. Exp. (147), e59638, doi:10.3791/59638 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter